Détermination rapide de l’affinité anticorps-antigène par photométrie de masse

Résumé

Nous décrivons une approche à molécule unique aux mesures d’affinité d’antigène-anticorps utilisant la photométrie de masse (MP). Le protocole basé sur mp est rapide, précis, utilise une très petite quantité de matériel, et ne nécessite pas de modification des protéines.

Résumé

Les mesures de la spécificité et de l’affinité des interactions antigène-anticorps sont d’une importance cruciale pour les applications médicales et de recherche. Dans ce protocole, nous décrivons la mise en œuvre d’une nouvelle technique à molécule unique, la photométrie de masse (MP), à cette fin. MP est une technique sans étiquette et sans immobilisation qui détecte et quantifie les masses moléculaires et les populations d’anticorps et de complexes anticorps à un niveau d’une seule molécule. MP analyse l’échantillon d’antigène-anticorps en quelques minutes, permettant la détermination précise de l’affinité contraignante et fournissant simultanément des informations sur la stoichiométrie et l’état oligomérique des protéines. Il s’agit d’une technique simple et simple qui ne nécessite que des quantités picomoles de protéines et pas de consommables coûteux. La même procédure peut être utilisée pour étudier la liaison protéines-protéines pour les protéines dont la masse moléculaire est supérieure à 50 kDa. Pour les interactions protéiques multivalentes, les affinités de plusieurs sites de liaison peuvent être obtenues en une seule mesure. Cependant, le mode de mesure à molécule unique et l’absence d’étiquetage imposent certaines limites expérimentales. Cette méthode donne les meilleurs résultats lorsqu’elle est appliquée à des mesures d’affinités d’interaction sous-micromolaire, d’antigènes d’une masse moléculaire de 20 kDa ou plus, et d’échantillons de protéines relativement purs. Nous décrivons également la procédure d’exécution des étapes de montage et de calcul requises à l’aide d’un logiciel d’analyse de données de base.

Introduction

Les anticorps sont devenus des outils omniprésents de la biologie moléculaire et sont largement utilisés dans les applications médicales et de recherche. En médecine, ils sont d’une importance cruciale dans le diagnostic, mais leurs applications thérapeutiques sont également en expansion et de nouvelles thérapies à base d’anticorps sont constamment développés^1,2,3,4. Les applications scientifiques des anticorps incluent beaucoup de techniques indispensables de laboratoire telles que l’immunofluorescence^5,l’immunoprécipice^6,la cytométrie^{de flux 7,}ELISA, et le blotting occidental. Pour chacune de ces applications, l’obtention de mesures précises des propriétés contraignantes de l’anticorps, y compris l’affinité et la spécificité contraignantes, est d’une importance cruciale.

Depuis l’introduction du premier instrument commercial de résonance plasmon de surface (SPR) en 1990, les biocapteurs optiques sont devenus l’étalon-or de la caractérisation des anticorps, mais d’autres techniques, y compris l’ELISA, sont également couramment utilisées pour mesurer les affinités d’anticorps^8,9. Ces méthodes nécessitent généralement l’immobilisation ou l’étiquetage des molécules analysées, ce qui peut potentiellement affecter l’interaction d’intérêt. Ils sont également relativement lents, impliquant plusieurs étapes d’analyse avant que les résultats puissent être recueillis pour l’analyse des données. Une méthode à molécule unique récemment mise au point, la photométrie de masse (MP), détecte les molécules directement en solution lorsqu’elles atterrissent à la surface du microscope coverslip^10,11. La détection optique à base de diffusion de lumière que MP utilise ne nécessite pas d’étiquetage ou de modification des protéines. Les molécules protéiques individuelles sont enregistrées par le microscope de diffusion interférométrique comme des taches sombres apparaissant dans l’image (Figure 1D), et plusieurs milliers de molécules peuvent être détectées lors de l’acquisition de données d’une minute¹². Le signal généré par chaque particule individuelle est quantifié, et sa valeur de contraste (obscurité relative) est calculée. Les valeurs de contraste interférométriques sont proportionnelles aux masses moléculaires des protéines, ce qui permet l’identification d’espèces liées et libres dans le mélange antigène-anticorps. Dans le même temps, en comptant les événements d’atterrissage moléculaire, MP mesure directement les populations d’espèces. Cela donne aux méthodes basées sur mp une capacité unique de quantifier indépendamment les affinités de plusieurs sites de liaison.

La liaison des molécules del’antigène (Ag)aux deux sites de liaison de l’anticorps intact (Ab) peut être décrite comme :

avec l’association d’équilibre constantes K_a1 et K_{a2 définies} comme :

où c_i et f_i représentent la concentration et la fraction du composant i, respectivement. La concentration totale d’antigène( c_Ag)_tot peut être exprimée comme:

Étant donné que les concentrations totales de l’anticorps (c_Ab)_tot etantigène( c_Ag)_{tot sont} connus, cette équation peut être utilisée pour s’adapter directement aux fractions de composants expérimentaux obtenues à partir des mesures MP et calculer les constantes de l’association d’équilibre K_a1 et K_a2 (voir Information supplémentaire).

Les données MP peuvent également être utilisées pour estimer la cooperativité entre les deux sites de liaison d’anticorps¹¹. Pour deux paratopes d’anticorps avec des constantes microscopiques identiques de liaison, les facteurs statistiques décrivant le processus de population de l’Ab· Ag et Ab· Ag₂ complexes dictent que l’équilibre macroscopique apparent constantes K_a1 et K_a2 ne sera pas numériquement égal, et K_a1 = 4K_a2. Par conséquent, les valeurs expérimentales de K_a1 < 4K_a2 indiquent une cooperativité positive entre les deux sites de liaison d’anticorps. De même, K_a1 > 4K_{a2 indique} la cooperativité négative.

Les mesures mp de l’affinité de liaison antigène-anticorps sont rapides et nécessitent une petite quantité de matériel. Les distributions de masse MP utilisées pour les calculs constants d’équilibre fournissent des informations supplémentaires sur les propriétés de l’échantillon et permettent d’évaluer la pureté de l’échantillon, l’oligomérisation et l’agrégation en une seule expérience. La même méthode peut être utilisée pour mesurer la liaison protéine-protéine à haute affinité, et mp est particulièrement utile pour les études sur les interactions protéiques multi-valent. Les complexes multi-protéines ont généralement de grandes masses moléculaires, optimales pour la détection mp, et les données d’une molécule peuvent être utilisées pour mesurer la stoichiométrie et calculer les affinités de plusieurs sites de liaison simultanément. Ces informations sont généralement difficiles à obtenir à l’aide de méthodes en vrac.

Sans modifications, le protocole actuel convient aux mesures d’interactions sous-micromolaires relativement élevées avec des antigènes d’une masse moléculaire de 20 kDa ou plus. Pour des résultats optimaux, les stocks de protéines doivent être d’une grande pureté, mais il n’y a pas d’exigences spécifiques en matière de tampon. En utilisant MP, la liaison antigène-anticorps peut être évaluée en moins de cinq minutes. La collecte et l’analyse des données requises pour des calculs K_d précis peuvent être effectuées dans les 30 minutes.

Protocole

1. Préparer les chambres d’écoulement

1. Nettoyez les couvertures en verre
   1. À l’aide de bouteilles de lavage à l’eau distillée, à l’éthanol et à l’isopropanol, rincez les couvercles de 24 mm x 50 mm dans l’ordre suivant : eau, éthanol, eau, isopropanol, eau. Séchez les couvertures avec un jet d’azote propre. Il est important de rincer les coverslips de haut en bas, en tenant le coin inférieur avec des forceps à pointe molle. Séchez le coverslip dans la même direction pour éviter de transférer la contamination par les forceps (Figure 2A).
   2. De même, rincez les couvercles de 24 mm x 24 mm avec de l’eau distillée, de l’éthanol et de l’eau distillée. Séchez les couvertures avec un jet d’azote propre.
   3. Identifiez le côté de travail du coverslip, placez une goutte d’eau distillée à la surface du coverslip propre et suivez les étapes 3.1-3.2 du protocole. Habituellement, un seul côté du coverslip de 24 mm x 50 mm a la qualité optique adaptée aux mesures MP.
      REMARQUE : Après mise au point, aucune imperfection de surface significative ne doit être détectable, et la valeur « signal » indiquée dans le logiciel de collecte de données devrait être inférieure à 0,05 %(figure 1A-C). Les côtés de travail de tous les coverslips dans la boîte sont orientés dans la même direction. La même procédure doit être utilisée pour tester l’efficacité du nettoyage du coverslip.
2. Assembler la chambre d’écoulement
   1. Placez le coverslip de 24 mm x 24 mm sur un morceau de papier d’aluminium. Placez des bandes de ruban adhésif à double face sur le couvercle de 24 mm x 24 mm, comme le montre la figure 2B, et coupez le ruban le long du bord du verre. Séparez le coverslip du papier d’aluminium et fixez-le au côté de travail du coverslip de 24 mm x 50 mm (figure 2C).
      REMARQUE : La taille du chenal peut varier, mais une largeur de 3 mm à 5 mm est recommandée. Les canaux plus larges nécessitent des volumes d’échantillons plus importants et des canaux très étroits peuvent être difficiles à charger. Habituellement, deux canaux parallèles peuvent facilement être créés sur le coverslip de 24 mm x 24 mm. Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Préparer les échantillons d’anticorps-antigènes pour les mesures d’affinité

1. Filtrer au moins 2 mL du tampon PBS à l’aide de filtres à seringues de 0,22 μm pour éliminer les particules de poussière ou les agrégats. Centrifuger le stock de protéines pendant 10 minutes à la vitesse maximale de la centrifugeuse de table (environ 16 000 x g).
   REMARQUE : PBS est le tampon recommandé pour ce protocole, mais MP n’a pas d’exigences de tampon particulières, et d’autres tampons biologiques sont également acceptables. Cependant, des concentrations élevées de glycérol (>10%) et des forces ioniques très faibles (concentration de sel <10 mM) peuvent affecter l’image et la qualité des données et ne sont pas recommandées.
2. Déterminer les concentrations réelles des stocks d’anticorps et d’antigènes en mesurant leur absorption uv de 280 nm.
3. Calculer les concentrations de mesure du mélange antigène-anticorps. Si la valeur estimée de l’affinité de liaison anticorps n’est pas connue, prévoyez de préparer un échantillon avec 30 nM d’antigène et 20 nM de concentration d’anticorps. Lorsque l’affinité approximative est connue, le rapport anticorps/antigène et leurs concentrations doivent être optimisés en fonction des valeurs K_{d attendues.} Utilisez la concentration totale d’antigène dans le mélange égale à la somme du Kd attendu et la concentration totale d’anticorps dans l’équation ci-dessous. En supposant_{K d1} = K_d2 pour les deux paratopes de l’anticorps, cela se traduira par des concentrations comparables de l’anticorps libre et les complexes anticorps-antigènes dans l’échantillon.
   
   Ajuster la concentration d’anticorps pour maintenir la concentration totale de protéines dans l’échantillon dans la fourchette de 10 nM et 50 nM. Les meilleurs résultats sont obtenus à l’aide de mélanges avec des concentrations d’anticorps entre 5 nM et 25 nM.
   REMARQUE : MP détecte les protéines dont la masse moléculaire est supérieure à 40 kDa. Par conséquent, les concentrations d’échantillon d’antigènes dont la masse moléculaire est inférieure à 40 kDa peuvent dépasser la limite typique de 50 nM. Cependant, à des concentrations supérieures à environ 100 nM, même les antigènes de masse moléculaire faible pourraient affecter la qualité d’image et la précision de la déterminationde K_d.
4. Préparer 50 μL du mélange anticorps-antigène à sa concentration de mesure finale calculée à l’étape 2.3.
   REMARQUE : Un seul échantillon du mélange antigène-anticorps est nécessaire pour la détermination de K_d. Cependant, la préparation de plusieurs échantillons avec différents rapports antigène/anticorps peut aider à optimiser la concentration de l’échantillon. Si les données de plusieurs échantillons sont collectées, elles peuvent être analysées via un ajustement global.
5. Incuber le mélange antigène-anticorps pendant environ 10 min à température ambiante pour permettre à la réaction de liaison d’atteindre l’équilibre chimique. Évitez les temps d’incubation inutilement longs.
   REMARQUE : Le temps d’incubation peut varier en fonction de la cinétique contraignante. Pour confirmer que l’équilibre chimique a été atteint, les mesures de l’échantillon peuvent être répétées à différents moments d’incubation. Les valeurs K d invariantes_{dans le} temps indiquent une incubation suffisamment longue. L’incubation prolongée peut conduire à une adsorption protéique significative à la surface du laboratoire en plastique et, par conséquent, à des erreurs significatives dans la détermination de la concentration de protéines. Pour cette raison, labware à faible adhérence est fortement recommandé pour la préparation de l’échantillon MP¹³.

3. Recueillir les données de photométrie de masse

1. Appliquez une goutte d’huile d’immersion au microscope sur l’objectif de l’instrument MP et placez la chambre d’écoulement assemblée au microscope. Assurez-vous que l’huile enjambe l’écart entre le coverslip et l’objectif.
2. Chargez la chambre d’écoulement et concentrez le photomètre de masse.
   1. Déposez 10 μL d’une solution tampon propre et filtrée à une extrémité du canal de chambre d’écoulement préparée à l’étape 1. Le liquide entrera dans le canal par action capillaire.
   2. Ajustez la position Z de la scène pour concentrer le microscope sur la surface de travail du coverslip de 24 x 50 mm.
      1. Dans l’onglet Focus Control du logiciel de collecte de données, utilisez les boutons de mouvement de scène grossier de haut en bas pour effectuer les ajustements initiaux.
      2. Cliquez sur le bouton Netteté pour afficher la lecture du signal de netteté et utilisez les boutons d’ajustement haut et bas fins pour maximiser la valeur netteté.
      3. Cliquez sur les boutons Set Focus et Lock Focus pour activer la fonction de suivi de mise au point. Une image bien ciblée (figure 1A,C) devrait avoir la valeur « signal » inférieure à 0,05 %.
         REMARQUE : Si la valeur « signal » à la position maximale de netteté est supérieure à 0,05 %, cela peut indiquer des impuretés sur la surface vitrée ou dans le tampon.
3. À l’aide du même canal, chargez 20 μL de l’échantillon d’anticorps-antigène en le déposant d’un côté du canal et en buvant le liquide de l’autre extrémité avec un petit morceau de papier buvard (figure 2D).
   REMARQUE : Le volume d’un canal de 3 à 5 mm de large est d’environ 10 μL. Le volume supplémentaire de l’échantillon est recommandé pour remplacer complètement le tampon présent dans le canal et éviter la dilution de l’échantillon.
4. Après le chargement de l’échantillon, cliquez immédiatement sur le bouton Enregistrer pour démarrer la collecte de données, l’acquisition d’une vidéo de 100 s ( Figure1D).
5. À la fin de la collecte de données, entrez le nom du fichier et cliquez sur OK pour enregistrer le fichier de données.
6. Jetez les coverslips et essuyez l’huile de la lentille objective avec des écouvillons optiques de coton humides avec de l’isopropanol.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

4. Analyser les données mp

1. Traitez le fichier vidéo collecté à l’aide du logiciel de traitement des données MP pour identifier les événements d’atterrissage.
   1. Utilisez l’option Fichier/Menu ouvert pour charger le fichier pour l’analyse et cliquez sur Analyser.
   2. Cliquez sur le bouton Charge pour charger la fonction d’étalonnage et enregistrer les données analysées à l’aide de l’option Fichier/Enregistrer les résultats comme menu.
2. Adapter la distribution de masse moléculaire aux fonctions gaussiennes pour obtenir des concentrations relatives de chaque espèce dans l’échantillon. Cette analyse peut être effectuée à l’aide d’un logiciel de graphique scientifique commun (voir tableau des matériaux).
   1. Importez le fichier « eventsFitted.csv » dans le logiciel et tracez la distribution de masse moléculaire (colonne M dans le fichier .csv) à l’aide de la fonction Plot/Statistics/Histogram.
   2. Double clic sur l’histogramme pour ouvrir la fenêtre Plot Properties. Désactiver le binning automatique et sélectionner une taille de bac de 2,5 kDa. Cliquez sur les boutons Appliquer et Aller pour créer les données des centres bin et des comptes.
   3. Sélectionnez les colonnes Bin Centers and Counts et utilisez la fonction analyse/pics et le menu Baseline/Multiple Peak Fit pour adapter l’histogramme aux fonctions gaussiennes. Double clic pour indiquer les positions approximatives de pointe sur le tracé de distribution, puis cliquez sur le bouton Open NLFit.
   4. Vérifiez les casettes fixes pour les centres de pointe « xc » et définissez leurs valeurs aux masses moléculaires attendues de l’anticorps libre et des complexes d’antigènes-anticorps simples et doubles. Vérifiez l’option Partager pour les paramètres de largeur. Cliquez sur le bouton Fit. Les valeurs de hauteur maximale ajustées des composants gaussiens représentent la concentration relative de chaque espèce dans l’échantillon¹¹.
      REMARQUE : La taille du bac peut être ajustée pour optimiser la résolution de la parcelle de distribution de masse. La limite de précision mp est d’environ 1 kDa, et de plus petites tailles de bacs peuvent amplifier le bruit de la distribution, tout en ne révélant aucune information supplémentaire. De très grandes tailles de bac obscurciront les détails fins des distributions de masse.
3. Calculez la fraction de concentration de chaque espèce à l’aide de l’équation suivante :
   
   où les valeurs h_i et f_i représentent des hauteurs de pointe et des fractions de concentration de l’anticorps libre et de l’anticorps unifaté et à double limite dans l’échantillon, respectivement.

5. Calculer les valeurs constantes d’équilibre

1. Adaptez les fractions de concentration de l’espèce d’interaction calculées à l’étape 4.3 avec eq. 1 et 2 à l’aide d’un logiciel d’analyse approprié. Ici, nous démontrons une méthode pour calculer les constantes d’équilibre à l’aide d’un programme^{de feuille de calcul 14} (voir Informations complémentaires).
   1. Ouvrez la feuille de calcul « .xlsx Kd ». Dans cette feuille de travail, les valeurs cellulaires des lignes 1 à 10 en jaune peuvent être modifiées pour effectuer les calculs des constantes d’équilibre.
   2. Entrez les valeurs estiméesde K_d dans les unités nanomolaires dans les cellules B1 et B2 dans le tableau. Ces valeurs de départ seront optimisées dans la procédure d’ajustement. Si les valeurs estiméesde K_d ne sont pas connues, laissez les valeurs par défaut dans les cellules B1 et B2 inchangées.
   3. Entrez les valeurs de (c_Ab)_tot et (c_Ag)_{tot dans} les unités nanomolaires dans les cellules D2 et E2. Entrez les valeurs de fraction calculées à l’étape 4.3 dans les cellules F2, G2 et H2. Si plusieurs échantillons à différents ratios de concentration ont été mesurés, des valeurs de concentration supplémentaires obtenues pour ces échantillons peuvent être saisies dans les rangées 2 à 10.
   4. Sélectionnez la fonction de menu Données/Solver. Entrez « $B 15 $ » dans la case « Objectif fixe » et « $B $1:$B$2 » dans la case « En changeant les cellules variables : ». Sélectionnez le bouton radio Min pour l’option To: . Vérifiez la case à cocher non négative Make Unconstrained Variables et sélectionnez GRG Nonlinear comme méthode de résolution. Cliquez sur le bouton Résoudre. Les valeurs K_{d1 et} K_{d2 les mieux} adaptées seront affichées dans les cellules B1 et B2 et la somme finale des erreurs au carré dans la cellule B15.
      REMARQUE : Si la fonction Solver n’est pas active, sélectionnez Options sous le menu Fichier dans le programme feuille de calcul. Dans la catégorie Add-ins, sélectionnez l’add-in Solver sous les modules d’application inactifs et cliquez sur le bouton Go. Vérifiez la case à cocher Add-in solver et cliquez sur OK.

Figure 1 : Images de photométrie de masse. (A) Image de vue native représentative du tampon d’imagerie recueilli sur un coverslip propre et (B) sur un coverslip avec des imperfections de surface. (C) Image ratiométrique différentielle du tampon d’imagerie et (D) l’AHT· solution HT. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Préparation et chargement de la chambre d’écoulement mp. (A) Position de fixation Coverslip pour la procédure de nettoyage. (B) Alignement du coverslip de 24 x 24 mm (couche moyenne) et du ruban à double face (couche supérieure) à la surface du papier d’aluminium (couche inférieure, non montrée). Les lignes bleues pointillées montrent l’emplacement des lignes coupées. (C) Vue supérieure et latérale de la chambre d’écoulement assemblée avec deux canaux d’échantillon, et une image de la chambre d’écoulement assemblée. ( D )Procédurede chargement de l’échantillon dans un canal d’écoulement précédemment rempli de tampon. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Résultats

Nous avons précédemment examiné l’interaction de la α-thrombine humaine (HT) et de l’anticorps anti-thrombine anti-humain de souris (AHT) utilisant l’essai basé sur MP^11. Étant donné que la masse moléculaire du HT (37 kDa) est inférieure à la limite de détection de 40 kDa, la concentration maximale de l’échantillon peut dépasser la limite de concentration de 50 nM MP sans affecter négativement la résolution des distributions de masse. L’expérience a été planifiée comme...

Discussion

Le protocole basé sur la photométrie de masse décrit ici fournit une méthode rapide et précise de mesure des affinités de liaison antigène-anticorps. L’analyse mp utilise une très petite quantité de matériel, et des informations supplémentaires , y compris la stoichiométrie, l’oligomérisation et la pureté , peuvent être évaluées à partir des mêmes données (figure 5). Sans modifications, cette méthode s’applique aux mesures des constantes de dissociation d’environ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering