Identification des inhibiteurs de l’EGFR et du SRA à l’aide de Caenorhabditis elegans

Résumé

Le nématode génétiquement traitable Caenorhabditis elegans peut être utilisé comme modèle simple et peu coûteux pour la découverte de médicaments. Décrit ici est un protocole pour identifier les thérapies anticancéreux qui inhibent la signalisation en aval des protéines RAS et EGFR.

Résumé

Les changements dans la localisation de la membrane plasmique du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et de son effecteur en aval RAS ont été impliqués dans plusieurs maladies, y compris le cancer. Le nématode libre C. elegans possède une cascade de signaux MAP EGFR-RAS-ERK évolutive et fonctionnellement conservée qui est centrale pour le développement de la vulve. Gain de mutations fonctionnelles dans l’homologue RAS LET-60 et l’homologue EGFR LET-23 induisent la génération de pseudovulva ectopique non fonctionnelle visible le long de la paroi ventrale du corps de ces vers. Auparavant, il a été démontré que le phénotype multivulval (Muv) de ces vers était inhibé par de petites molécules chimiques. Nous décrivons ici un protocole d’utilisation du ver dans un test à base de liquide pour identifier les inhibiteurs qui abolissent les activités des protéines EGFR et RAS. En utilisant ce test, nous montrons que la R-fendiline, un inhibiteur indirect de K-RAS, supprime le phénotype Muv exprimé dans les vers mutants let-60(n1046) et let-23(sa62). Le test est simple, peu coûteux, ne prend pas de temps à mettre en place et peut être utilisé comme plate-forme initiale pour la découverte de thérapies anticancéreux.

Introduction

Les voies cellulaires qui régulent les événements de développement au sein des organismes sont hautement conservées chez tous les métazoaires. L’une de ces voies est la cascade de signalisation de la protéine kinase activée par le mitogène EGFR-RAS-ERK (MAPK) qui est une voie critique qui régit la prolifération, la différenciation, la migration et la survie des cellules^1,2. Les défauts de cette voie de signalisation peuvent conduire à des états pathologiques ou pathologiques tels que le cancer. Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) s’est avéré être fortement exprimé dans les tumeurs humaines, y compris 50% des carcinomes épidermoïdes oraux, et contribue au développement de tumeurs malignes^3,4,5. Alors que les mutations dans les trois isoformes RAS H-, K- et N-RAS sont des moteurs majeurs de la transformation maligne dans de multiples cancers humains. Parmi ces trois isoformes RAS, les mutations oncogènes dans K-RAS sont les plus répandues^6,7,8. Pour que l’EGFR et le RAS fonctionnent, ils doivent se localiser dans la membrane plasmique (PM). Empêcher la localisation de ces molécules dans le PM peut complètement abroger l’activité biologique de cette voie de^{signalisation 9,10}. Par conséquent, l’inhibition de la localisation de ces protéines dans le PM est une stratégie thérapeutique pour bloquer la signalisation en aval et les résultats indésirables qui en résultent. À l’aide d’un test de dépistage à haute teneur, la fendiline, un inhibiteur des canaux calciques de type L, a été identifiée comme un inhibiteur de l’activité^{K-RAS 11.} Le nanograppement de K-RAS dans la feuille interne du PM est considérablement réduit en présence de fendiline. En outre, K-RAS est redistribué de la membrane plasmique au réticulum endoplasmique (RE), à l’appareil de Golgi, aux endosomes et au cytosol. Plus important encore, la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses du pancréas, du côlon, du poumon et de l’endomètre exprimant le mutant oncogène K-RAS est bloquée par l’inhibition de la signalisation en aval par la fendiline¹¹. Ces données suggèrent que la fendiline fonctionne comme un traitement anticancéreux K-RAS spécifique qui provoque la mauvaise localisation de la protéine RAS dans le PM.

Le nématode Caenorhabditis elegans a fait l’objet d’études approfondies dans le contexte du développement. De nombreuses voies de signalisation qui régissent le développement du ver sont évolutives et fonctionnellement conservées. Par exemple, l’activation de RAS médiée par l’EGFR et l’activation ultérieure de la cascade de signaux ERK MAPK sont conservées dans le ver¹². La cascade est représentée par les protéines suivantes : LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 est homologue à RAS, tandis que LET-23 est homologue à EGFR. Chez le ver, cette voie régule le développement de la vulve¹³. La vulve est une ouverture épithéliale sur la paroi ventrale du corps du ver qui permet la ponte d’œufs fécondés. La formation de la vulve dans le ver dépend de l’exposition des cellules précurseurs vulvaires (VPC) à un gradient d’activation de la cascade de signaux EGFR-RAS-MAPK. Au cours du développement normal, les VPC proximaux reçoivent des signaux forts des cellules d’ancrage gonadique pour se différencier en destins cellulaires de 1° et 2° qui donnent lieu à une vulve fonctionnelle^12. Alors que les VPC distaux se différencient en destins cellulaires à 3° qui fusionnent avec le syncytium hypodermique et ne forment pas de vulve en raison de l’épuisement de la signalisation. En l’absence de signalisation, tous les VPC se différencient en destins cellulaires à 3°, ce qui entraîne la formation d’aucune vulve. Cependant, la signalisation constitutive conduit à la formation d’une ou plusieurs vulves non fonctionnelles en raison de l’induction de tous les VPC pour supposer des destins cellulaires de 1° et 2°.

Des mutations qui provoquent une induction vulvaire défectueuse ou excessive ont été identifiées pour de nombreux gènes qui codent pour les protéines représentant cette voie. Une induction vulvaire défectueuse entraîne un phénotype sans vulve (Vul), tandis qu’une induction vulvaire excessive entraîne un phénotype multivulve (Muv) qui est représenté par le développement de nombreuses pseudovulvaes ectopiques non fonctionnelles dans toute la paroi ventrale du corps. Le phénotype Muv exprimé par la souche let-60(n1046) est dû à un gain de mutation fonctionnelle dans RAS, tandis que dans la souche let-23(sa62) il est dû à une mutation activatrice dans EGFR^14,15. Il a été démontré que le phénotype Muv fort dans ces souches mutantes est perturbé par des interventions pharmacologiques, comme l’a démontré le traitement des vers let-60 (n1046) avec l’inhibiteur MEK-1 U0126^16,17. Fait intéressant, nous avons montré que la R-fendiline et les inhibiteurs qui affectent le métabolisme de la sphingomyéline suppriment le phénotype Muv dans le ver¹⁸. Pour démontrer que ces inhibiteurs bloquent la signalisation let-60 au niveau du RAS, la souche nulle lin-1 a été utilisée¹⁷. Lin-1 est un facteur de transcription inhibiteur de type Ets qui fonctionne comme un répresseur dans le développement de la vulve¹⁹. Une forte réversion du phénotype Muv chez les vers let-60(n1046) et aucun effet sur les vers nuls lin-1 suggèrent que ces inhibitions se produisent au niveau du RAS.

Dans ce protocole, nous démontrons l’utilisation de C. elegans comme modèle pour identifier les inhibiteurs des protéines RAS et EGFR. À l’aide d’un test à base de liquide, nous démontrons les effets inhibiteurs de la R-fendiline en supprimant les phénotypes Muv dans les souches mutantes let-60(n1046) et let-23(sa62) de C. elegans. Ce test valide l’utilisation de C. elegans comme outil dans la phase initiale de la découverte de médicaments pour les thérapies anticancéreux.

Protocole

1. Préparation de plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM)

1. Ajouter 2,5 g de peptone et 3 g de NaCl à 970 mL d’eau désionisée contenue dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L. Remuer le contenu à l’aide d’une barre d’agitation magnétique. Par la suite, ajouter 20 g de gélose à la fiole. Autoclaver le contenu de la fiole à 121 °C et une pression de 15 lb/po² pendant 30 min. Après la stérilisation, placer la fiole sur une plaque d’agitation et laisser refroidir le milieu jusqu’à ce que la température atteigne 50 °C.
2. Pour préparer les plaques NGM, ajoutez les réactifs suivants au milieu refroidi : 25 mL de tampon phosphate de potassium 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 M_MgSO4,1 mL de 1 M CaCl_2,1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans l’éthanol à 95 %), 1 mL de nystatine (10 % v/p dans l’éthanol) et 1 mL de streptomycine 25 mg/mL.
3. Sous un écoulement laminaire, verser le milieu refroidi dans des boîtes de Petri stériles de 60 mm x 15 mm. Laissez les plaques se solidifier pendant 2 h. Ces plaques peuvent être conservées pendant 1 mois à 4 °C.

2. Propagation de C. elegans

1. Repérez 100 μL d’E. coli OP50 cultivé pendant la nuit sur le centre de chaque plaque NGM et laissez les plaques sécher pendant 24 h dans une hotte laminaire. Par la suite, les plaques peuvent être stockées dans un récipient en polystyrène.
   REMARQUE: La culture E. coli OP50 est cultivée dans des milieux Luria-Bertani (LB) à 37 ° C avant l’ensemencement des plaques. La culture peut être conservée à 4 °C pendant 1 à 2 mois et utilisée pour l’ensemencement périodique des plaques.
2. À l’aide d’un pic à ver stérile, rassemblez 10 à 12 vers adultes gravides d’une plaque précédemment cultivée sous un microscope à dissection. Transférer ces vers dans une plaque de NGM fraîche ensemencée avec E. coli OP50 et incuber la plaque pendant 24 h à 20 °C.
3. Après 24 h, à l’aide d’un déché à vis stérile, retirez les vers adultes des plaques. Incuber les plaques à 20 °C pendant ~ 3 jours. Les embryons se développeront en vers adultes gravides.

3. Préparation d’une culture synchrone de C. elegans

1. Recueillir les vers adultes gravides dans un tube conique de 15 mL en lavant 2 à 4 plaques avec du M9W.
   1. Préparation de M9W : Dissoudre 5 g de NaCl, 6 g de Na₂HPO₄et 3 g de KH₂PO₄ dans de l’eau désionisée dans un volume final de 1 L. Autoclaver la solution à 121 °C à une pression de 15 lb/po² pendant 30 min. Ajouter 1 mL de 1 M MgSO4 à la solution refroidie.
2. Aruffez les vers en centrifugant le tube à 450 x g pendant 1 min. Décantez le surnageant sans déranger la pastille de ver.
3. Préparer la solution de lyse des vers en combinant 400 μL d’hypochlorite de sodium à 8,25 % (eau de Javel domestique) et 100 μL de NaOH à 5 N. Ajoutez cette solution à la pastille de ver et faites glisser le tube pour mélanger le contenu du tube. Empêchez le surbleachage des embryons dans le tube en observant la lyse des vers sous un microscope disséquant.
4. Ajouter 10 mL de M9W au tube conique pour diluer le mélange de lyse lorsque 70% des vers adultes se sont lysés.
5. Centrifuger le tube à 450 x g pendant 1 min. Remplacez le surnageant par 10 mL de M9W.
6. Répétez l’étape 3.5 deux fois.
7. Après avoir terminé les étapes de lavage, ajoutez 3 à 5 mL de M9W pour ressuspender la pastille d’œuf. Faites pivoter le tube pendant la nuit à une vitesse de 18 tr/min sur un rotateur à tube à température ambiante (RT).
8. Après une incubation de nuit, retirez le tube du rotateur, a granulez les larves L1 en centrifugant le tube à 450 x g pendant 1 min. Aspirer le M9W jusqu’à ce qu’il reste 250 μL dans le tube.
9. Secouez le tube pour ressuspender les larves. Ajouter trois gouttes de 5 μL contenant les larves sur un couvercle de boîte de Pétri. À l’aide d’un microscope à dissection, comptez le nombre de vers dans chaque goutte et déterminez le nombre de vers dans 1 μL.

4. Préparation des tests de médicaments

REMARQUE : Les étapes de ce test sont illustrées à la figure 1.

1. Faire pousser 30 mL d’E. coli OP50 dans un tube conique de 50 mL à 37 °C pendant la nuit dans un agitateur orbital à 150 tr/min.
2. Faire tourner pendant la nuit la culture d’E. coli OP50 à 4 000 x g pendant 10 min pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et ressuspender la pastille dans 3 mL de M9W pour concentrer la culture.
3. Avant de préparer les solutions de travail pour le dosage du médicament, ajouter 0,1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans de l’éthanol à 95 %) dans 100 mL de M9W.
4. Préparer des solutions de travail de chaque médicament expérimental en diluant chaque médicament plus véhicule (sulfoxyde de diméthyle; DMSO) dans 4,8 mL de M9W complété par du cholestérol pour obtenir les concentrations appropriées. Dissoudre le DMSO dans 4,8 mL de M9W complété par du cholestérol pour préparer le contrôle du véhicule.
5. Ajouter 200 μL de culture concentrée d’E. coli OP50 à chaque tube contenant le témoin du véhicule ou des médicaments et des tubes vortex pour s’assurer qu’ils sont mélangés.
6. Pour effectuer l’expérience, ajoutez 2 mL de chaque solution médicamenteuse ou témoin de véhicule à chaque puits dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits. Testez chaque concentration de médicament et le contrôle du véhicule en double.
7. Ajouter environ 100 larves de L1 par puits (voir les étapes de culture synchrone de C. elegans) à l’aide d’une micropipette stérile. Limitez le volume de vers à 10 μL.
8. Incuber les plaques à 20 °C.
9. Complétez les puits avec 50 μL de 10x concentré E. coli OP50 au jour 3 du test si nécessaire.

5. Préparation du tampon d’agarose pour la microscopie

1. Préparer une solution d’agarose à 2 % p/v en dissolvant 0,1 g d’agarose dans 5 mL d’eau désionisée. Chauffer le contenu dans un micro-ondes pour dissoudre l’agarose. 20 lames peuvent être préparées à partir de 5 mL de solution d’agarose.
2. Placez des bandes de ruban adhésif de laboratoire le long de deux lames de verre. Le ruban agira comme des entretoises limitant l’épaisseur des tampons d’agarose. Par la suite, placez une troisième glissière en verre propre entre les glissières scotchées.
3. Pour faire un tampon d’agarose, repérez 100 μL d’agarose fondu sur le centre de la lame propre. Placez une autre glissière en verre propre sur et sur le dessus de l’agarose et appuyez doucement vers le bas pour former un tampon. Retirez la glissière supérieure lorsque le tampon s’est solidifié.

6. Observation du phénotype Muv dans les souches let-60, let-23 et lin-1

REMARQUE: Seuls les médicaments candidats qui suppriment les phénotypes Muv dans les souches let-23 et let-60 seront analysés à l’aide de la souche lin-1 pour déterminer si l’inhibition se produit au niveau de RAS ou EGFR.

1. Lorsque le stade approprié du cycle de vie est atteint (3 jours pour les souches let-60 et let-23, 5 jours pour la souche lin-1), retirez les plaques de l’incubateur. et recueillir les vers dans des tubes coniques de 15 mL à l’aide d’une pipette.
2. Centrifuger les tubes à 450 x g pendant 1 min. Retirer M9W sans déranger la pastille de ver et ajouter 5 mL de M9W frais.
3. Répétez l’étape 6.2 deux fois.
4. Sans déranger la pastille de ver, retirez tout le M9W restant par aspiration. Par la suite, ajouter 500 μL d’azide de sodium de 2 mM ou de chlorhydrate de tétramisole de 2 mM. Laisser les tubes incuber à RT pendant 15 min. 2 mM d’azide de sodium ou 2 mM de chlorhydrate de tétramisole anesthésieront les vers pour l’imagerie.
   ATTENTION : Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle (EPI) lorsque vous manipulez de l’azode de sodium. La solution doit être préparée sous une hotte chimique.
5. Ajouter 10 μL de la suspension anesthésisée du ver sur le centre d’un tampon d’agarose. Placez doucement un couvercle #1,5 sur la suspension du ver. Si nécessaire, fixez le couvercle avec du vernis à ongles pour éviter le dessèchement.
6. Utilisez un microscope DIC pour observer les souches let-60(n1046), let-23(sa62) et lin-1(sy254). Imagez les vers aux grossissements 10x et 20x.
7. Pour let-60(n1046) et let-23(sa62), notez les vers adultes en fonction de la présence ou de l’absence du phénotype Muv. Alors que pour la souche lin-1, comptez le nombre de VPC qui ont adopté des destins cellulaires de 1° ou 2° sur la face ventrale des larves L4 à l’aide d’un microscope DIC haute résolution.
8. Après avoir noté les micrographies pour chaque souche et traitement médicamenteux, effectuez le test t-de Student pour déterminer les différences statistiques entre les traitements.

Résultats

Nous démontrons d’abord que la R-fendiline est capable de supprimer le phénotype Muv dans la souche mutante let-60(n1046) par rapport aux vers traités par DMSO. Nos données montrent que la R-fendiline est capable de bloquer le phénotype Muv dans le let-60(n1046) de manière dose-dépendante(Figure 2A,B). Cependant, une non-inversion du phénotype Muv a été observée dans la souche mutante nulle lin-1 en réponse à l’augmentation des con...

Discussion

Les tests que nous décrivons à l’aide du ver sont simples et peu coûteux pour identifier les inhibiteurs de la fonction EGFR et RAS. C. elegans est un modèle attrayant pour la découverte de médicaments car il est facile à cultiver en laboratoire en raison du cycle de vie court (3 jours à 20 ° C) et de la capacité de générer un grand nombre de larves. Plus important encore, la voie EGFR-RAS-ERK MAPK est conservée de manière évolutionnaire et fonctionnelle avec des mammifères fournissant un syst?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide	Millipore Sigma	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite			Bleach
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride	Millipore Sigma	L9756
UO126 (MEK inhibitor)	Millipore Sigma	19-147
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC