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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole actuel décrit une méthode d’isolement de l’ADN à partir d’échantillons de sang et de biopsies intestinales, la génération de bibliothèques de PCR TCRβ et IGH pour le séquençage de nouvelle génération, la performance d’une exécution NGS et l’analyse de données de base.

Résumé

La mémoire immunologique, caractéristique de l’immunité adaptative, est orchestrée par les lymphocytes T et B. Dans la circulation et les différents organes, il y a des milliards de clones uniques de cellules T et B, et chacun d’eux peut lier un antigène spécifique, menant à la prolifération, à la différenciation et/ou à la sécrétion de cytokine. La grande hétérogénéité des lymphocytes T et B est générée par la recombinaison aléatoire de différents segments génétiques. Les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), développées au cours de la dernière décennie, permettent une vue approfondie sans précédent du répertoire immunitaire des récepteurs des cellules T et B. Les études dans de diverses conditions inflammatoires, immunodéficits, infections et malignités ont démontré des changements marqués dans la clonalité, l’utilisation de gène, et les propriétés biophysiques du répertoire immunitaire, fournissant des informations importantes au sujet du rôle des immuno-réponses adaptatives dans différents désordres.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour ngs du répertoire immunitaire des cellules T et B du sang et des tissus. Nous présentons un pipeline partant de l’isolement de l’ADN à travers la préparation de la bibliothèque, le séquençage sur séquenceur NGS et se terminant par des analyses de base. Cette méthode permet l’exploration de cellules T et B spécifiques au niveau des nucléotides ou des acides aminés, et peut ainsi identifier des changements dynamiques dans les populations de lymphocytes et les paramètres de diversité dans différentes maladies. Cette technique entre lentement dans la pratique clinique et a le potentiel d’identifier de nouveaux biomarqueurs, la stratification des risques et la médecine de précision.

Introduction

Le système immunitaire adaptatif, composé des lymphocytes de T et de B, utilise la mémoire immunologique pour identifier un antigène précédemment produit et lancer une réponse rapide. Les lymphocytes sont générés dans la moelle osseuse et mûrissent dans le thymus (lymphocytes T) ou la moelle osseuse (lymphocytes B). Le récepteur des lymphocytes T (TCR) et le récepteur des lymphocytes B (BCR) présentent des configurations uniques qui permettent la reconnaissance d’antigènes spécifiques. En homéostasie, les cellules T et B circulent constamment et enquêtent sur les billions de peptides différents présentés sur les cellules présentatrices d’antigènes. La ligature TCR ou BCR d’un antigène spécifique avec une forte affinité, ainsi qu’une costimulation appropriée, conduit à l’activation cellulaire, entraînant la sécrétion de cytokines, l’expansion clonale et la génération d’anticorps, dans le cas des cellules B.

L’énorme éventail des différents lymphocytes T ou B est collectivement appelé répertoire immunitaire, permettant la reconnaissance d’innombrables épitopes différents. Afin de générer un répertoire aussi vaste, un processus complexe d’assemblage aléatoire de différents segments de gènes a lieu, créant des combinaisons presque infinies de récepteurs qui peuvent lier des antigènes uniques1. Ce processus, appelé recombinaison V(D)J, comprend des réarrangements de différentes variables (V), diversités (D) et gènes de jonction (J), accompagnés de délétions aléatoires et d’insertions de nucléotides dans les jonctions2.

L’architecture du système immunitaire adaptatif intéresse les scientifiques dans différents domaines depuis de nombreuses décennies. Dans le passé, l’ordonnancement de Sanger, le spectratyping déterminant complémentaire de la région 3 (CDR3), et la cytométrie d’écoulement ont été utilisés pour caractériser le répertoire immunisé, mais ont fourni la basse résolution. Au cours de la dernière décennie, les progrès réalisés dans les méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont permis de mieux comprendre les caractéristiques et la composition des répertoires TCR et BCR d’un individu3,4. Ces systèmes à haut débit (HTS) séquencent et traitent des millions de produits TCR ou BCR réarrangés simultanément et permettent une analyse à haute résolution de cellules T et B spécifiques au niveau des nucléotides ou des acides aminés. Ngs fournit une nouvelle stratégie pour étudier le répertoire immunitaire dans la santé et la maladie. Les études utilisant HTS ont démontré des répertoires altérés de TCR et de BCR dans les maladies autoimmunes5,les immunodéficits primaires6,7,et les malignités, telles que dans la leucémie myéloïde aiguë8. En utilisant NGS, nous et d’autres avons montré l’expansion oligoclonale de clones spécifiques de cellules T et B, dans les patients présentant la maladie intestinale inflammatoire (MII), y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn9,10,11,12,13,14. De façon générale, les études de différents domaines suggèrent que les changements du répertoire aient un rôle crucial dans la pathogenèse des troubles à médiation immunitaire.

Le protocole actuel décrit une méthode d’isolement de l’ADN à partir de biopsies intestinales et de sang, la génération de bibliothèques de PCR TCRβ et IGH pour ngs, et la performance de l’exécution de séquençage. Nous fournissons également des étapes de base dans l’analyse des données du répertoire immunitaire. Ce protocole peut également être appliqué pour la génération de bibliothèques TCRα, TCRγ et IGL. La méthode est également compatible avec d’autres organes (p. ex. ganglions lymphatiques, tumeurs, liquide synovial, tissu adipeux, etc.) tant que des protocoles de digestion spécifiques aux tissus sont utilisés.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel du Centre médical sheba, et le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les sujets participants.

1. Isolement et quantification de l’ADN

  1. Digestion et lyse cellulaire des biopsies intestinales
    1. Récupérer les biopsies intestinales, soit fraîchement collectées, soit celles conservées à -20 °C ou -80 °C. Si vous utilisez des biopsies congelées, décongelez sur la glace.
    2. Ajouter 600 μL de solution de nucléilyse à un tube de micro-centrifugation stérile de 1,7 mL, réfrigéré sur de la glace.
    3. Placer la biopsie dans un tube de microcentrifugation avec une solution de lyse et incuber à 65 °C pendant 15-30 min.
    4. Ajouter 17,5 μL de 20 mg/mL de protéinase K et incuber pendant une nuit à 55 °C, en secouant doucement.
    5. Laisser refroidir l’échantillon à température ambiante pendant 5 min avant de passer à l’étape 1.3.
  2. Lyse cellulaire du sang total
    1. Obtenir 3 mL de sang total dans un tube contenant de l’EDTA, de l’héparine ou du citrate.
    2. Lysoulez le tube jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé et transférez le sang dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL contenant 9 mL de solution de lyse cellulaire. Inverser plusieurs fois au cours d’une période d’incubation de 10 minutes à température ambiante.
    3. Centrifuger à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante, puis jeter autant de surnageant que possible sans perturber la pastille blanche visible. Il restera environ 50 à 100 μL de liquide résiduel.
    4. Tube de vortex vigoureusement pendant 15 s jusqu’à ce qu’il soit complètement ressuscité. Ajouter 3 mL de solution de lyse des noyaux et piper plusieurs fois. La solution devrait devenir visqueuse.
  3. Précipitation des protéines
    1. Ajouter 200 μL de tampon de précipitation de protéines dans le tissu ou 1 mL dans le sang. Vortex vigoureusement pendant 20 s et incuber sur la glace pendant 5 min. De petites touffes de protéines peuvent être visibles après le vortex.
    2. Centrifuger à 16 000 x g pendant 4 min. Une pastille serrée contenant des protéines précipitées devrait se former.
    3. Transférer soigneusement le surnageant, sans déranger la pastille, dans un nouveau tube de 1,7 mL.
      REMARQUE: Si la pastille n’est pas serrée, envisager une autre centrifugeuse à 16 000 x g pendant 4 min.
  4. Précipitation et réhydratation de l’ADN
    1. Ajouter 1 mL de 2-propanol au tube contenant le surnageant et mélanger doucement en inversant. L’ADN devrait devenir visible sous forme de substance flottante blanche.
    2. Centrifuger à 16 000 x g pendant 1 min. Retirez complètement le surnageant à l’aide d’une pipette.
    3. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % fraîchement préparé et inverser le tube plusieurs fois. Centrifuger à 16 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant.
    4. Répétez l’étape 1.4.3.
    5. Placez le tube ouvert inversé sur du papier absorbant propre pendant 10-15 min. Ré-inverser le tube et confirmer l’hydratation complète. Si nécessaire, laisser sécher à l’air pendant 10-15 minutes supplémentaires.
      REMARQUE: Il est crucial que les granulés sèchent complètement.
    6. Ajouter 50 μL d’eau ultra-pure (UPW). Si nécessaire, l’ADN peut être dilué davantage après quantification.
    7. Incuber pendant 1 h sur bloc thermique à 65 °C, pour la réhydratation de l’ADN.
  5. Quantification de l’ADN
    NOTA : L’ADN a été quantifié à l’aide d’un fluoromètre et de réactifs désignés, comme il est précisé dans le tableau des matériaux.
    1. Amener les normes à température ambiante et préparer la trousse, y compris les tubes désignés de 0,5 mL.
    2. Préparer le tampon et le mélange de colorants dans un tube de 15 mL, selon le nombre d’échantillons. Ajouter 200 μL de tampon et 1 μL de colorant par échantillon. Inclure 2 échantillons pour les normes. Il est recommandé de calculer un échantillon supplémentaire afin d’éviter que la mémoire tampon ne soit pas suffisante.
      1. Pour les 2 étalons, placer 190 μL du mélange préparé ci-dessus dans un tube de 0,5 mL. Ajouter 10 μL de la norme.
      2. Pour chaque échantillon, placer 199 μL du mélange préparé ci-dessus dans un tube de 0,5 mL. Ajouter 1 μL de l’ADN.
    3. Lisez les exemples. Le résultat indique la concentration d’ADN de l’échantillon.
    4. Si les échantillons sont au-dessus de la limite, diluer l’ADN 1:10 avec UPW, et répéter la lecture.

2. Préparation de la bibliothèque

REMARQUE: Le protocole actuel utilise un kit d’analyse multiplex basé sur pcr compatible avec les séquenceurs NGS. Le kit contient 24 indices différents ciblant chacun les régions conservées dans les régionsV β et Jβ. Cela permet une réaction pcr en une seule étape et la mise en commun de différents échantillons. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails.

  1. Préparer des échantillons d’ADN. Obtenir 150 ng d’ADN et ajouter de l’UPW pour un total de 5 μL.
    REMARQUE : Il est possible d’utiliser moins de 150 ng d’ADN pour la préparation de la bibliothèque, avec une concentration minimale de 10 ng/μL.
  2. Placez les pipettes et les pointes dans le capot avec la lumière UV pendant 15 min pour décomposer l’ADN résiduel. Pendant ce temps, laissez différents tubes index (pour la préparation de la bibliothèque) et l’ADN polymérase dégeler sur la glace.
  3. Dans une hotte biologique, ajouter 45 μL des différents tubes index dans des tubes PCR. Ensuite, ajouter 0,2 μL de l’ADN polymérase et les 5 μL d’ADN préparés à l’étape 2.1 dans des tubes PCR.
  4. Exécutez la réaction PCR à l’aide d’un programme prédéfini, conformément aux instructions du fabricant.

3. Purification et quantification des amplicons

  1. Utilisez des billes magnétiques pour éliminer les amorces, les nucléotides et les enzymes en excès.
    1. Réchauffer les perles au moins 30 min à température ambiante. Préparer suffisamment d’éthanol frais à 80 % pour 400 μL par échantillon.
    2. Ajouter 50 μL (IGH) ou 35 μL (TCRβ) des billes à chaque tube pcr et mélanger par pipetage 10 fois. Incuber 10 min à température ambiante.
    3. Placez l’échantillon mélangé sur le support magnétique pendant 5 min.
    4. Aspirer 95 μL (ISFH) ou 80 μL (TCRβ) du liquide clair et jeter. Aspirer le liquide restant à l’aide d’une pointe de 10 μL.
    5. Ajouter 200 μL d’éthanol à 80 % à chaque échantillon. Incuber 30 s. Aspirer 195 μL d’éthanol et jeter. Aspirer le liquide restant à l’aide d’une pointe de 10 μL.
    6. Répétez l’étape 3.1.5. Ouvrez les bouchons des tubes et laissez sécher à l’air pendant 5 min.
    7. Immédiatement après les 5 min, retirer du support magnétique et ajouter 25 μL de tampon d’élution (10 mM Tris-HCl, pH 8,0). Mélanger par pipetage jusqu’à ce qu’il soit homogène. Incuber à température ambiante pendant 2 min.
    8. Placez les tubes sur le support magnétique pendant 5 min. Transférer 22 μL dans un nouveau tube PCR. Mesurer la concentration d’ADN (étape 1.5).
  2. Quantification des amplicons
    REMARQUE: Le protocole actuel utilise une machine d’électrophorèse automatisée pour le contrôle de la qualité de la concentration, de la taille et de l’intégrité de l’ADN. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails.
    1. Placer les réactifs et le bande de tamise à température ambiante pendant au moins 30 min.
    2. Dans un nouveau tube micro-centrifuge de 1,7 mL, effectuer une dilution de 1 ng/μL des échantillons d’ADN quantifiés à l’étape 3.1.8 avec UPW pour un volume total d’au moins 3 μL.
    3. Vortex dilué ADN avant utilisation. Placez 2 μL de tampon, ainsi que 2 μL d’ADN dilué dans les bandes de PCR spécialisées pré-étiquetées (fournies dans la trousse) et placez les bouchons. Placer sur shaker pendant 1 min, suivi d’une rotation vers le bas des bandes de PCR.
      REMARQUE: En raison de la viscosité du tampon, assurez-vous que l’excès de tampon est retiré de la pointe avant le transfert dans les tubes de l’échantillon.
    4. Placez dans la machine, la bande d’écran et les bandes PCR sans les bouchons. Ouvrez le couvercle de la boîte de pointe à l’intérieur de la machine. Attribuez le poste avec les étiquettes appropriées. Démarrez la machine.
      Remarque : L’histogramme de sortie doit être un pic unique à la taille souhaitée des amplicons(Figure 1A). Dans les échantillons de mauvaise qualité, des pics supplémentaires seront observés(figure 1B),indiquant un mauvais nettoyage des billes ou la formation de dimères d’amorce.

4. Séquençage de nouvelle génération

  1. Quantification et mise en commun de la bibliothèque
    1. Calculer la concentration finale d’ADN en nM, en utilisant la valeur de l’ADN de l’étape 3.1.8, et la taille en paires de bases (bp) du pic du produit, obtenue à partir des résultats de la machine d’électrophorèse (voir figure 1).
    2. Pour chaque échantillon, calculer le volume d’ADN à prélever pour une concentration finale de 4 nM, dans un volume final de tampon d’élution de 10 à 20 μL.
    3. Préparer un nouveau mélange de dilution pour chaque échantillon et en prélever 2 μL dans un nouveau mélange en piscine.
      Remarque : Pour les échantillons qui ont moins de 4 nM, ajoutez la quantité maximale d’échantillon possible.
  2. Exécution ngs de la bibliothèque
    Remarque : le protocole actuel utilise une plate-forme séquenceur de paillan. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails.
    1. Préparer une solution fraîche de NaOH 0,2 N. Ajouter 10 μL de NaOH de 0,2 N à la bibliothèque diluée préparée à l’étape 4.1.3. Ajouter 5% de PhiX au tube et au vortex brièvement. Faites tourner le tube vers le bas pour vous assurer que toute la solution s’est déposée au fond du tube.
    2. Incuber pendant 5 min à température ambiante pour dénaturer l’ADN double brin. Ajouter brièvement 980 μL de tampon pré-refroidi du kit au tube contenant de l’ADN et du vortex.
    3. Placez la bibliothèque diluée sur de la glace et préparez la bibliothèque comme suit. Pour un mélange de 17 pM, ajouter 425 μL d’ADN à partir de l’étape 4.2.2 et 575 μL de tampon. Inversez la bibliothèque plusieurs fois et tournez vers le bas. Chargez 600 μL de la bibliothèque finale sur la cartouche désignée et placez les échantillons dans la machine.
    4. Démarrez l’exécution en suivant les instructions du logiciel.

5. Analyse du séquençage

  1. Téléchargez les métriques de séquençage à partir du séquenceur et vérifiez que les données de séquençage se trouvent dans les plages suivantes (spécifiques au kit utilisé dans le protocole actuel). Les échantillons qui ne répondent pas à ces critères sont sujets à une répétition :
    Densité de cluster (densité (K / mm2):945K - 1800K
    Pourcentage de lectures passant le filtre (Clusters PF (%)) : >90 %
    Scores de qualité (%>=Q30) : >85 %
    Alignement PhiX (aligné %): 1,5% - 10%
    Taux d’erreur PhiX (%): <1,0%

Résultats

Ci-dessus, nous décrivons une méthode pour l’isolement d’ADN du tissu intestinal et du sang, la préparation des bibliothèques pour NGS, et les étapes de base d’une exécution de séquençage pour le séquençage du répertoire immunitaire. La course générera des fichiers fastq, qui peuvent être convertis en fichiers fasta pour une utilisation dans la plate-forme internationale ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST. Ce HTS réalise et gère de nombreuses analyses de dizaines de milliers de séquences TCRβ et ...

Discussion

Des changements dans l’abondance et la fonction des lymphocytes B et T sont souvent rencontrés dans différentes malignités18, troubles inflammatoires chroniques (par exemple, colite ulcéreuse et polyarthrite rhumatoïde)10,19, et dans diverses immunodéficiences17,20. La méthode actuelle utilise NGS pour faciliter une vue approfondie des répertoires de TCR et de BCR, permet...

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

aucun.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-propanolSigmaI9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubesAxygen8187631104051
15 mL centrifuge tubesGreiner188261
Absolute ethanolMerck1.08543.0250
Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881
Heat blockBioerNot applicable
High Sensitivity D1000 Sample BufferAgilent5067-5603For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kitInvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq SequencerIlluminaSY-410-1003
PCR strips4titude4ti-0792
Proteinase KInvitrogenEO0491
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33226
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
ShakerBiosanNot applicable
Tapestation 2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
ultra pure waterBio-lab7501
Wizard DNA isolation kitPromegaA1120Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

Références

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