Utilisation de l’analyse d’image informatisation pour améliorer la quantification des métastases pulmonaires dans le modèle 4T1 du cancer du sein

Résumé

Nous décrivons une méthode plus cohérente et expéditieuse pour quantifier la métastase pulmonaire dans le modèle de cancer du sein 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ.

Résumé

Le cancer du sein est une malignité dévastatrice, représentant 40 000 décès de femmes et 30 % des nouveaux diagnostics de cancer féminin aux États-Unis pour la seule année 2019. La principale cause de décès liés au cancer du sein est la charge métastatique. Par conséquent, les modèles précliniques pour le cancer du sein doivent analyser le fardeau métastatique pour être médicalement pertinents. Le modèle de cancer du sein 4T1 fournit un modèle de souris spontanément métastasante et quantifiable pour le cancer du sein humain de stade IV. Cependant, la plupart des protocoles 4T1 quantifient la charge métastatique en comptant manuellement les colonies tachées sur les plaques de culture tissulaire. Bien que cela soit suffisant pour les tissus ayant une charge métastatique inférieure, l’erreur humaine dans le comptage manuel provoque des résultats incohérents et variables lorsque les plaques sont confluentes et difficiles à compter. Cette méthode offre une solution informatique à l’erreur de comptage humain. Ici, nous évaluons le protocole à l’aide du poumon, un tissu hautement métastatique dans le modèle 4T1. Des images de plaques tachées de méthylène sont acquises et téléchargées pour analyse dans Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ détermine ensuite le pourcentage de la zone sélectionnée de l’image bleue, représentant le pourcentage de la plaque avec charge métastatique. Cette approche informatisée offre des résultats plus cohérents et rapides que le comptage manuel ou l’évaluation histopathologique pour les tissus hautement métastatiques. La cohérence des résultats fiji-imagej dépend de la qualité de l’image. De légères variations de résultats entre les images peuvent se produire, il est donc recommandé que plusieurs images soient prises et que les résultats soient en moyenne. Malgré ses limites minimales, cette méthode est une amélioration de la quantification du fardeau métastatique dans le poumon en offrant des résultats cohérents et rapides.

Introduction

Une femme sur huit recevra un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie, et pourtant, malgré de multiples options de traitement, le cancer du sein est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmes^{américaines 1}. Ces femmes ne meurent pas de la tumeur primaire dans leur sein. Au lieu de cela, la charge métastatique est responsable de la mortalité de cette maladie car elle se propage généralement au poumon, à l’os, au cerveau, au foie, et aux ganglions lymphatiques^2. Pour cette raison, les modèles de cancer du sein doivent évaluer les métastases pour contribuer à réduire la mortalité de cette maladie. Le modèle 4T1 murine cancer du sein est un protocole superbe pour y parvenir. La méthode décrite ici offre une amélioration du modèle 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ pour quantifier la métastase pulmonaire, produisant des résultats cohérents et rapides.

Le modèle 4T1 est bien établi, la plupart des laboratoires utilisant des protocoles tels que ceux décrits par Pulaski et Ostrand-Rosenberg en 2001³. La lignée cellulaire 4T1 est résistante à la 6-Thioguanine (6TG) et représentative du stade IV, triple cancer du sein^{négatif 3,4,5}. Il est cliniquement pertinent car il est un modèle orthotopique et métastase spontanément aux mêmes organes que dans le cancer du sein^{humain 3,4}. Les cellules 4T1 métastasent spontanément à un rythme prévisible basé sur la quantité de cellules injectées^3,4. Fait important, les différences génétiques entre les souris utilisées ici ont causé la variabilité inter-individuelle prévue dans la charge métastatique. Pour évaluer la métastase, les tissus sont récoltés pour recueillir et quantifier les cellules cancéreuses dans des sites éloignés à l’aide de la sélection 6TG et de la coloration bleue du méthylène. Le résultat est une collection de plaques de culture tissulaire avec des points bleus représentant des colonies métastatiques. Cependant, le protocole Pulaski et Ostrand-Rosenberg quantifie les colonies métastatiques en les comptant manuellement, et c’est donc le moyen standard d’évaluer les métastases dans ce modèle. Bien que cela soit facile pour les tissus à faible charge métastatique, les tissus comme les poumons sont souvent chargés de métastases. Comme les plaques pulmonaires peuvent être très confluentes, la quantification précise et précise des colonies métastatiques par comptage manuel est difficile et sujette à l’erreur humaine. Pour mieux quantifier le fardeau métastatique, nous décrivons l’utilisation de Fiji-ImageJ pour une solution informatique à l’erreur de comptage humain. L’analyse histopathologique avec la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) est un autre moyen de quantifier les métastases pulmonaires, et il est intéressant de l’améliorer avec le logiciel Fiji-ImageJ^6,7. Cependant, parce que l’analyse histopathologique observe une seule tranche du poumon, elle peut être inexacte et non représentative. C’est parce que le modèle 4T1 provoque plusieurs lésions métastatiques dans tout l’organe qui ne sont pas réparties uniformément. Alors que les tendances globales entre l’analyse histopathologique et le comptage manuel^{peuvent être similaires 8}, les valeurs individuelles peuvent différer et donc l’analyse histopathologique ne doit pas être utilisée comme seul moyen de quantification. Nous démontrons l’avantage par rapport à l’analyse histopathologique et aux incohérences dans le comptage manuel entre les différents compteurs, tout en démontrant la cohérence de l’utilisation de Fiji-ImageJ. En outre, nous montrons que cette méthode peut réduire le temps d’incubation de 10-14 jours à 5 jours, ce qui signifie que les chercheurs peuvent analyser les données de leur étude beaucoup plus tôt que lorsqu’ils s’appuient sur le comptage manuel.

Cette méthode est une collection d’ajustements simples au protocole Pulaski et Ostrand-Rosenberg³. Parce que le modèle 4T1 est largement utilisé, et parce que la métastase pulmonaire est un paramètre critique à mesurer dans les modèles précliniques, nous croyons que cette méthode peut être largement utilisée et est très précieuse pour les chercheurs sur le cancer du sein. Les seules fournitures supplémentaires nécessaires sont une caméra et l’accès à un ordinateur avec Fiji-ImageJ, un logiciel libre fréquemment utilisé dans l’analyse d’images⁹. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la métastase pulmonaire, mais elle pourrait être utilisée pour d’autres tissus avec une charge métastatique significative.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de Virginia Tech et conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. L’exécution de ce protocole exige la permission des institutions appropriées et le respect de toutes les lignes directrices appropriées.

1. Culture cellulaire

1. Faire des médias culturels complets (RPMI + 10% Sérum bovin fœtal +1% Pen Strep). Raviver les cellules 4T1 selon le protocole ATCC¹⁰ et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un flacon T-25 jusqu’au confluent. Changez de média le lendemain de la relance pour éliminer les cellules mortes, et encore une fois si les médias sont dépensés avant que les cellules ne soient suffisamment confluentes pour passer.
2. Une fois que le flacon T-25 est confluent, les cellules de passage à un flacon T-75 en jetant les médias, laver la fiole avec 5 mL de 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS), et l’ajout de 500 μL de Trypsin-EDTA. Incuber de 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.
   1. Une fois détaché, ajouter 5 mL de culture complète réchauffée aux cellules. Aspirer et transférer les 5 mL dans un flacon T-75 contenant 15 mL de culture complète réchauffée.
3. Cellules de passage dans les flacons T-75 au moins quatre fois. Faites ceci une fois que le flacon est confluent en lavant avec 8 mL de 1x DPBS, en ajoutant 1 mL de Trypsin-EDTA pour détacher les cellules, en ajoutant 10 mL de médias réchauffés aux cellules, et en diluant 1:6-1:8 dans un nouveau flacon T-75 contenant 20 mL de médias culturels complets réchauffés.
4. Cellules de passage jusqu’au nombre approprié de flacons T-150 contenant 40 mL de médias de culture complète réchauffés pour le nombre de souris à injecter. La plupart des études nécessiteront plusieurs flacons T-150 pour assurer suffisamment de cellules pour l’injection.
5. Lorsque les souris sont prêtes à être injectées (8 semaines ou pesant plus de 20 g, selon l’IACUC ou les protocoles institutionnels), récoltez les cellules en jetant les supports, en lavant chaque flacon avec 10 mL de DPBS 1x et en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA. Incuber de 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.
6. Laver le flacon avec 10 mL de supports complets et transférer tout le contenu (10 mL de médias + 2 mL de mélange de cellules trypsine-EDTA) au flacon suivant. Continuez à laver et à recueillir les cellules de chaque flacon à l’aide des mêmes 10 mL de médias pour éviter d’utiliser une quantité excessive de médias.
   1. Une fois que tous les flacons ont été collectés, transférer le contenu dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Prélouillez un échantillon de 10 μL pour compter dans un tube de microcentrifugeuse et centrifugez le tube conique de 50 mL à 125 x g pendant 5 minutes.
7. Pendant que les cellules sont centrifugées, ajouter 10 μL de bleu Trypan à 10 μL d’échantillon cellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois que le nombre total de cellules est déterminé, calculer la concentration de cellules nécessaires pour injecter des souris pour 1,2 x 10⁶ cellules par souris (par 100 μL).
8. Après centrifugation, décanter les médias et resuspendre les granulés cellulaires en quantité correcte de 1x DPBS stérile pour 1,2 x 10⁶ cellules par 100 μL. Diviser le mélange cellule/DPBS en tubes de microcentrifugeuse pour faciliter l’accès avec la seringue lors de l’aspiration des cellules pour injection. Gardez les cellules sur la glace et injectez peu de temps après car les cellules commenceront à mourir après avoir été sur la glace pendant de longues périodes de temps.

2. Injections

1. Préparer les cellules à l’injection en tapant ou en mélangeant doucement le tube de microcentrifugeuse pour résusquer les cellules, puis aspirer 600 μL dans une seringue de 1 mL. Tournez la seringue vers le haut et tirez le piston vers le bas pour éloigner les cellules de l’ouverture de la seringue. Appuyez sur la seringue pour la débarrasser des bulles d’air.
2. Attachez l’aiguille et distribuez les cellules dans le tube de microcentrifugeuse jusqu’à ce qu’il ne reste que 500 μL dans la seringue. Mettre la seringue à plat sur la glace.
   REMARQUE : Les cellules 4T1 tombent rapidement de suspension. Par conséquent, il est important de mélanger les cellules de nouveau en suspension en tapant fréquemment.
3. Anesthésier la souris BALB/c femelle de 8 semaines/>20 g à l’aide d’isoflurane ou d’un autre agent anesthésique approuvé. Surveillez la respiration de la souris pour évaluer la profondeur de l’anesthésie.
4. Une fois que la souris est correctement anesthésiée comme indiqué par manque de réflexe cornéen, placez la souris sur son dos. À l’aide du pouce, du pointeur et du majeur, maintenez doucement la souris. Utilisez le pointeur et les doigts du milieu pour maintenir le haut du corps et le pouce de la souris pour sa jambe gauche arrière. Soyez doux mais ferme.
5. Avec le biseau de l’aiguille vers le haut, injectez 100 μL des cellules sous-cutanéement dans la garniture mammaire abdominale gauche de graisse de la souris. Surveillez un bon saignement et toute fuite, et assurez-vous que la souris se réveille et se déplace facilement après l’injection.
   1. Changer les aiguilles entre chaque souris.
      REMARQUE : Ne laissez pas l’aiguille pénétrer dans la cavité péritonéale. Cela entraînerait une propagation rapide du cancer et ne serait pas représentatif du modèle. Pour assurer une injection sous-cutanée, tirez doucement vers le haut sur l’aiguille lorsqu’elle est insérée dans la graisse mammaire abdominale gauche. Si l’aiguille est facilement soulevée vers le haut, elle est correctement positionnée sous-cutanée.

3. Surveillance

1. Surveillez les souris au moins 3 fois par semaine pour le poids, le score de l’état corporel, la taille de la tumeur, l’état tumoral, la respiration, le niveau d’activité, l’apparence et le mouvement. Une fois que la tumeur atteint 0.7-0.8 cm de diamètre, commencez à surveiller quotidiennement.
   1. Considérez l’euthanasie quand la taille de tumeur atteint 1.5 cm, ou la perte de poids atteint 20%, ou le déclin clinique grave du score de condition corporelle, de l’état de tumeur, de la respiration, du niveau d’activité, de l’aspect, ou du mouvement sont observés basés sur des directives institutionnelles.
      NOTE : Le score de condition corporelle est crucial pour surveiller car le poids corporel peut augmenter pendant que la tumeur augmente dans la taille, négationnant la perte de condition corporelle due à la charge de maladie. Les protocoles de surveillance exacts dépendront des protocoles IACUC ou institutionnels approuvés.

4. Nécropsie

1. Euthanasier la souris à l’aide de CO_{2 selon} les directives institutionnelles.
2. Vaporiser la souris de 70 % d’éthanol pour la désinfecter. Faire une incision jusqu’à la ligne médiane ventrale de la souris pour exposer la cavité du corps.
3. Enlevez le rein. Continuez à couper la ligne médiane jusqu’à ce que le diaphragme soit visible. Utilisez des ciseaux pour percer le diaphragme pour dégonfler les poumons. Coupez le diaphragme pour obtenir un meilleur accès à la cavité.
4. Utilisez des ciseaux contondants pour couper le centre de la cage thoracique. Pin cage thoracique en arrière pour exposer le poumon et le cœur.
5. Perfuser le cœur avec 2 mL de 1x DPBS 1x stérile en insérant une aiguille dans l’apex du cœur jusqu’à ce qu’il se fonde dans la cavité abdominale où le rein a été enlevé.
6. Pour enlever le cœur et les poumons, utilisez des ciseaux contondants pour couper l’œsophage et la trachée directement au-dessus du cœur. À l’aide de forceps, commencer à tirer le cœur loin du corps et couper à n’importe quel tissu conjonctif le garder attaché. Les poumons sortiront avec le coeur.
7. Identifier les poumons multi lobés (droite) et mono lobés (gauche). Gardez le cœur attaché pour la référence, mais une fois que les poumons sont identifiés, couper le cœur loin.
8. Étiquetez une plaque de 12 puits contenant 1x Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) dans chaque puits. Chaque souris a besoin de 2 puits. Placez le poumon multi lobé (droit) dans la plaque de 12 puits pour l’évaluation des métastases et continuez sur la glace. Gardez le puits voisin vide pour l’instant.
   REMARQUE : Il est important d’utiliser le même poumon (multi lobé) de chaque souris pour s’assurer que chaque échantillon est de taille proche. Le poumon mono lobé peut alors être utilisé pour d’autres analyses, comme l’histopathologie.
   REMARQUE : Les échantillons sont stables sur la glace ou à 4 °C pendant quelques heures.

5. Traitement des tissus

REMARQUE : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile.

1. Étiquetez 1 tube conique de 15 mL par souris et ajoutez 2,5 mL de mélange de collagène de type IV et 30 unités d’élaslasase à chaque tube. Pour faire le mélange de collagène de type IV, dissoudre 2 mg de collagène de type IV par mL 1x HBSS et filtre stérile. Celui-ci peut être stocké jusqu’à 12 mois à -20 °C et décongelé en cas de besoin.
2. Transférez le poumon au deuxième, nettoyez bien 1x HBSS pour cet échantillon. Tourbillonnez à l’aide de forceps pour enlever le reste du sang. Transférer le poumon propre dans une plaque de culture tissulaire vide de 3,5 cm. Hacher le poumon avec des ciseaux. Rincer la plaque avec 2,5 mL de 1x HBSS, transférer 1x HBSS et morceaux de poumon dans un tube conique de 15 mL contenant déjà du cocktail collagène/élasstase (5 mL au total).
3. Incuber pendant 75 minutes à 4 °C. Continuez à mélanger les échantillons pendant ce temps, alors placez les tubes sur un rocker ou une roue rotative. Au cours de cette étape d’incubation, étiquetez les tubes de centrifugeuse de 50 mL et les plaques de culture tissulaire de 10 cm pour chaque souris. Si vous faites une dilution, étiquetez suffisamment de plaques de culture tissulaire de 10 cm pour les dilutions.
   REMARQUE : Étiquetez le couvercle des plaques de culture tissulaire. Si l’étiquetage de la plaque elle-même, l’écriture interférera avec l’analyse Fiji-ImageJ.
4. Porter le volume de chaque tube jusqu’à 10 mL au total avec 1x HBSS. Verser le contenu sur une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube conique de 50 mL pour chaque échantillon. Utilisez le piston d’une seringue de 1 mL pour moudre doucement l’échantillon à travers la passoire pour permettre à plus de cellules de filtrer à travers.
5. Centrifugeuse pendant 5 minutes à 350 x g à température ambiante (RT). Jetez le supernatant et lavez la pastille avec 10 mL de 1x HBSS. Répétez cette étape deux fois.
6. Resuspendez les granulés dans 10 mL de 60 μM 6TG multimédia de culture complet, soit RPMI ou IMDM. Échantillons de plaques dans des plaques de culture cellulaire de 10 cm, à l’aide d’un système de dilution si désiré. Incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 5 jours.
   REMARQUE : 1:2, 1:10 et 1:100 sont des dilutions courantes qui devront être déterminées empiriquement en fonction des paramètres de l’étude.
   ATTENTION: 6TG est toxique. Faire preuve de prudence lors de la manipulation et suivre toutes les directives en matière de santé et de sécurité environnementales pour l’élimination.

6. Plaques de coloration

1. Verser les supports de culture des plaques dans un conteneur à déchets approprié. Fixer les cellules en ajoutant 5 mL de méthanol non dilué par plaque et incuber pendant 5 minutes à RT, en s’assurant de tourbillonner le méthanol afin qu’il couvre toute la plaque.
   ATTENTION : Le méthanol est dangereux s’il est ingéré, inhalé ou sur la peau. Utilisez une hotte de fumée pour cette étape.
2. Verser le méthanol des plaques dans un contenant de déchets approprié. Rincer les assiettes avec 5 mL d’eau distillée par assiette et verser l’eau dans un récipient à déchets approprié. Ajouter 5 mL de 0,03% de bleu méthylène par plaque et incuber pendant 5 minutes à RT, en s’assurant de tourbillonner la solution bleu méthylène afin qu’il couvre toute la plaque.
3. Verser le bleu méthylène dans un contenant de déchets approprié. Rincer à nouveau les assiettes avec 5 mL d’eau distillée par assiette. Retourner les assiettes à l’envers et éponger contre une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Déposer la plaque sur son couvercle et laisser sécher l’air toute la nuit à RT.
   REMARQUE : Les colonies métastatiques seront bleues. Une fois les assiettes séchées, elles peuvent être conservées à RT indéfiniment.

7. Analyse d’image

1. Retirer les couvercles étiquetés des assiettes, en prenant soin d’assurer une identification claire des échantillons. Alignez toutes les plaques pulmonaires tachées sur une surface claire et propre pour prendre une photo de toutes les plaques en une seule image.
2. Prenez une photo de la collection de plaques dans une zone bien éclairée, en vous assurant de minimiser les réflexions car les plaques sont très réfléchissantes. Les réflexions dans les plaques influenceront l’analyse d’image et doivent donc être évitées.
   REMARQUE: Fiji-ImageJ a une limite supérieure de 2 gigapixels. La plupart des téléphones intelligents modernes auront suffisamment de caméras. N’utilisez pas un appareil photo de moins de 8 mégapixels. L’appareil photo utilisé dans cette expérience était un 12,2 mégapixels sur un Pixel 2 de Google.
3. Recadrer l’image pour inclure les plaques, mais exclure les couvercles ou toute autre chose à l’arrière-plan de l’image. Téléchargez l’image recadrée dans Fiji-ImageJ.
4. Modifiez l’image en noir et blanc à l’aide des commandes suivantes : Image, Ajustement, Seuil de couleur, Méthode de seuil : Par défaut, Couleur seuil : B&W, Espace seuil : Laboratoire. Désélectionner la boîte de fond sombre. L’image doit maintenant être en noir et blanc. Le noir représente le fond clair, et le blanc représente les colonies métastatiques bleues.
5. À l’aide de l’outil Cercle sur la barre d’outils Fidji-ImageJ, sélectionnez la zone à analyser. Dessinez un cercle à utiliser pour toutes les plaques pour vous assurer que chaque plaque est analysée pour la même taille. Choisissez une taille qui maximise la surface analysée sur les plaques tout en minimisant le bruit de fond qui apparaît sur le bord des plaques. La taille apparaît dans la barre d’outils au fur et à mesure qu’elle est dessinée, il est donc possible de faire un cercle parfait en surveillant la hauteur et la largeur au fur et à mesure que le cercle est dessiné.
6. Analyser le cercle sélectionné pour déterminer quel pourcentage de la zone est blanc, ce qui représente la zone de la plaque qui a des colonies métastatiques bleues. Utilisez les commandes suivantes :
   Analyser, analyser les particules, taille (pixel^2):0-Infinity, Circularité: 0.00-1.00, Afficher: Rien, et coché la case Résumé. Frappe bien.
7. Enregistrez le résultat de la zone en %. C’est le pourcentage de la zone sélectionnée qui est blanc, et représente donc le fardeau métastatique.
   REMARQUE : Il est recommandé d’enregistrer les résultats dans Fiji-ImageJ ou de copier/coller l’intégralité de la page de résultats dans un document distinct. Si les résultats de la zone % sont inattendus ou suspects, il est alors possible de voir si l’une des autres mesures était également suspecte ou si % Area a été enregistré de manière incorrecte.
8. Déplacez le cercle, sans altérer sa taille en le saisissant en son centre, vers la plaque suivante de l’image. Répétez les étapes 7.6 et 7.7 pour toutes les plaques de l’image.
9. Répétez les étapes 7.1 – 7.8 sur au moins deux images supplémentaires. Une fois que toutes les plaques et images ont été analysées, la moyenne des résultats de zone en % entre les différentes images pour chaque plaque afin d’atténuer les incohérences entre les images.

Résultats

Cette méthode contient des ajustements simples du protocole^{4T1 3} de Pulaski et Ostrand-Rosenberg et peut être visualisée dans la figure 1. Lorsque 3 chercheurs distincts ont compté manuellement les colonies métastatiques pour 12 plaques pulmonaires (dilution de 1:10), les résultats étaient très incohérents entre les différents compteurs (figure 2A). Tous les chercheurs ont été dirigés pour « compter les colonies métastatiq...

Discussion

Comme démontré, compter manuellement les colonies métastatiques sur chaque plaque pulmonaire peut être une méthode inexacte et imprécise pour quantifier les métastases pulmonaires, démontrant la nécessité d’un meilleur moyen de quantification (figure 2). L’analyse histopathologique différait légèrement du comptage manuel et de l’analyse Fiji-ImageJ(figure 2B et 4D),probablement parce que les diapositives H&E ne sont pas un éc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	000651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water