Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique

Résumé

Nous décrivons une méthode de préparation et d’imagerie en direct d’extraits cytoplasmiques non dilués d’œufs de Xenopus laevis .

Résumé

Traditionnellement utilisés pour les essais biochimiques en vrac, les extraits d’œufs de Xenopus laevis sont devenus un puissant outil basé sur l’imagerie pour étudier les phénomènes cytoplasmiques, tels que la cytokinèse, la formation de fuseau mitotique et l’assemblage du noyau. S’appuyant sur les premières méthodes qui ont imagé des extraits fixes échantillonnés à des points temporels clairsemés, les approches récentes imagent des extraits vivants en utilisant la microscopie accélérée, révélant des caractéristiques plus dynamiques avec une résolution temporelle améliorée. Ces méthodes nécessitent généralement des traitements de surface sophistiqués du vaisseau d’imagerie. Nous présentons ici une méthode alternative pour l’imagerie en direct d’extraits d’œufs qui ne nécessitent aucun traitement de surface chimique. Il est simple à mettre en œuvre et utilise des consommables de laboratoire produits en série pour l’imagerie. Nous décrivons un système qui peut être utilisé à la fois pour la microscopie à grand champ et la microscopie confocale. Il est conçu pour l’imagerie d’extraits dans un champ 2 dimensions (2D), mais peut être facilement étendu à l’imagerie en 3D. Il est bien adapté pour étudier la formation de motifs spatiaux dans le cytoplasme. Avec des données représentatives, nous démontrons l’organisation dynamique typique des microtubules, noyaux et mitochondries dans des extraits interphasiques préparés à l’aide de cette méthode. Ces données d’images peuvent fournir des informations quantitatives sur la dynamique cytoplasmique et l’organisation spatiale.

Introduction

Le cytoplasme constitue le volume principal d’une cellule et a une organisation distincte. Les ingrédients du cytoplasme eucaryote peuvent s’auto-assembler en un large éventail de structures spatiales, telles que les asters de microtubules et l’appareil de Golgi, qui à leur tour sont disposés dynamiquement et retournés en fonction de l’identité et de l’état physiologique de la cellule. Comprendre l’organisation spatiale du cytoplasme et son lien avec les fonctions cellulaires est donc important pour comprendre le fonctionnement de la cellule. Les extraits d’œufs de Xenopus laevis ont traditionnellement été utilisés pour des essais biochimiques en vrac 1,2,3,4,5,6,7,8, mais des travaux récents les établissent comme un puissant système d’imagerie en direct pour les études mécanistes des structures cytoplasmiques et de leurs fonctions cellulaires 9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18. Ces extraits non dilués préservent de nombreuses structures et fonctions du cytoplasme, tout en permettant des manipulations directes du contenu cytoplasmique non réalisables dans les modèles cellulaires conventionnels^19,20. Cela les rend idéales pour caractériser les phénomènes cytoplasmiques et disséquer leurs fondements mécanistes.

Les méthodes existantes d’imagerie des extraits nécessitent des modifications chimiques de surface ou la fabrication de dispositifs microfluidiques. Une méthode basée sur les lamelles de couverture nécessite une passivation en polyéthylène glycol (PEG) des lamelles de verre²¹. Une méthode basée sur la microémulsion nécessite un dépôt en phase vapeur de trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane sur des surfaces vitrées^22,23. Les systèmes microfluidiques permettent un contrôle précis du volume, de la géométrie et de la composition des gouttelettes d’extrait, mais nécessitent des installations de microfabrication spécialisées^11,12,24.

Ici, nous introduisons une méthode alternative d’imagerie des extraits d’œufs qui est facile à mettre en œuvre et utilise des matériaux facilement disponibles et peu coûteux. Cela comprend la préparation d’une chambre d’imagerie avec une lame et une lamelle de couverture recouverte de ruban d’éthylène propylène fluoré (FEP). La chambre peut être utilisée pour des extraits d’imagerie avec une variété de systèmes de microscopie, y compris des stéréoscopes et des microscopes droits et inversés. Cette méthode ne nécessite aucun traitement chimique des surfaces tout en obtenant une clarté optique similaire obtenue avec les méthodes à base de verre existantes décrites ci-dessus. Il est conçu pour imager une couche d’extraits avec une épaisseur uniforme sur un champ 2D, et peut être facilement étendu pour imager un volume 3D d’extraits. Il est bien adapté à l’imagerie accélérée du comportement cytoplasmique collectif sur un large champ de vision.

Nous avons utilisé des extraits d’œufs arrêtés par interphase pour démontrer notre méthode d’imagerie. La préparation de l’extrait suit le protocole de Deming et Kornbluth¹⁹. En bref, les œufs naturellement arrêtés en métaphase de méiose II sont écrasés par une rotation à basse vitesse. Ce spin libère le cytoplasme de l’arrêt méiotique et permet à l’extrait de passer en interphase. Normalement, la cytochalasine B est ajoutée avant le spin d’écrasement pour inhiber la formation de F-actine. Cependant, il peut être omis si la F-actine est souhaitée. Le cycloheximide est également ajouté avant l’essorage de broyage pour empêcher l’extrait interphase d’entrer dans la mitose suivante. Les extraits sont ensuite placés dans les chambres d’imagerie susmentionnées et placés au microscope. Enfin, les images sont enregistrées au fil du temps à des intervalles définis par une caméra connectée au microscope, produisant des séries d’images accélérées qui capturent le comportement dynamique de l’extrait dans un champ 2D.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Stanford.

1. Préparation des diapositives et des feuillets de couverture

1. Appliquez une couche de ruban adhésif d’éthylène propylène fluoré (FEP) sur une lame de verre à l’aide d’un applicateur à rouleaux. Coupez le ruban adhésif excessif sur les bords avec une lame de rasoir propre. Préparez les feuillets de couverture recouverts de ruban FEP de la même manière (Figure 1A).
2. Appliquez une entretoise d’imagerie collante double face sur le côté de la lame recouvert de ruban adhésif FEP. Laissez la doublure protectrice sur le dessus non pelée (Figure 1A).
   NOTE: Les lames et les feuillets de couverture doivent être préparés avant l’expérience. Ils peuvent être utilisés immédiatement ou stockés dans des boîtes pour éviter l’accumulation de poussière sur les surfaces. Le puits dans l’espaceur d’imagerie a une profondeur de 120 μm et un diamètre de 9 mm.

2. Préparation et imagerie en direct d’extraits d’œufs arrêtés par interphase

NOTE: Le protocole suivant est adapté de Deming et Kornbluth¹⁹, Murray²⁰, et Smythe et Newport²⁵ avec des modifications. Toutes les étapes doivent être effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Trois à dix jours avant le prélèvement des œufs, injectez des grenouilles Xenopus laevis femelles matures par voie sous-cutanée dans le sac lymphatique dorsal avec 100 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG).
2. Seize à dix-huit heures avant la collecte prévue des œufs, injectez aux grenouilles de l’étape 2.1 500 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG). Laisser les grenouilles à 18 °C dans un tampon de ponte (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H2O, 2,5 mM CaCl₂·_2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, préparer sous forme de solution mère 20x à pH_7,4 et diluer avec de l’eau propre du réservoir de grenouille à 1x avant utilisation) jusqu’à la collecte des œufs.
3. Le jour de l’expérience, collectez les œufs dans une grande boîte de Petri en verre et évaluez la qualité des œufs. Jetez tous les œufs qui ressemblent à des boules gonflées blanches ou qui apparaissent dans une ficelle (Figure 1B). Examinez les œufs sous un stéréoscope, conservez-les avec une apparence normale (figure 1C) et jetez ceux qui ont un pigment irrégulier ou tacheté (figure 1D).
   REMARQUE: Ce protocole fonctionne avec des œufs prélevés sur une seule grenouille, qui pond généralement 25 ml d’œufs 16 heures après l’injection d’hCG. Habituellement, un total de 3 à 6 grenouilles sont induites par hCG, et la grenouille avec la meilleure qualité d’oeuf est choisie pour l’expérience de préparation de l’extrait.
4. Transférer les œufs dans un bécher en verre de 400 ml et retirer autant de tampon de ponte que possible en les décantant.
5. Incuber les œufs dans 100 mL de solution dégelante fraîchement préparée (2 % p/v de L-cystéine dans l’eau, ajuster à pH 8,0 avec NaOH) et les agiter doucement périodiquement. Après environ 3 minutes, verser la solution et ajouter 100 mL de solution de déjeltion fraîche. Continuez l’incubation jusqu’à ce que les œufs soient bien emballés (pas d’espace entre les œufs), mais évitez de laisser les œufs dans la solution de déjeltion pendant plus de 5 minutes au total.
6. Retirer autant de solution dégelante que possible par décantation et laver les œufs dans un tampon MMR 0,25x (NaCl 25 mM, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl₂, 0,025 mM EDTA,_1,25 mM HEPES, préparé sous forme de solution mère 10x, ajusté à pH 7,8 avec NaOH et dilué dans de l’eau Milli-Q avant utilisation) en ajoutant le tampon, faire tourbillonner les œufs, puis verser le tampon. Répétez plusieurs fois jusqu’à ce qu’un total de 1 L du tampon soit utilisé pour les lavages.
7. Lavez les œufs plusieurs fois avec un total de 400 mL de tampon de lyse des œufs (250 mM de saccharose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 1 mM de DTT, frais et ajusté à pH 7,7 avec KOH). Retirer les œufs d’apparence anormale à l’aide d’une pipette Pasteur entre les lavages.
   REMARQUE : Les œufs d’apparence anormale font référence à ceux qui ressemblent à des boules gonflées blanches (figure 1B), qui ont une pigmentation tachetée (figure 1D), qui se détériorent avec une région blanche en croissance (figure 1E) ou qui présentent une zone pigmentée foncée et contractée dans l’hémisphère animal (figure 1F).
8. À l’aide d’une pipette de transfert dont l’extrémité est grande ouverte, transférer les œufs dans un tube centrifuge à fond rond de 17 ml contenant 1 mL de tampon de lyse des œufs. Faites tourner le tube dans une centrifugeuse clinique à 400 x g pendant 15 secondes pour emballer les œufs.
9. Retirez autant de tampon de lyse des œufs que possible du dessus des œufs emballés à l’aide d’une pipette Pasteur.
   NOTE: Il est important d’enlever autant de tampon des œufs emballés que possible, afin de minimiser la dilution de l’extrait d’œuf. Parfois, il est nécessaire d’enlever quelques œufs en vrac avec le tampon résiduel pour y parvenir.
10. Déterminer le volume approximatif des œufs emballés, puis ajouter 5 μg/mL d’aprotinine, 5 μg/mL de leupeptine, 5 μg/mL de cytochalasine B et 50 μg/mL de cycloheximide directement sur les œufs emballés.
    REMARQUE: L’aprotinine et la leupeptine sont des inhibiteurs de la protéase. La cytochalasine B inhibe la polymérisation de l’actine, empêchant l’extrait de se contracter et de gélifier²⁶. Le cycloheximide inhibe la synthèse des protéines, maintenant ainsi l’extrait dans l’interphase du cycle cellulaire.
11. Écraser les œufs en centrifugeant le tube à 12 000 x g, 4 °C, pendant 15 minutes, dans un rotor de godet oscillant.
    NOTE: À la fin de la centrifugation, les œufs doivent avoir rompu et le lysat séparé en trois couches principales: une couche lipidique jaune sur le dessus, l’extrait cytoplasmique (également appelé extrait brut) au milieu et une couche dense foncée contenant les granules de pigment en bas (Figure 1G).
12. Fixez une aiguille de calibre 18 à une seringue. Avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut, percez le tube par le côté au bas de la couche cytoplasmique et récupérez l’extrait en tirant lentement.
    REMARQUE: Tirez lentement l’extrait cytoplasmique pour éviter l’inclusion de contenu contaminant de la couche lipidique jaune.
13. Transférer l’extrait cytoplasmique récupéré dans un nouveau tube de microcentrifugation et le maintenir sur de la glace. Utilisez l’extrait dans 1 heure.
14. Lorsque vous êtes prêt à imager, complétez l’extrait avec les réactifs souhaités et les sondes d’imagerie par fluorescence.
    REMARQUE: Les sondes d’imagerie par fluorescence marquent des structures cytoplasmiques spécifiques afin qu’elles puissent être visualisées par un microscope à fluorescence.
15. Retirez le revêtement protecteur supérieur de l’espaceur d’imagerie sur la lame préparée à l’étape 1.2 et déposez environ 7 μL d’extrait au centre du puits. Appliquez immédiatement le couvercle recouvert de ruban adhésif FEP avec le côté FEP face à l’extrait pour sceller le puits. Passez rapidement à l’imagerie (Figure 1H,I).
16. Placez la lame sur un microscope inversé ou droit avec une platine motorisée et un appareil photo numérique. Imagez les extraits aux positions spatiales et aux intervalles de temps souhaités dans les canaux de fond clair et de fluorescence.
    Remarque : En règle générale, un objectif 5x est utilisé pour l’imagerie. L’étage motorisé permet l’acquisition automatisée d’images à plusieurs positions spatiales définies. La microscopie à fond clair visualise les structures cytoplasmiques avec différents degrés de transparence. La microscopie à fluorescence visualise les structures cytoplasmiques spécifiquement marquées par les sondes d’imagerie par fluorescence ajoutées à l’étape 2.14. La caméra enregistre des images accélérées de ces structures, capturant ainsi la dynamique de l’organisation cytoplasmique.

Résultats

Les extraits d’œufs de Xenopus laevis peuvent être utilisés pour étudier l’auto-organisation du cytoplasme pendant l’interphase. La figure 2A montre les résultats d’une expérience réussie. Nous avons complété des extraits arrêtés par interphase avec des noyaux de spermatozoïdes¹⁹ de Xenopus laevis à une concentration de 27 noyaux/μL et 0,38 μM de GST-GFP-NLS 27,28,29,30 purifiés (protéine de f...

Discussion

Les extraits d’œufs de Xenopus laevis sont apparus comme un puissant système modèle pour les études basées sur l’imagerie de diverses structures subcellulaires 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 et l’organisation cytoplasmique dans son ensemble.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M