Immersion alternative dans le glucose pour produire une hyperglycémie prolongée chez le poisson zèbre

Résumé

Ce protocole induit non envahissantement l’hyperglycémie chez le poisson zèbre pendant jusqu’à 8 semaines. À l’aide de ce protocole, une étude approfondie des effets indésirables de l’hyperglycémie peut être réalisée.

Résumé

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un excellent modèle pour étudier les effets de l’hyperglycémie chronique, une caractéristique du diabète sucré de type II (DT2). Ce protocole alternatif d’immersion est une méthode non envahissante et pas à pas d’induire l’hyperglycémie pendant jusqu’à huit semaines. Les poissons zèbres adultes sont alternativement exposés au sucre (glucose) et à l’eau pendant 24 heures chacun. Le poisson zèbre commence le traitement dans une solution de glucose à 1% pendant 2 semaines, puis une solution à 2% pendant 2 semaines et enfin une solution à 3% pendant les 4 semaines restantes. Comparé aux contrôles traités à l’eau (stress) et traités au mannitol (osmotique), les poissons zèbres traités au glucose ont des niveaux de sucre dans le sang significativement plus élevés. Le poisson zèbre glucose-traité montre des niveaux de sucre dans le sang de 3 fois celui des contrôles, suggérant qu’après quatre et huit semaines hyperglycémie puisse être réalisée. L’hyperglycémie soutenue a été associée à la protéine acide fibrillaire glial accrue (GFAP) et aux niveaux nucléaires accrus du facteur Kappa B (N-F-kB) dans la rétine et aux réponses physiologiques diminuées, ainsi qu’aux déficits cognitifs suggérant que ce protocole puisse être employé pour modéliser des complications de la maladie.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) devient rapidement un modèle animal largement utilisé pour étudier à la fois la maladie et la cognition¹. La facilité de la manipulation génétique et la transparence embryonnaire à travers les premiers stades de développement, en font un candidat de choix pour étudier les maladies humaines avec une base génétique connue. Par exemple, le poisson zèbre a été utilisé pour étudier le syndrome de Holt-Oram, les cardiomyopathies, les maladies rénales glomérulokystiques, la dystrophie musculaire et le diabète sucré (DM) parmi d’autres maladies¹. De plus, le modèle du poisson zèbre est idéal en raison de la petite taille de l’espèce, de sa facilité d’entretien et de sa fécondité élevée^2,3.

Le pancréas du poisson zèbre est à la fois anatomiquement et fonctionnellement similaire au pancréas des mammifères⁴. Ainsi, les caractéristiques uniques de taille, de fécondité élevée et de structures endocriniennes similaires font du poisson zèbre un candidat approprié pour étudier les complications liées au DM. Chez le poisson zèbre, il existe deux méthodes expérimentales utilisées pour induire l’hyperglycémie prolongée qui est caractéristique du DM : un afflux de glucose (modélisation de type 2) et l’arrêt de la sécrétion d’insuline (modélisation de type 1)^5,6. Expérimentalement, pour arrêter la sécrétion d’insuline, les cellules β pancréatiques peuvent être détruites chimiquement à l’aide d’injections de streptozotocine (STZ) ou d’alloxane. STZ a été utilisé avec succès chez les rongeurs et les poissons zèbres, entraînant des complications associées à la rétinopathie^7,8,9,troubles cognitifs¹⁰et à la régénération des membres^11. Cependant, chez le poisson zèbre, les cellules β se régénèrent après le traitement, ce qui rend nécessaires des « injections de rappel » de STZ pour maintenir des conditions diabétiques¹². Alternativement, le pancréas du poisson zèbre peut être enlevé⁶. Ce sont deux procédures très invasives, en raison des injections multiples, et le temps de récupération étendu.

Réciproquement, l’hyperglycémie peut être induite non envahissante par l’exposition au glucose exogène. Dans ce protocole, les poissons sont immergés dans une solution de glucose hautement concentrée pendant 24 heures^5,13 ou continuellement pendant 2 semaines^14,15,16. Le glucose exogène est pris par voie transdermique, par ingestion et/ou à travers les branchies, ce qui entraîne une glycémie élevée. Puisque cette technique non envahissante ne manipule pas directement des niveaux d’insuline, elle ne peut pas prétendre induire le DM de type 2. Cependant, il peut être utilisé pour examiner les complications induites par l’hyperglycémie, qui est l’un des principaux symptômes du DM de type 2.

Récemment, le mutant du poisson zèbre pdx1^-/- a été développé en manipulant le gène de l’homéobox 1 pancréatique et duodénal, un gène lié à la cause génétique du DM de type 2 chez l’homme. En utilisant ce mutant, les chercheurs ont pu reproduire la perturbation du développement pancréatique, l’hyperglycémie et étudier la rétinopathie diabétique induite par l’hyperglycémie^17,18.

En ce document, nous décrivons une méthode non envahissante d’induction d’hyperglycémie qui emploie un protocole alternatif d’immersion. Ce protocole maintient des conditions hyperglycemic pendant jusqu’à 8 semaines avec des complications suivantes observées. En bref, les poissons zèbres adultes sont placés dans une solution de sucre pendant 24 heures, puis dans une solution aqueuse pendant 24 heures. Contrairement à l’immersion continue dans des solutions de glucose externes, l’alternance de jours entre le sucre et l’eau imite la montée et la chute de la glycémie dans le diabète. Un protocole de glucose alternatif permet en outre à l’hyperglycémie d’être induite pendant de plus longues périodes de temps, car les poissons zèbres ne sont pas aussi capables de compenser les conditions de glucose externe élevées. Comme preuve de principe, nous fournissons des données 444 40000 10000.As proof of principle, we provide data showing that hyperglycemia induced using this protocol alters retinal chemistry and physiology.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’American University.

1. Préparation des réservoirs de solution

1. Obtenir six réservoirs, deux pour chaque groupe expérimental (glucose, mannitol et eau). Étiquetez l’un des deux réservoirs « réservoir de logement » (il abritera le poisson) et étiquetez l’autre « réservoir de solution » (il contiendra la solution).
   REMARQUE: Le groupe de traitement mannitol est le contrôle osmotique, et le groupe de traitement de l’eau est un groupe de manipulation / stress. Il est important de garder les réservoirs, les compagnies aériennes / pierres à air, les couvercles et les fournitures de nettoyage séparés pour chaque groupe de traitement
2. Utilisez un réservoir de 2 L si le nombre total de poissons utilisés est inférieur à 20. Utilisez un réservoir de 4 L si le nombre total de poissons utilisés est supérieur à 20.
   NOTA : Utilisez un N de 5 à 10 par groupe de traitement et par point de temps d’échantillonnage.
3. Gardez les réservoirs dans un bain-marie à 28-29 °C pour maintenir la température de l’eau.
4. Le jour 1, placez les poissons dans leurs solutions de traitement respectives (glucose, mannitol, eau) pendant 24 heures (« Water to Treatment »). Le jour 2, transférer les poissons de leurs solutions de traitement à l’eau pendant 24 heures (« Traitement à l’eau »). Le jour 3, transférer le poisson de l’eau vers des solutions de traitement (« Eau à traitement »). Cette exposition alternée se poursuit pour le reste de l’expérience (Figure 1). Transférer quotidiennement des poissons témoins traités à l’eau de l’eau à l’eau.
5. Assurez-vous que les poissons sont nourris et transférés dans la même fenêtre de 2 heures chaque jour pendant toute la durée de l’expérience.

2. Préparation du poisson

1. Utilisez le poisson zèbre adulte (4 mois – 1 an)⁵.
2. Nourrissez les flocons de Tetramin au sol tous les jours à votre arrivée au laboratoire.
3. Notez le pH et la température de tous les réservoirs et notez l’état général du poisson.

3. Transfert de poisson

1. Transférer les poissons de chaque groupe de traitement du réservoir de logement au réservoir de solution correspondant à l’aide d’un filet à poisson standard.
2. Replacez le réservoir contenant le poisson dans le bain-marie, remplacez la pierre à air et le couvercle du réservoir. Ce réservoir est maintenant le « réservoir de logement » et le réservoir qui contenait auparavant le poisson est maintenant le « réservoir de solution ».
3. Jetez l’ancienne solution et nettoyez le réservoir, ainsi que les couvercles du réservoir, les compagnies aériennes, les pierres à air et les filets pour éviter l’accumulation de glucose et de mannitol.
   REMARQUE: Ne pas laver les articles avec du savon. Utilisez de l’eau et une brosse/éponge de gommage dédiée pour chaque condition de traitement afin de nettoyer correctement les réservoirs.
4. Séchez les « réservoirs de solution » nouvellement nettoyés avec une serviette en papier. Préparez les solutions pour le lendemain en utilisant ce réservoir. Assurez-vous que les autres articles sont séchés et séparés par des groupes de traitement appropriés.
   REMARQUE : Tenez un registre des solutions que les poissons sont transférés chaque jour, ainsi que des solutions préparées pour le lendemain. Par exemple : Poisson transféré du glucose à_H2O,nouvelle solution de glucose à 1% préparée pour demain.

4. Préparation de la solution post-transfert

1. Préparation de solutions de sucre
   1. Remplissez chaque réservoir de solution avec 2 L (ou 4 L) d’eau du système (l’eau du système est définie comme de l’eau qui a été traitée avec le bon rapport de solution saline et qui est à la même température que les réservoirs de stock et de traitement).
   2. Mesurez la quantité correcte de glucose et de mannitol (voir l’étape 5 ci-dessous) à l’aide d’une balance de chargement supérieure et de bateaux de pesage séparés pour chaque produit chimique.
   3. Ajouter la partie aliquote de glucose ou de mannitol pesée au réservoir de solution nettoyé approprié, qui ne contient que de l’eau du système.
   4. Agiter les solutions de glucose et de mannitol avec des tiges de verre séparées jusqu’à ce que les sucres soient complètement dissous.
   5. Retournez les réservoirs de solution au bain-marie et couvrez-les de leurs couvercles correspondants.
2. Préparation de solutions d’eau
   1. Remplissez les réservoirs expérimentaux (2 L ou 4 L) avec de l’eau système.
   2. Retournez ces « réservoirs de solution » au bain-marie et recouvrez-les de leurs couvercles correspondants.

5. Évolution des pourcentages

1. Maintenir le poisson dans une solution à 1% pendant les 2 premières semaines de traitement: 40 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.
2. Maintenir le poisson dans une solution à 2% pendant les semaines 3 et 4 du traitement: 80 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.
3. Maintenir le poisson dans une solution à 3% pendant les 4 dernières semaines de traitement: 120 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.

6. Mesurer la glycémie et recueillir les tissus

1. Anesthésier le poisson 2 à la fois dans une solution de tricaine à 0,02%.
2. Décapiter le poisson directement derrière les branchies à l’aide d’une lame de rasoir.
3. Mesurer la valeur de la glycémie.
   REMARQUE: Nous utilisons un lecteur de glycémie (par exemple, Freestyle Lite) pour mesurer la glycémie et placer la bandelette de test directement sur le cœur exposé (échantillon de sang cardiaque).
4. Disséquer le tissu recherché du poisson (cerveau, muscle, etc.).
5. Entreposer les tissus recueillis en les congelant instantanément sur de la glace carbonique et en les stockant dans un congélateur à -80 °C, en les fixant dans du paraformaldéhyde à 4 % ou en les plaçant dans une solution tampon pour une utilisation immédiate.

Résultats

En utilisant ce protocole(figure 1),les valeurs de sucre dans le sang sont significativement élevées après 4 semaines et 8 semaines de traitement(figure 2A),l’hyperglycémie étant définie comme 3 fois les moyennes de contrôle des groupes traités à l’eau et traités au mannitol. Les témoins traités à l’eau sont transférés quotidiennement dans et hors de l’eau, ce qui fournit un contrôle du stress et de la manipulation. Le mannitol sert de co...

Discussion

Le diabète est un problème national. Des études montrent que d’ici 2030, on estime que 400 millions de personnes auront une forme ou une autre de diabète. Dans les modèles de rongeurs, le DM de type 2 est étudié à l’aide de manipulations génétiques. Chez les rats, les rats gras diabétiques zucker (ZDF), et les rats gras Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), fournissent plus d’informations sur les effets du type 2 DM^10. En outre, des régimes riches en graisses ont été utilisés c...

matériels

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Airpump	petsmart	5094984	This can be used in the tank to circulate air
Airstones	petsmart	5149683	This can be used in the tank to circulate air
D-glucose	Sigma	G8270-5KG
D-mannitol	Acros Organics	AC125340050
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