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Résumé

Dans un modèle d’excitotoxicité de C. elegans , ce protocole utilise l’imagerie in vivo pour analyser la régulation de la neurodégénérescence nécrotique, l’effet des gènes codant pour des médiateurs candidats et l’implication des mitochondries. La dissociation et le tri cellulaires sont utilisés pour obtenir spécifiquement des neurones à risque pour l’analyse transcriptomique spécifique des cellules de la neurodégénérescence et des mécanismes de neuroprotection.

Résumé

La nécrose excitotoxique est l’une des principales formes de neurodégénérescence. Ce processus de nécrose régulée est déclenché par l’accumulation synaptique du neurotransmetteur glutamate et la stimulation excessive de ses récepteurs postsynaptiques. Cependant, on manque d’informations sur les événements moléculaires ultérieurs qui aboutissent à la morphologie distincte du gonflement neuronal de ce type de neurodégénérescence. D’autres aspects, tels que les modifications de compartiments subcellulaires spécifiques, ou la base de la vulnérabilité cellulaire différentielle de sous-types neuronaux distincts, restent sous-explorés. De plus, une série de facteurs qui entrent en jeu dans les études utilisant des préparations in vitro ou ex vivo pourraient modifier et fausser la progression naturelle de cette forme de neurodégénérescence. Il est donc important d’étudier la nécrose excitotoxique chez les animaux vivants en surveillant les effets des interventions qui régulent l’étendue de la nécrose neuronale dans le système modèle génétiquement amentable et transparent du nématode Caenorhabditis elegans. Ce protocole décrit des méthodes d’étude de la nécrose excitotoxique dans les neurones de C. elegans , en combinant l’analyse optique, génétique et moléculaire. Pour induire des conditions excitotoxiques chez C. elegans, l’inactivation d’un gène de transport du glutamate (glt-3) est combinée à un fond génétique neuronal sensibilisant (nuls5 [Pglr-1 ::GαS(Q227L)]) pour produire une hyperstimulation et une neurodégénérescence du récepteur du glutamate. La microscopie à contraste interférentiel différentiel (CID), la microscopie fluorescente et la microscopie confocale chez les animaux vivants sont des méthodes utilisées pour quantifier la neurodégénérescence, suivre la localisation subcellulaire des protéines marquées par fluorescence et quantifier la morphologie mitochondriale dans les neurones en dégénérescence. Le tri cellulaire activé par fluorescence neuronale (FACS) est utilisé pour trier distinctement les neurones à risque pour l’analyse transcriptomique spécifique au type de cellule de la neurodégénérescence. Une combinaison de méthodes d’imagerie en direct et de FACS ainsi que les avantages de l’organisme modèle C . elegans permettent aux chercheurs de tirer parti de ce système pour obtenir des données reproductibles avec une grande taille d’échantillon. Les résultats de ces tests pourraient se traduire par de nouvelles cibles pour l’intervention thérapeutique dans les maladies neurodégénératives.

Introduction

L’excitotoxicité est la principale cause de mort neuronale dans l’ischémie cérébrale et un facteur contributif dans de multiples maladies neurodégénératives 1,2,3,4,5,6,7,8,9. La perturbation du flux sanguin oxygéné vers le cerveau (par exemple, en raison d’un caillot sanguin) entraîne le dysfonctionnement des transporteurs de glutamate, entraînant une accumulation de glutamate dans la synapse. Cet excès de glutamate suractive les récepteurs post-synaptiques du glutamate (GluR), conduisant à un afflux excessif (catalytique, non stœchiométrique) de Ca2+ dans les neurones (Figure 1A). Cet afflux préjudiciable conduit à une neurodégénérescence postsynaptique progressive qui, morphologiquement et mécaniquement, va de l’apoptose à la nécrose régulée 10,11,12. Bien qu’ils aient été basés sur des interventions réussies dans des modèles animaux, de multiples essais cliniques d’antagonistes de GluR qui cherchaient à bloquer l’entrée de Ca2+ et à promouvoir la viabilité cellulaire ont échoué dans le cadre clinique 13,14,15,16. Un facteur critique probable de ces échecs est le fait que (contrairement aux modèles animaux) le traitement en milieu clinique est administré des heures après le début de l’AVC, ce qui fait que l’intervention bloque les mécanismes neuroprotecteurs à action tardive, tout en omettant d’interrompre la signalisation dégénérative en aval de GluRs 14,16,17. Une approche alternative, basée sur la thrombolyse, ne peut être administrée que dans une fenêtre de temps sévèrement restreinte, laissant de nombreux patients (qui souffrent d’un AVC à domicile avec un moment d’apparition difficilement identifiable) incapables d’en bénéficier17. Ces revers soulignent la nécessité de concentrer la recherche sur l’excitotoxicité sur l’étude des événements survenant après l’hyperstimulation de GluR et de différencier les cascades dégénératives ultérieures des processus neuroprotecteurs concomitants. Cette approche peut aider à prévenir les dommages cellulaires et à identifier des cibles médicamenteuses efficaces qui peuvent être administrées plus tard après l’apparition des dommages.

Une approche pour identifier les événements ultérieurs de l’excitotoxicité consiste à étudier les mécanismes de signalisation de la mort cellulaire en aval de l’hyperstimulation de GluR, tels que ceux conduisant à l’effondrement mitochondrial. Un dysfonctionnement drastique de la physiologie et de la dynamique mitochondriales est une caractéristique de la neurodégénérescence, comme on le voit dans l’excitotoxicité 18,19,20. Alors que toutes les cellules dépendent de la fonction mitochondriale et de leur disponibilité pour la survie, l’activité et le maintien cellulaire, les neurones sont particulièrement dépendants de la production d’énergie mitochondriale pour soutenir la transmission et la propagation du signal. Plus précisément, les neurones dépensent ~50 % de leur consommation d’énergie liée à la signalisation pour restaurer le potentiel membranaire au repos suite à l’activation des récepteurs/canauxpostsynaptiques 21, avec une forte dépendance à l’oxygène et au glucose. La disponibilité réduite du glucose et de l’oxygène observée lors d’un accident vasculaire cérébral entraîne de graves altérations mitochondriales, entraînant une réduction supplémentaire de la production d’ATP 19,22,23,24. Cependant, les études visant à identifier la séquence d’événements qui ont conduit à l’effondrement mitochondrial ont produit des résultats controversés et n’ont pas fait l’objet d’un consensus. L’analyse de la morphologie mitochondriale peut aider à comprendre ces événements conduisant à la pathologie mitochondriale car c’est un bon indicateur de la santé neuronale 25,26,27,28,29. Les mitochondries filamenteuses sont représentatives d’un neurone sain, tandis que les mitochondries fragmentées révèlent des dommages neuronaux importants qui pourraient conduire à la mort cellulaire. L’analyse de la morphologie mitochondriale chez des animaux vivants dans différentes conditions génétiques peut aider à se concentrer sur des gènes et des voies spécifiques impliqués dans la neurodégénérescence dépendante des mitochondries dans l’excitotoxicité.

Une autre approche pour identifier les événements ultérieurs qui pourraient réguler l’étendue de la neurodégénérescence excitotoxique consiste à étudier les mécanismes neuroprotecteurs transcriptionnels qui atténuent certains des effets de l’excitotoxicité14,16. Cependant, le manque de spécificité des facteurs de transcription neuroprotecteurs clés et la divergence des configurations expérimentales entravent le succès des efforts visant à identifier clairement les programmes neuroprotecteurs de base (en particulier dans la nécrose régulée).

Par conséquent, l’étude des voies de signalisation de la mort en aval et l’étude de la neuroprotection transcriptionnelle dans l’excitotoxicité ont rencontré de grandes difficultés et des désaccords sur les résultats observés. Une grande partie de cette controverse est susceptible de provenir de l’utilisation de modèles d’excitotoxicité ex vivo ou in vitro, et de la variabilité introduite par la spécificité des différents dispositifs expérimentaux. Il est donc très bénéfique de se concentrer sur l’identification des mécanismes centraux qui sont hautement conservés et de les étudier in vivo. Le système modèle simple du nématode C. elegans offre une option particulièrement efficace, en raison de la puissante combinaison d’outils de recherche particulièrement puissants et diversifiés, de la conservation des principales voies de mort cellulaire et de la richesse des informations sur la structure et la connectivité de son système nerveux 30,31,32,33. En effet, les travaux fondateurs du laboratoire Driscoll sur l’analyse génétique de la neurodégénérescence nécrotique dans les neurones mécanosensoriels sont une excellente démonstration de la puissance de cette approche34. Il est important de noter que pour l’analyse de l’excitotoxicité, la conservation des voies de signalisation chez le nématode comprend tous les composants majeurs de la neurotransmission glutamatergique35,36.

Le modèle d’excitotoxicité des nématodes s’appuie sur ces études fondamentales, permettant au chercheur d’étudier des processus biochimiques similaires à ceux qui se produisent lors des accidents vasculaires cérébraux et d’autres maladies neurodégénératives affectées par la neurotoxicité dépendante du glutamate. Pour induire des conditions excitotoxiques chez C. elegans, cette approche expérimentale utilise une souche d’excitotoxicité qui est la combinaison d’un knock-out d’un gène de transport du glutamate (glt-3) et d’un fond génétique neuronal sensibilisant (nuls5 [Pglr-1 ::GαS(Q227L)]) pour produire une hyperstimulation et une neurodégénérescence de GluR37. Cette souche d’excitotoxicité expose 30 neurones spécifiques (exprimant glr-1) qui sont postsynaptiques aux connexions glutamatergiques à la neurodégénérescence excitotoxique. Sur ces 30 neurones à risque, les neurones individuels subissent une nécrose au fur et à mesure que l’animal progresse dans le développement (avec une stochasticité mixte et une préférence partielle pour certains neurones spécifiques38), tandis que dans le même temps, les cadavres cellulaires sont progressivement éliminés. En combinaison avec l’accessibilité de nombreuses souches mutantes, cette approche permet d’étudier de multiples voies qui affectent la neurodégénérescence et la neuroprotection. Ces approches ont déjà été utilisées pour analyser certaines des cascades de signalisation de la mort en aval39 et des régulateurs transcriptionnels de la neurodégénérescence excitotoxique dans l’excitotoxicité38,40. Comme d’autres cas de neurodégénérescence nécrotique chez le ver41, la neurodégénérescence excitotoxique du nématode n’implique pas l’apoptose classique40.

Cet article décrit le système de base pour induire, quantifier et manipuler la neurodégénérescence nécrotique excitotoxique chez C. elegans. De plus, il décrit deux protocoles principaux qui sont actuellement utilisés pour rationaliser les études sur des aspects spécifiques de l’excitotoxicité des nématodes. En utilisant des rapporteurs fluorescents et l’imagerie in vivo en direct, le chercheur peut étudier l’implication mitochondriale et la dynamique dans le modèle de nématode de neurodégénérescence excitotoxique. Pour déterminer l’effet de facteurs de transcription neuroprotecteurs spécifiques, l’investigateur peut utiliser l’expression spécifique du type cellulaire de marqueurs fluorescents, la dissociation des animaux en cellules uniques et la FACS pour isoler des neurones spécifiques qui présentent un risque de nécrose par excitotoxicité. Ces neurones isolés spécifiques au type cellulaire peuvent ensuite être utilisés pour le séquençage de l’ARN dans des souches qui hébergent des mutations dans des facteurs de transcription clés. Ensemble, ces méthodes peuvent permettre aux chercheurs de démêler les fondements moléculaires de la neurodégénérescence excitotoxique et de la neuroprotection in vivo avec une grande clarté et précision.

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Protocole

1. Souches utilisées pour étudier la neurodégénérescence excitotoxique et la neuroprotection

  1. Utilisez la souche d’excitotoxicité du nématode ZB1102 comme point de référence pour la neurodégénérescence excitotoxique standard.
    REMARQUE : L’excitotoxicité dépendante du glutamate chez C. elegans est produite dans la souche ZB1102 en combinant un knock-out (ko) d’un transporteur de glutamate avec un transgène qui sensibilise les neurones de ces animaux à la neurotoxicité et est exprimé dans un sous-ensemble de connexions postsynaptiques à glutamatergiques37. Cette combinaison génétique est appelée souche d’excitotoxicité du nématode, et elle est disponible gratuitement auprès du Centre de génétique de Caenorhabditis (CGC).
  2. Pour étudier l’effet des gènes codant pour des régulateurs candidats de la nécrose excitotoxique, combinez une mutation dans ces gènes (par exemple, dapk-1 ou crh-1) avec la souche d’excitotoxicité du nématode.
  3. Effectuer des croisements génétiques selon les méthodes standard de C. elegans 30, comme indiqué aux wormbook.org42 et 43.
  4. Étant donné que la base moléculaire de la mutation est généralement documentée, suivez la descendance croisée en génotypage du locus spécifique à l’aide de la PCR. Différencier WT vs mutant par la taille des fragments (pour les délétions ou le séquençage (pour les mutations ponctuelles).
    REMARQUE : Le tableau 1 présente les souches qui ont été utilisées pour étudier les voies distinctes de neurodégénérescence et de neuroprotection, spécifiquement pour ce protocole.
  5. Dérivez toutes les souches critiques par deux lignées indépendantes et testez-les séparément pour confirmer la validité du phénotype observé.

2. Milieux de croissance et élevage

  1. Faire pousser les vers à 16-25 °C sur des plaques NGM standard30, 37, 42 ou des plaques MYOB38, 44 ensemencées avec OP50 E. coli selon les méthodes standard.
    REMARQUE : Les plaques MYOB donnent des résultats identiques à ceux des plaques NGM mais sont légèrement plus faciles à préparer.
  2. Maintenez les souches expérimentales constamment bien nourries.
    REMARQUE : La famine peut affecter la neurodégénérescence et réduire le nombre de neurones de la tête mourants. Si les vers sont mal nourris ou affamés, placez-les sur des assiettes fraîches et attendez quelques générations avant de poursuivre les expériences. L’effet transgénérationnel de la famine s’estompera après quelques générations.

3. Quantification des neurones de la tête en dégénérescence par contraste interférentiel différentiel (CID) et scoring de Nomarski

  1. Utiliser la souche d’excitotoxicité du nématode (ZB1102 : glt-3(bz34) IV ; nuIs5 V) comme témoin expérimental pour la quantification, représentant des niveaux d’excitotoxicité normaux. Le protocole ne suit pas le même animal à travers différents stades de développement. Au lieu de cela, il donne un aperçu d’une population d’animaux à des stades mixtes, de sorte qu’au total, on recueille des informations auprès de différents animaux pour représenter tous les stades de développement.
    REMARQUE : Le transgène nuls5[Pglr-1 ::GαS(Q227L). Pglr-1 ::GFP]45 (qui exprime un Gαs et une GFP activés dans les neurones postsynaptiques aux connexions glutamatergiques) produit un niveau de neurodégénérescence nécrotique indépendant du GluR de ~1 neurone/animal mourant (à un moment donné du développement). L’ajout de glt-3 (ko) augmente la neurodégénérescence nécrotique des neurones postsynaptiques exprimant nuIs5 de manière dépendante de GluR, allant jusqu’à 4-5 neurones de la tête/animal mourants au troisième stade larvaire (L3)37.
  2. Pour les souches d’essai, utiliser des animaux issus d’un croisement génétique récemment achevé ou décongeler des souches d’intérêt provenant de stocks congelés à -80 °C préparés à partir de croisements frais. Attendre quelques générations (≥4) avant de noter un phénotype et une neurodégénérescence.
  3. Coupez et retirez un petit morceau de gélose d’une plaque d’une population de stades mixtes d’animaux bien nourris, et montez-le sur une lamelle en retournant le morceau de gélose, de sorte que les animaux qui rampaient à la surface de la gélose fassent maintenant face à la lamelle.
    REMARQUE : Les animaux peuvent toujours bouger, mais sont maintenant quelque peu retenus et peuvent être observés sans anesthésie. Un tel morceau peut être utilisé pendant ~1 heure avant de le remplacer par un nouveau.
  4. À l’aide d’une lunette DIC inversée avec un oculaire x10 et un objectif x40 ou x63, scannez les animaux au hasard en faisant glisser la lamelle manuellement. Alors que les autres étapes d’imagerie décrites ci-dessous peuvent être effectuées sur des microscopes inversés ou droits, l’examen des vers dans le morceau de gélose nécessite une lunette inversée.
  5. Identifiez le stade de développement de chaque animal par la forme de son utérus (voir les schémas de l’utérus en wormbook.org).
  6. Pour chaque animal, notez son stade de développement et le nombre de neurones mourants (c’est-à-dire vacuolisés). Comptez et enregistrez le nombre total de neurones mourants dans la tête, le nombre de neurones mourants dans le ganglion rétrovésiculaire (ce qui permet d’identifier facilement des cellules spécifiques) et le nombre de neurones mourants dans la queue (qui n’est pas affecté par le glutamate et sert de contrôle interne, confirmant que le transgène sensibilisant nuIs5 est pleinement actif).
  7. Consigner ces données dans un tableau où les animaux d’une souche donnée sont regroupés par catégories de stade de développement.
  8. Dans chaque session, collectez des données au hasard auprès de vers de plusieurs stades de développement ; Effectuez plusieurs sessions de notation sur plusieurs jours afin de collecter suffisamment de données pour l’analyse statistique. Enregistrez les niveaux de neurodégénérescence à plusieurs stades et construisez un graphique à barres similaire à la figure 1C.
    REMARQUE : Cette méthode permettra de déterminer si un certain traitement ou mutation augmente/diminue les niveaux de neurodégénérescence à tous les stades (décalage de la distribution vers le haut/bas) ou déplace le pic de neurodégénérescence à un stade de développement plus précoce ou plus tardif (décalage de la distribution gauche/droite).
  9. Effectuer la collecte de données sans connaître l’identité du génotype. Confirmer la lignée génétique dans deux isolats indépendants (afin de réduire au minimum le risque d’effets non intentionnels d’autres différences génétiques ou de différences génétiques inattendues entre les isolats) et regrouper les données aux fins d’analyse.
  10. Dans chaque souche, calculez la moyenne et le SEM du nombre de neurones en dégénérescence dans la tête (y compris le ganglion rétrovésiculaire) à chaque stade de développement (Figure 1D). Effectuez une analyse similaire des neurones du ganglion rétrovésiculaire et de la queue mourants, si nécessaire.

4. Identification de neurones de tête spécifiques en dégénérescence

  1. Montez des animaux individuels (ou de petits groupes d’animaux) sur un tampon de gélose46 et paralysez le ver avec du tétramisole (voir ci-dessous, section 5).
  2. Avec une fluorescence combinée et un endoscope DIC (droit ou inversé), localisez des neurones vacuolisés spécifiques.
  3. Déterminez l’identité neuronale spécifique du neurone vacuolisé en suivant ses processus marqués GFP et en comparant l’emplacement du corps cellulaire et la forme des processus à ceux des neurones connus pour exprimer glr-1 à l’aide de WormAtlas47.
    REMARQUE : Alternativement, l’identification peut être assistée par de nouvelles méthodes pour identifier rapidement les neurones par marquage multicolore qui seront bientôt disponibles dans le laboratoire Hobert48.

5. Imagerie en direct de la morphologie mitochondriale neuronale par microscopie fluorescente de souches rapporteures

  1. Pour l’imagerie des changements mitochondriaux dans les neurones postsynaptiques en dégénérescence (qui sont marqués avec la GFP cytoplasmique dans la souche d’excitotoxicité d’origine), examinez la fluorescence mito-mCherry.
  2. Croiser la souche d’excitotoxicité d’essai avec des souches qui marquent les mitochondries des neurones postsynaptiques avec une fluorescence rouge (en exprimant une fusion entre la protéine fluorescente et la protéine N-terminale de TOM-20 sous le promoteur glr-1 ; pour plus de détails sur les constructions et les souches, voir49). Les animaux peuvent maintenant être imagés à l’aide d’un microscope à épifluorescence ordinaire (droit ou inversé) ou d’un microscope confocal.
  3. Pour paralyser le ver sans affecter la survie neuronale, pipeter 5 μL de tétramisole de 10 mM sur un tampon d’agarose fraîchement préparé. Voir Arnold et al.46 pour le protocole détaillé sur la préparation des tampons.
  4. Placez les animaux au centre de la chute de tétramisole et montez-les avec une lamelle.
  5. Scellez les côtés de la lamelle avec du vernis à ongles et laissez le vernis à ongles sécher.
  6. Dans les 20 minutes suivant le traitement au tétramisole et à l’aide d’une lunette avec imagerie DIC et fluorescence, localisez les vers à l’aide d’une lentille d’objectif 20x.
  7. Une fois que la tête du ver est localisée (ou les neurones d’intérêt), passez à un objectif d’huile 100x et concentrez-vous sur le marquage par fluorescence des mitochondries dans le soma.
  8. Capturez des images Z-stack à l’aide des paramètres de filtre DIC, GFP et TxRed.

6. Notation et quantification de la morphologie des mitochondries neuronales

  1. Analysez la morphologie mitochondriale soit pendant l’imagerie en direct du ver, soit après l’acquisition d’images à l’aide d’ImageJ ou d’un autre logiciel d’imagerie.
  2. Pour faciliter l’identification et l’analyse répétée de neurones spécifiques, identifiez les trois neurones du ganglion rétrovésiculaire, RIGL/R et AVG (dans certains cas, seuls deux sont présents en raison de l’élimination du cadavre cellulaire dans l’excitotoxicité).
  3. Catégorisez les mitochondries en trois groupes principaux : filamenteuses, intermédiaires et fragmentées 50,51,52.
    REMARQUE : Les mitochondries filamenteuses apparaissent comme des structures minces continues dans le soma des neurones, entourant généralement le noyau. Les mitochondries intermédiaires apparaissent comme une combinaison d’au moins un réseau filamenteux apparent, bien qu’avec des cassures, et une certaine fragmentation dans le soma. Les mitochondries fragmentées présentent des ruptures complètes dans le réseau mitochondrial, ont un aspect gonflé et sont dispersées dans tout le soma (Figure 2A).
  4. Pour chaque ver, notez le pourcentage de neurones avec des mitochondries filamenteuses, intermédiaires ou fragmentées pour un total d’au moins 30 vers.
  5. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’une ANOVA à un facteur suivie d’un test de Tukey a posteriori pour chaque morphologie mitochondriale entre les souches53.

7. Préparation du tampon et du réactif pour la dissociation des vers pour le FACS des neurones à risque de neurodégénérescence

  1. Préparez le tampon M9 comme suit : 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, H2O à 1 L. Stériliser à l’autoclave. Ajouter 1 mL de 1 M de MgSO4 stérilisé par filtre. Conserver à température ambiante.
  2. Préparez le tampon d’œufs comme suit : 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 ; autoclave pour stériliser. Ajouter 2 M de solution mère HEPES pH 7,3 (préalablement filtrée avec un filtre à bouteille de 0,2 μm) à une concentration finale de 25 m. Ajustez le pH à 7,3 avec 1 N NaOH (pas plus de 10 ml). Utilisez un osmomètre pour vous assurer que l’osmolarité finale est comprise entre 335 et 345 mOsm. Filtre : stérilisez le tampon d’œufs avec des filtres de 0,2 μm. Conserver à 4 °C.
    REMARQUE : Les sels se dissolvent plus facilement lors de l’utilisation de MgCl2 ·6H2O et CaCl2·2H2O pour former des solutions mères respectives de MgCl2 et CaCl2 . Vous pouvez également faire un stock de 10x tampon d’œufs et le diluer si nécessaire dans de l’eau déminéralisée stérile.
  3. Préparez la FDS-DTT comme suit : 20 mM HEPES pH 8,0, 0,25 % SDS, 200 mM DTT, 3 % de saccharose. Dans une hotte de culture tissulaire, stérilisez le SDS-DTT avec un filtre à seringue de 0,2 μm. Stocker 300 μL d’aliquotes à -20 °C recouvertes d’une feuille d’aluminium pour les protéger de la lumière.
  4. Préparez la solution de pronase comme suit : préparez le jour de la dissociation 15 mg/mL de pronase dans un tampon d’œuf. Conserver sur de la glace.

8. Synchronisation de l’âge pour le FACS spécifique aux neurones

  1. Utiliser des animaux qui combinent le génotype de l’excitotoxicité (et d’autres mutations, au besoin) avec l’expression transgénique d’un marqueur fluorescent fort qui peut être facilement utilisé pour le tri (p. ex., FJ1244 : pzIs29 [Pglr-1 ::NLS ::LAC-Z ::GFP ::glr-1 3'UTR] X)54. Faites pousser les animaux sur deux ou trois plaques NGM/MYOB de 100 mm à 20 °C jusqu’à ce que la plaque soit remplie de vers principalement gravides.
  2. Lavez les vers des plaques à l’aide du tampon M9. Transférez les vers dans des tubes coniques de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique en verre de 10 mL.
  3. Centrifuger à température ambiante pendant 2,5 min à 250x g et retirer le surnageant.
  4. Remettre la pastille de ver en suspension dans 10 mL de solution d’eau de Javel (2 % de NaOH 10 N et 5 % d’eau de Javel domestique fraîche dans de l’eau déminéralisée stérile).
  5. Placez les tubes sur un shaker horizontalement, balancez-les à basse vitesse. Assurez-vous que les vers ne se déposent pas au fond du tube. L’eau de Javel ouvre la cuticule du ver mais n’affecte pas les embryons, qui sont protégés par la coquille de l’œuf.
    1. Cette étape de blanchiment prend environ 5 minutes, mais cela varie. Pour éviter un blanchiment excessif, surveillez le processus en prélevant un échantillon toutes les minutes : pipetez doucement 10 μL de chaque tube sur une lame de microscope en verre et examinez les vers à l’aide d’un microscope à dissection.
  6. Une fois que la plupart des vers gravides sont ouverts mais pas complètement dissous, arrêtez l’étape de blanchiment en remplissant les tubes coniques avec un tampon à œufs.
  7. Pour récupérer les ovules/embryons, centrifugez les tubes à 250x g pendant 2,5 min, retirez le surnageant et lavez-les à nouveau avec un tampon à œufs.
  8. Répétez quatre autres lavages.
  9. Remettre les œufs en suspension en pipetant doucement la pastille et les étaler sur quatre plaques NGM/MYOB de 100 mm. Laissez les embryons éclore et grandir à 20 °C pendant 3 jours.
    REMARQUE : Les plaques devraient maintenant être pleines de vers principalement gravides.
  10. Répétez la synchronisation de l’âge en répétant ce protocole de synchronisation bleach/age.
  11. Pipetez les œufs sur huit plaques NGM/MYOB de 100 mm. Laissez l’animal éclore et grandir à 20 °C jusqu’au stade larvaire souhaité.

9. Dissociation des cellules du ver entier pour le FACS

  1. Cultivez des vers synchronisés jusqu’au stade de développement souhaité. Rincez délicatement les plaques de 100 mm avec un tampon M9 et des pipettes sérologiques en verre et transférez-les dans des tubes coniques de 50 ml.
  2. Ajouter du M9 froid jusqu’à 45 ml. Placez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes pour permettre aux vers de se déposer au fond par gravité, tandis que les débris bactériens résiduels des plaques flotteront dans le surnageant.
  3. Retirez le surnageant et lavez les vers avec du M9 frais.
  4. Répétez l’opération de gravité de 30 minutes sur la glace.
  5. Retirez le surnageant, ajoutez M9 jusqu’à 45 ml et centrifugez à 250 x g pendant 5 minutes.
  6. Transférez la pastille dans un tube de microcentrifugation et ajoutez M9 jusqu’à 1 ml.
  7. Faites tourner à 14 000 tr/min sur une centrifugeuse de table pendant 1 min et retirez le surnageant.
  8. Pour perturber la cuticule, remettez la pastille de ver en suspension avec SDS-DTT en utilisant (environ) deux fois le volume de la pastille, et incubez à bascule à température ambiante pendant 4 minutes pour les stades L2-adultes.
    REMARQUE : Ne dépassez pas 4 minutes d’incubation dans le SDS-DTT car le signal protéique fluorescent diminuera considérablement avec un traitement SDS-DTT plus long. Étant donné que le SDS-DTT est sensible à la lumière, il ne doit pas avoir plus de 3 mois, car la solution peut avoir perdu de sa puissance avec le temps ; Les dissociations fonctionnent mieux avec une solution SDS-DTT récemment préparée.
  9. Ajouter 1 tampon pour œufs (pH 7,3, 335-345 mOsm) jusqu’à 1 mL pour arrêter le traitement SDS-DTT.
  10. Faites tourner à 14 000 tr/min sur une centrifugeuse de table pendant 1 minute et retirez le surnageant.
  11. Pour perturber davantage la cuticule et dissocier les cellules des animaux, remettez en suspension la pastille avec une solution de pronase à température ambiante, en utilisant le triple du volume de la pastille.
  12. Incuber à température ambiante pendant 15-30 min.
  13. Pipeter vers le haut et vers le bas 40 fois toutes les 5 minutes avec une pipette P-200 ou P-1000, en touchant le bas du tube avec la pointe de la pipette.
    REMARQUE : La pression créée par la pointe touchant le fond du tube facilite la dissociation des vers. Utilisez une pointe filtrante pour que les vers ne pénètrent pas accidentellement dans l’arbre de la pipette lors du pipetage rapide.
  14. Après 15 min, vérifiez la progression de la dissociation du ver en pipetant doucement 5μL sur une lame de verre et en observant la progression sous un microscope à dissection. Lorsque la plupart (~90 %) des vers intacts ont éclaté, le processus est terminé.
    REMARQUE : L’incubation de la pronase peut être prolongée si de nombreux vers restent intacts.
  15. Dans une hotte de culture cellulaire, ajoutez 1 tampon d’œufs jusqu’à 1,5 mL pour arrêter le traitement par pronase.
  16. Transférer dans des tubes FACS, ajouter 5 ml de tampon à œufs et tourner à 800 x g pendant 5 min.
  17. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 3 ml de tampon à œufs.
  18. Placez un capuchon de crépine de 70 μm sur les nouveaux tubes FACS, une suspension de cellule de pipette sur la crépine et faites tourner à 800 x g pendant 1 min. Recueillir la suspension de la cellule d’efflux.
  19. Placez un capuchon de crépine de 5 μm sur les nouveaux tubes FACS, une suspension de cellule de pipette sur la crépine et faites tourner à 800 x g pendant 1 min.
  20. Ajouter le DAPI pour une concentration finale de 0,5 μg/mL dans le tampon à œufs, placer sur de la glace avec un couvercle/couvercle pour protéger de la lumière.
  21. Effectuez le FACS dès que possible. Le signal des protéines fluorescentes diminue avec le temps et l’exposition à la lumière, il est donc important d’effectuer le protocole de dissociation le plus rapidement possible et d’effectuer le FACS immédiatement après la fin de la dissociation.
    REMARQUE : Le protocole de dissociation des vers a été adapté des protocoles du laboratoire Miller55, 56, 57, du laboratoire Murphy58 et du laboratoire Shaham59.

10. Modifications du fonctionnement de la machine FACS pour l’identification des neurones de C. elegans

  1. Utilisez 4 litres de tampon à œufs réfrigéré (4 °C) au lieu du liquide de gaine standard lors du tri des neurones de C. elegans .
    REMARQUE : L’osmolarité des cellules de C. elegans est beaucoup plus élevée que celle des cellules de mammifères et le liquide de gaine standard fera éclater les neurones. Tous les réglages et étalonnages de la machine sont effectués après l’ajout du tampon d’œufs, car la viscosité du tampon d’œufs est différente de celle du liquide de gaine standard. Le technicien de tri fera passer les billes de diagnostic dans la machine pour s’assurer que les lasers fonctionnent correctement.
  2. Lorsque des neurones triés doivent être utilisés dans des études transcriptomiques ultérieures, trier un minimum de 100 000 cellules GFP+ directement dans 800 μL de Trizol-LS + 10 μL d’inhibiteur de RNase.
  3. Inverser les cellules de Trizol 15 fois pour mélanger.
  4. Congelez-le dans un bain de glace sèche ou d’éthanol et conservez-le à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à extraire l’ARN de tous les échantillons pour une expérience de séquençage de l’ARN.
    REMARQUE : Bien que la plupart des cellules triées soient collectées directement dans Trizol pour l’analyse du transcriptome, assurez-vous de récupérer un petit échantillon de cellules triées GFP+ (de chaque souche) collectées dans le tampon d’œufs, pour la validation microscopique de l’efficacité du tri.

11. Stratégie de contrôle FACS

  1. Pour identifier le signal positif GFP, utilisez le laser 488 nm avec le filtre 530/30 et le passe-long 502 (LP).
  2. Pour identifier les cellules positives et négatives DAPI, utilisez le laser 405 nm avec le filtre 450/50.
  3. Pour identifier les cellules auto-fluorescentes qui pourraient être confondues avec des cellules positives à la GFP, utilisez le laser 488 nm avec le filtre 610/20 et 595 LP (communication personnelle, Stanka Semova, responsable des opérations, Centre de ressources en cytométrie en flux, Université Rockefeller).
  4. Exécutez une stratégie de contrôle standard et supprimez les événements avec une grande zone de diffusion latérale (SSC-A) et une petite zone de diffusion vers l’avant (FSC-A), qui sont susceptibles de représenter des amas de cellules et de débris.
  5. Isolez les maillots de dispersion de l’avant-propos, puis les maillots de dispersion latérale.
  6. Isolez les cellules avec un signal GFP élevé et un signal d’autofluorescence faible.
    REMARQUE : Les cellules à haute autofluorescence et à faible GFP ne sont pas de vraies cellules GFP positives.
  7. Le seuil pour la porte GFP+ est déterminé en comparant les cellules GFP- (c’est-à-dire N2) aux cellules GFP+55,56.
  8. Supprimez toutes les cellules mortes avec une porte vivante/morte, en fonction de la perméabilité sélective du DAPI aux cellules mortes : Le seuil pour la porte morte vivante est déterminé en comparant les cellules non colorées aux cellules colorées au DAPI.
    REMARQUE : Lorsque vous triez plusieurs échantillons, rincez le flux entre les échantillons pour vous assurer qu’il n’y a pas de contamination croisée.

12. Microscopie de neurones triés pour valider l’efficacité de la stratégie de porte FACS

  1. Dessinez un cercle sur une lame de microscope en verre à l’aide d’un stylo hydrofuge.
  2. Pipette 10 μL de cellules triées en suspension dans un tampon d’œufs à l’intérieur du cercle. Placez une lamelle sur l’échantillon et scellez-la avec du vernis à ongles sur le pourtour de la lamelle.
  3. Une fois que le vernis à ongles a séché, vérifiez au microscope fluorescent vertical/inversé que les cellules triées sont bien principalement des cellules GFP +.
    REMARQUE : Effectuez cette vérification après chaque session de tri pour valider la stratégie de contrôle FACS57.

13. Extraction d’ARN et quantification de la qualité de l’ARN sur un système d’électrophorèse automatisé de contrôle de la qualité

REMARQUE : Tous les travaux sur l’ARN doivent être exécutés avec un soin extrême pour éviter la contamination par la RNase (y compris la préparation minutieuse des réactifs, des consommables et des meilleures pratiques sans danger pour la RNase).

REMARQUE : Effectuer toutes les étapes où les échantillons contiennent du phénol et/ou du chloroforme dans une hotte.

  1. Décongeler les flacons de cellules dans Trizol à température ambiante.
  2. À l’aide d’une pointe de pipette P200, pipette de haut en bas plusieurs fois pour homogénéiser l’échantillon.
  3. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
  4. Ajouter 0,2 mL de chloroforme pour 1 mL de réactif Trizol utilisé pour la lyse, puis bien boucher le tube.
  5. Retournez les tubes 15 fois et incubez (à 20-25 °C) pendant 2-3 minutes.
  6. Centrifuger l’échantillon pendant 15 minutes à 12 000 × g à 4 °C. Le mélange se sépare en une phase inférieure inférieure de phénol-chloroforme, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore.
  7. Prélever exclusivement la phase aqueuse supérieure contenant l’ARN et transférer dans un nouveau tube de 1,5 mL à faible liaison ADN/ARN.
    REMARQUE : Dans certains cas, si le rapport entre les cellules du tampon d’œufs qui sont tombées du trieur de cellules dans Trizol est supérieur à un rapport échantillon :Trizol-LS de 1:3, la teneur élevée en sel du tampon d’œufs peut entraîner l’inversion des couches ; si cela se produit, ajoutez plus de Trizol-LS et répétez l’inversion et la centrifugation. Cela peut également être évité si vous tenez compte de l’augmentation du volume d’échantillon après le tri ; si le rapport 1:3 n’est pas maintenu, ajoutez suffisamment de trizol avant de commencer l’extraction de l’ARN.
  8. Pour purifier davantage l’ARN, utilisez la chimie de la colonne d’extraction de l’ARN.
  9. Utilisez le système d’électrophorèse automatisé du contrôle de la qualité pour mesurer l’indice d’intégrité de l’ARN (RIN) et confirmer un RIN d’ARN de 8,0 ou plus pour les expériences de séquençage de l’ARN ultérieures.

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Résultats

Modèle d’excitotoxicité par nématode et identification des neurones dégénératifs vacuolisés
Les données présentées ici sont reproduites à partir de publications précédentes37,38. Pour imiter la neurodégénérescence induite par l’excitotoxicité, l’inactivation d’un gène de transport du glutamate (glt-3) est associée à un fond transgénique neu...

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Discussion

Alors que les controverses et les échecs répandus suggèrent que l’excitotoxicité présente un processus exceptionnellement difficile à déchiffrer, l’analyse de l’excitotoxicité chez le nématode offre une stratégie particulièrement attrayante pour éclairer les voies de mort des cellules neuronales conservées dans cette forme critique de neurodégénérescence. L’investigateur peut s’appuyer sur la riche collection d’outils de recherche disponibles dans ce système,...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions tous les membres du laboratoire Mano et du laboratoire Li (actuels et récents) pour leur aide et leur soutien. Nous remercions la Dre Monica Driscoll (Rutgers Univ.) d’avoir été la pionnière de l’analyse de la neurodégénérescence nécrotique chez les nématodes et d’avoir fourni un soutien continu ; Dr Chris Li (CCNY) pour son soutien et ses conseils ; Jeffery Walker (CCNY Flow Cytometry Core), le Dr Bao Voung (CCNY) et Stanka Semova (Rockefeller Univ. Sorting Faculty Core) pour leur soutien pratique et leurs conseils sur le tri cellulaire ; Dr Chris Rongo (Rutgers Univ.) pour les réactifs ; Drs David Miller (Université Vanderbilt), Coleen Murphy (Université de Princeton), Shai Shaham, Menachem Katz et Katherine Varandas (tous trois de l’Université Rockefeller) pour les protocoles de dissociation de C. elegans.

Le laboratoire Mano a reçu un financement du NIH NINDS (NS096687, NS098350, NS116028) à I.M., et par le biais d’un partenariat NIH U54 CCNY-MSKCC (CA132378/CA137788).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
BleachAny household
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
CholesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Dry iceUnited City Ice Cube
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Ethanol (100%)VWREM-EX0276-1S
Ethanol (90%)VWRBDH1160-4LP
FACS tubesUSA Sci1450-2810
Filter tips USA Sci1126-7810
Glass 10 mL serological pipettes USA Sci1071-0810
Heating block BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Immersion Oil - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
IsopropanolVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL tubesUSA Sci4043-1021
Metamorph Imaging SoftwareMolecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
Microscope, Confocal, for Fluorescence ImagingZeissLSM 880
Microscope, Inverted, for Fluorescence ImagingZeissAxiovert 200 M
Microscope  CameraQ-ImagingRetiga R1
Microscope Light Source for Fluorescence ImagingLumencorSOLA SE Light Engine
Microscope, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Microscope, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri dishes, 100mmFisher SciFB0875712
Petri dishes, 60mmTriTechT3308
Pipet ControllerTEquipmentP2002
Pipettor P10 TipsUSA Sci1110-3000
Pipettor P1000 TipsUSA Sci1111-2020
Pipettor P200 TipsUSA Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse away sprayFisher Sci7000TS1
RNAse free serological pipettesUSA Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tubesUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomycin sulfateSigmaS6501-100G
SucroseVWRAAJ63662-AP
SUPERase·in RNase inhibitorFisher SciAM2694
Quality Control automated electrophoresis system: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent5067-5581 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - IKA vortexer adaptor at 2000 rpm Agilent/IKA3428000
Tapestation - Loading tips Agilent5067- 5152 or 5067- 5153
Tapestation - Optical Cap 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optical Tube 8x StripAgilent401428
Quality Control automated electrophoresis system: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris baseFisher SciBP152-500
Tris hydrochlorideFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure OsmometerFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP DispenserVWR25485-003

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