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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit une analyse de journaliste pour étudier le règlement de la traduction d’ADN messagère dans les ovocytes simples pendant la maturation in vitro.

Résumé

Des événements liés à la maturation nucléaire d’oocyte ont été bien décrits. Cependant, on en sait beaucoup moins sur les voies moléculaires et les processus qui ont lieu dans le cytoplasme en préparation de la fécondation et de l’acquisition de la totipotence. Au cours de la maturation des ovocytes, les changements dans l’expression des gènes dépendent exclusivement de la traduction et de la dégradation des ARN messagers maternels (ARNm) plutôt que de la transcription. L’exécution du programme translationnel joue donc un rôle clé dans l’établissement de la compétence développementale des ovocytes pour soutenir le développement de l’embryon. Cet article fait partie d’un accent sur la définition du programme de traduction maternelle de l’ARNm qui a lieu pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote. Dans cet article de méthode, une stratégie est présentée pour étudier la régulation de la traduction des ARNm cibles au cours de la maturation in vitro des ovocytes. Ici, un rapporteur Ypet est fusionné à la région non traduite 3' (UTR) du gène d’intérêt, puis micro-injecté dans les ovocytes avec l’ARNm polyadénylé codant pour mCherry pour contrôler le volume injecté. En utilisant la microscopie time-lapse pour mesurer l’accumulation de rapporteur, les taux de traduction sont calculés à différentes transitions au cours de la maturation méiotique des ovocytes. Ici, les protocoles pour l’isolement et l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits, utilisant le Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR reporter comme exemple.

Introduction

Un ovocyte de mammifère adulte subit des changements rapides dans la préparation à la fécondation et à l’acquisition de la totipotence. Ces changements sont essentiels pour soutenir le développement embryonnaire après la fécondation. Bien que les événements associés à la maturation nucléaire soient relativement bien décrits, on en sait beaucoup moins sur les processus moléculaires et les voies dans le cytoplasme des ovocytes. Au cours des dernières étapes de la maturation des ovocytes, les ovocytes sont transcriptionnellement silencieux, et l’expression des gènes dépend entièrement de la traduction et de la dégradation de l’ARNm1,2. La synthèse des protéines critiques pour la compétence développementale s’appuie donc sur un programme de traduction chronométré d’ARNm à longue durée de vie qui ont été synthétisés plus tôt au cours de la croissancedes ovocytes 1,3. Dans le cadre d’un accent sur la définition de ce programme de traduction maternelle de l’ARNm exécuté pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote, cet article présente une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction des ARNm maternels cibles dans des ovocytes simples au cours de la maturation méiotique in vitro.

Dans cette méthode, le cadre de lecture ouvert YPet est cloné en amont de l’UTR 3' de la transcription d’intérêt. Ensuite, les ARNm codant pour ce rapporteur sont micro-injectés dans les ovocytes avec des ARNm polyadenylé codant pour contrôler le volume injecté. L’accumulation de reporter est mesurée pendant la maturation méiotique in vitro d’ovocyte utilisant la microscopie de time-lapse. L’accumulation de protéines fluorescentes jaunes (YFP) et de mCherry est enregistrée dans les ovocytes individuels, et les signaux YFP sont corrigés par le niveau stabilisé du mCherry co-injecté. Après l’acquisition des données, les taux de translation sont calculés pour différents intervalles de temps au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro en calculant la pente de la courbe obtenue par ajustement de courbe.

Cette approche fournit un outil pour confirmer expérimentalement les changements dans la traduction des ARNm endogènes sélectionnés. De plus, cette méthode facilite la caractérisation des éléments régulateurs qui contrôlent la traduction lors de la maturation méiotique des ovocytes en manipulant les éléments cis-régulateurs du 3' UTR des ARNm cibles4,5,6. La manipulation de la longueur de la queue poly(A) permet également de mieux comprendre l’activité de l’adénylase/deadenylase dans les ovocytes5. La mutagenèse d’éléments cis-agissants ou d’immunoprécipitation de l’ARN peut être utilisée pour étudier les interactions avec les protéines de liaison à l’ARN apparenté6,7. De plus, cette méthode peut être utilisée pour identifier les composants essentiels du programme de traduction qui sont essentiels pour la compétence développementale des ovocytes en mesurant la traduction de l’UTR cible 3' dans des modèles associés à une diminution de la qualité des ovocytes 8,9,10. Ce document de méthode présente une expérience représentative où des ovocytes dénudés de souris C57/BL6 âgées de 21 jours ont été micro-injectés avec un journaliste de Ypet fusionné au 3' UTR d’IL-7. L’installation et le protocole pour l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits.

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Protocole

Les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Californie à San Francisco (protocole AN182026).

1. Préparation des médias

  1. Ajouter tous les composants, comme décrit dans le tableau 1, pour faire le milieu de collecte des ovocytes de base et le milieu de maturation des ovocytes. Pour le support de collecte de base, réglez le pH sur 7,4. Pour le milieu de collecte et de maturation, ajouter 3 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 1 μM de cilostamide le jour de l’utilisation.

2. Préparation du codage de l’ARNm pour Ypet-3' UTR et mCherry

  1. Obtenir les séquences 3′ UTR des ARNm d’intérêt.
    REMARQUE: Pour cette étude, des séquences ont été précédemment obtenues à partir de l’ADNc d’ovocyte de souris.
  2. Concevoir des amorces pour amplifier les IDU 3' cibles à partir de l’ADNc ovocytaire et de parties du vecteur pcDNA 3.1 contenant une séquence codante Ypet, une étiquette d’épitope V5 et un promoteur T7.
  3. Amplifier à l’aide d’un kit d’ADN polymérase haute fidélité. Exécutez les produits de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) sur un gel pour vérifier si les fragments ont la bonne taille, découpez les bandes et extrayez l’ADN du gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel conformément aux instructions du fabricant.
  4. Fusionnez les fragments pcr en vecteur à l’aide d’un kit de clonage PCR.
    REMARQUE: Des fragments de PCR ont été incubés sur la glace pendant 4 h pour faciliter un processus de recombinaison plus efficace. Ceci est contraire aux instructions du fabricant, qui recommandent un temps d’incubation de seulement 45 min.
  5. Transfecter des fragments de PCR en bactéries Escherichia coli 5-α compétentes.
    1. Ajouter le mélange et le plasmide aux bactéries et incuber sur de la glace pendant 30 min.
    2. Choc thermique du mélange et du plasmide en plaçant le mélange dans un bain-marie à 42 °C pendant 45 s, et refroidir immédiatement sur de la glace pendant 3 min.
    3. Ajouter 500 μL de bouillon Super Optimal avec un milieu de répression catabolite (SOC) et incuber pendant 1 h à 37 °C.
    4. Tournez vers le bas à 7000 × g pendant 2 min, et retirez la plupart du surnageant. Remise en suspension et plaque sur une plaque de gélose Luria Broth (LB) avec l’antibiotique de sélection approprié.
      REMARQUE : La carbénénicilline a été utilisée dans cette étude.
    5. Incuber pendant la nuit à 37 °C. Isolez les colonies en appuyant légèrement sur l’extrémité d’une pipette sur l’une des colonies et en la plaçant dans 3 mL de milieu LB avec 100 μg/mL de carbbénicilline. Incuber pendant 12-24 h à 37 °C.
    6. Extraire l’ADN des plasmides à l’aide du kit d’isolement de l’ADN plasmidique conformément aux instructions du fabricant et confirmer les séquences via le séquençage de l’ADN.
  6. Pour Ypet/3' UTR :
    1. Produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro. Utilisez un apprêt avant en amont de la séquence Ypet et un apprêt inverse avec 20 résidus de thymine supplémentaires. Voir le tableau 2 pour la séquence de Ypet/IL-7 3' UTR et les séquences des amorces avant et arrière.
      REMARQUE: Ces résidus de thymine supplémentaires ajouteront oligo(A) à l’ARNm linéaire après transcription in vitro.
    2. Transcrivez in vitro le produit PCR à l’aide d’une trousse de transcription T7 conformément aux instructions du fabricant.
    3. Purifier l’ARN complémentaire (ARNc) résultant à l’aide d’un kit de nettoyage de transcription conformément aux instructions du fabricant.
    4. Éluer l’ARNc purifié dans de l’eau sans RNAse, mesurer la concentration et évaluer l’intégrité par électrophorèse de l’agarose. Conserver à −80 °C.
  7. Pour mCherry:
    1. Produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro en utilisant une enzyme de restriction haute fidélité; utiliser l’enzyme de restriction mfEI-HF si vous répliquez cet exemple. Digérer dans un tampon de digestion pendant la nuit à 37 °C.
    2. Exécutez un gel pour purifier l’échantillon et extrayez l’ADN linéaire à l’aide d’un kit d’extraction de gel conformément aux instructions du fabricant.
    3. Transcrivez in vitro le produit PCR à l’aide d’une trousse de transcription T7 conformément aux instructions du fabricant.
    4. Polyadénylate de l’ARNc (150-200 nucléotides) à l’aide d’un kit de résidus en poly(A) selon les instructions du fabricant.
    5. Purifier l’ARNc résultant à l’aide d’une trousse de nettoyage de transcription selon les instructions du fabricant.
    6. Éluer l’ARNc purifié dans de l’eau sans ARNAse, mesurer les concentrations d’ARNm et évaluer l’intégrité du message par électrophorèse sur gel. Conserver à −80 °C.

3. Procédure expérimentale

REMARQUE : Un aperçu schématique de la micro-injection d’ovocytes et de la microscopie time-lapse subséquente est donné à la figure 1.

  1. Jour 1
    1. Injecter par voie intrapéritonéale des souris de 21 jours avec 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide pour favoriser la croissance du follicule au stade antral11.
  2. Jour 3
    1. Prélèvement d’ovocytes
      1. Sacrifier des souris 44-48 h après l’amorçage pour recueillir les ovaires, et les placer dans une boîte de Petri en plastique avec un milieu de collecte d’ovocytes de base.
      2. Ouvrez soigneusement les follicules antraux en faisant une petite coupe dans la paroi du follicule avec une aiguille de 26 G. Isolez les ovocytes intacts cumulus-enfermés (COC) avec plusieurs couches de cellules de cumulus utilisant une pipette en verre à bouche-actionnée.
      3. Utilisez une pipette plus petite (légèrement plus grande que le diamètre de l’ovocyte) et désamorcer mécaniquement les COC par pipetage répété.
        REMARQUE: Vous pouvez également effectuer une micro-injection sur des COC intacts.
      4. À l’aide d’une pipette plus grande, aspirer les ovocytes dénudés et les placer dans une boîte de Petri avec un milieu de maturation complété par 1 μM de l’inhibiteur de la phosphodiestérase, le cilostamide, pour empêcher la reprise de la maturation méiotique12. Placez le plat dans l’incubateur pendant 2 h pour laisser les ovocytes récupérer du stress induit par l’isolement des ovocytes des follicules.
    2. Micro-injection d’ovocytes
      1. Préparez les aiguilles d’injection en plaçant un tube capillaire en verre borosilicate de 10 cm de long dans un tiroir mécanique. Pour une injection optimale, pliez la pointe de l’aiguille dans un angle de 45 ° à l’aide d’un filament chauffé.
      2. Préparez des plats en polystyrène avec des gouttelettes de 20 μL de milieu de collecte d’ovocytes de base et couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère.
      3. Préparer un mélange rapporteur en ajoutant 12,5 μg/μL d’UTR Ypet-3' et 12,5 μg/μL mCherry. Préparer un plus grand volume et faire des aliquotes pour les expériences futures afin d’assurer des concentrations similaires de déclarants. Conservez ces aliquotes à -80 °C. Lors de la décongélation, centrifugez d’abord la partie aliquote pendant 2 min à 20 000 x g,puis transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation.
        REMARQUE: Cette centrifugation empêchera l’aiguille d’injection d’être obstruée par des agrégats potentiels dans le mélange de rapporteur.
      4. Chargez l’aiguille d’injection par capillarité avec environ 0,5 μL de mélange rapporteur.
      5. Placez la pipette de maintien et l’aiguille d’injection chargée dans les supports et placez-la dans la gouttelette du milieu de collecte des ovocytes. Aspirez une partie du milieu dans la pipette de maintien.
      6. Ouvrez l’aiguille d’injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien.
      7. Placez les ovocytes dans une gouttelette de milieu de collecte de base et injectez 5 à 10 pL du mélange rapporteur.
      8. Incuber les ovocytes dans le milieu de maturation avec 1 μM de cilostamide pendant 16 h pour permettre au signal mCherry de se stabiliser.
      9. Préparer une boîte de Petri qui sera utilisée pour la microscopie en accéléré avec au moins deux gouttelettes de 20 μL de milieu de maturation pour chaque rapporteur injecté : une gouttelette avec 1 μM de cilostamide pour contrôler les ovocytes arrêtés par la prophase I et une gouttelette sans cilostamide pour la maturation des ovocytes. Couvrir les gouttelettes avec de l’huile minérale légère et placer dans l’incubateur.
    3. Microscopie time-lapse
      1. Après la pré-incubation, retirez les ovocytes injectés de l’incubateur et lavez-les quatre fois dans un milieu de maturation sans cilostamide. Conserver certains ovocytes dans un milieu de maturation avec du cilostamide de 1 μM comme groupe témoin d’ovocytes arrêté par la prophase I.
      2. Transférer les ovocytes injectés dans leurs gouttelettes respectives sur la parabole du microscope time-lapse préalablement préparée. Regroupez les ovocytes à l’aide d’une pipette en verre fermée (une pipette fermée peut être préparée en maintenant la pointe dans une flamme pendant quelques secondes).
        REMARQUE: Le regroupement des ovocytes aide à empêcher leur mouvement pendant l’enregistrement.
      3. Placer l’enceinte sous le microscope équipée d’un système d’éclairage à diodes électroluminescentes et d’un étage motorisé équipé d’une chambre environnementale maintenue à 37 °C et 5 % deCO2. Pour reproduire cette étude, utilisez les paramètres suivants : ensemble de filtres : miroir dichroïque YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal YFP (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Émission (EM): D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em : 632/60 m).
      4. Entrez les paramètres appropriés pour l’expérience time-lapse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude) : Cliquez sur Applications | Acquisition multidimensionnelle. Sélectionnez le premier onglet Main et sélectionnez timelapse, plusieurs positions de scèneet plusieurs longueurs d’onde.
      5. Sélectionnez l’onglet Enregistrement pour entrer l’emplacement où l’expérience doit être enregistrée.
      6. Sélectionnez l’onglet Timelapse pour entrer le nombre de points de temps, la durée et l’intervalle de temps.
        REMARQUE: La durée de l’expérience time-lapse dépend de l’espèce animale étudiée, car le moment de la maturation méiotique des ovocytes diffère d’une espèce à l’autre. Dans cette expérience avec des ovocytes de souris, des ovocytes ont été enregistrés toutes les 15 minutes pendant 16 h.
      7. Sélectionnez l’onglet Scène. Allumez brightfield et localisez la position des ovocytes en ouvrant une nouvelle fenêtre en sélectionnant Acquérir | Acquérir | Afficher en direct. Une fois les ovocytes localisés, revenez à la fenêtre Acquisition multidimensionnelle et appuyez sur + pour définir l’emplacement des ovocytes.
      8. Sélectionnez l’onglet Longueurs d’ondeet définissez 3 longueurs d’onde différentes pour brightfield (exposition 15 ms), YFP (exposition 150 ms pour Ypet / IL7 3' UTR) et mCherry (exposition 75 ms pour Ypet / IL7 3' UTR).
        REMARQUE : Ajustez l’exposition pour chaque déclarant UTR Ypet/3' en fonction du niveau d’accumulation du déclarant et du volume injecté. S’assurer que le signal YFP tombe au centre de la plage de détection au début de l’expérience pour éviter la sous-estimation ou la saturation en cas d’activation de la traduction. Pour mCherry, ajustez l’exposition pour chaque lot de mCherry car le signal dépend du nombre de nucléotides d’adénine qui ont été ajoutés pendant la procédure de polyadenylation. En raison de la variation de l’efficacité de la polyadenylation, utilisez le même lot de mCherry dans différentes expériences pour une meilleure comparaison entre les expériences.
      9. Démarrez l’expérience time lapse en cliquant sur Acquérir. Voir la figure 2 et le fichier supplémentaire pour obtenir un exemple d’enregistrement en accéléré dans un seul ovocyte.
    4. Analyse de la traduction de l’UTR Ypet-3'
      1. Pour cette analyse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude), effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte: l’ovocyte lui-même - cliquez sur la région de l’ellipse et entourez l’ovocyte - et une petite région proche de l’ovocyte à utiliser pour la soustraction de fond - cliquez sur la région rectangulaire.
        Remarque : Assurez-vous que les ovocytes ne se déplacent pas hors de la région sélectionnée pendant l’enregistrement time-lapse. Portez une attention particulière au placement de la mesure de la région autour de l’extrusion du corps polaire, car cela provoque un mouvement dans l’ovocyte et peut fausser l’enregistrement.
      2. Exportez les données de mesure de région vers une feuille de calcul en cliquant d’abord sur Ouvrir le journal, puis sur Données du journal pour exporter le logiciel d’analyse des données.
      3. Pour chaque ovocyte individuel et pour tous les points temporels mesurés, soustrayez la mesure de la région d’arrière-plan de la mesure de la région ovocytaire. Effectuez cette option séparément pour les longueurs d’onde YFP et mCherry.
      4. Consigner le moment de la dégradation des vésicules germinales (GVBD) et de l’extrusion du corps polaire (PBE) pour référence ultérieure.
        REMARQUE: Exclure les ovocytes de souris en cours de maturation lorsque le GVBD dépasse 2 h.
      5. Tracez l’expression YFP et mCherry au fil du temps pour chaque ovocyte afin de vérifier les valeurs aberrantes.
        REMARQUE: Il doit s’agir d’une courbe lisse, si ce n’est pas le cas, cela peut indiquer que l’ovocyte s’est déplacé pendant l’enregistrement.
      6. Pour chaque ovocyte individuel, calculer l’expression moyenne de mCherry pour les dix derniers points temporels de l’enregistrement. Pour chaque point de temps, divisez l’expression YFP par l’expression mCherry moyenncée pour corriger le volume injecté afin d’obtenir un rapport YFP/mCherry à chaque point temporel pour chaque ovocyte individuel.
      7. Calculez les taux de translation pour un intervalle de temps spécifique en ajustant la pente de la courbe par régression linéaire. Évaluer les différences dans les taux de traduction à l’aide de l’inférence statistique.

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Résultats

Des ovocytes I-arrêtés de prophase dénudés des souris C57/BL6 de 21 jours ont été injectés avec un mélange de journaliste contenant l’ADN messagère codant le journaliste de Ypet fusionné au 3' UTR d’IL-7 et adn messagère codant mCherry. L’expression de YFP et de mCherry a été enregistrée dans 39 oocytes, dont 30 ont été mûris, et 9 ont été arrêtés dans la prophase I comme commande négative. Trois ovocytes en maturation ont été exclus pour l’analyse parce qu’ils avaient un GVBD retardé (...

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Discussion

La méthode présentée décrit une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction de l’ARNm cible à différentes transitions au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro. IL-7, une cytokine libérée par l’ovocyte qui peut être impliquée dans la communication cellulaire ovocyte-cumulus 8,13, a été choisie dans le but de décrire ce procédé. IL-7 est connu pour être de plus en plus traduit pendant la ma...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM097165, GM116926 et Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 à Marco Conti. Enrico M. Daldello a été soutenu par une bourse de la Fondation Lalor et Natasja G. J. Costermans a été soutenu par une bourse Rubicon de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
CilostamideEMD Millipore231085
MEM alphaGibco12561-056
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-AldrichM2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile FilteredGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
Sodium Bicarbonate JT-Baker3506-1
Sodium PyruvateGibco 11360-070
Ultrapure distilled waterInvitrogen10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
AgaroseApex Biomedical 20-102QD
Carbenicillin disodium saltSigma-AldrichC1389-1G
Choo-Choo Cloning KitMcLabCCK-20
CutSmart Buffer (10x)New England BiolabsB7204
DNA loading dye (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP SolutionNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo FisherSM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova TeknovaL1010
LB Medium (Capsules)MP Biomedicals3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up KitLife TechnologiesAM1908
MfeI-HF restriction enzymeNew England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitInvitrogenAM1344
Phusion High Fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530
Poly(A) Tailing kitInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
S.O.C. mediumThermo Fisher15544034
TAE buffer Apex Biomedical 20-193
Ultrapure Ethidium Bromide SolutionLife Technologies15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettesSigma-AldrichA5177-5EA
Calibrated micro-pipettesDrummond Scientific Company2-000-025 
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2BD305111
Syringe 1 mlBD309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-0-20-CFor time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filamentSutter InstrumentBF100-78-10
Oil for Embryo CultureIrvine Scientific9305
Petri DishFalcon351006For micro-injection
Tissue Culture DishFalcon353001For oocyte incubation
VacuTip Holding CapillaryEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderPreparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0 Molecular Devices For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

Références

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