Réponse cardiaque à la stimulation β-adrénergique déterminée par l’analyse de la boucle pression-volume

Résumé

Nous décrivons ici une analyse de la boucle pression-volume cardiaque sous des doses croissantes d’isoprotérénol perfusé par voie intraveineuse pour déterminer la fonction cardiaque intrinsèque et la réserve β-adrénergique chez la souris. Nous utilisons une approche à poitrine ouverte modifiée pour les mesures de boucle pression-volume, dans laquelle nous incluons la ventilation avec une pression expiratoire positive.

Résumé

La détermination de la fonction cardiaque est une analyse de critères d’évaluation robuste dans des modèles animaux de maladies cardiovasculaires afin de caractériser les effets de traitements spécifiques sur le cœur. En raison de la faisabilité des manipulations génétiques, la souris est devenue le modèle animal mammifère le plus courant pour étudier la fonction cardiaque et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Nous décrivons ici un protocole pour déterminer la fonction cardiaque in vivo en utilisant des mesures et des analyses de boucle pression-volume dans des conditions basales et sous stimulation β-adrénergique par perfusion intraveineuse de concentrations croissantes d’isoprotérénol. Nous fournissons un protocole affiné comprenant un support de ventilation prenant en compte la pression expiratoire finale positive pour améliorer les effets négatifs lors des mesures thoraciques ouvertes, et une analgésie puissante (buprénorphine) pour éviter un stress myocardique incontrôlable évoqué par la douleur pendant la procédure. Ensemble, la description détaillée de la procédure et la discussion sur les pièges possibles permettent une analyse hautement standardisée et reproductible de la boucle pression-volume, réduisant l’exclusion des animaux de la cohorte expérimentale en prévenant d’éventuels biais méthodologiques.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires affectent généralement la fonction cardiaque. Ce numéro souligne l’importance d’évaluer in vivo la fonction cardiaque détaillée dans les modèles de maladies animales. L’expérimentation animale est entourée d’un cadre des trois principes directeurs Rs (3R) (Réduire/Affiner/Remplacer). En cas de compréhension de pathologies complexes impliquant des réponses systémiques (c’est-à-dire des maladies cardiovasculaires) au niveau de développement actuel, l’option principale consiste à affiner les méthodes disponibles. Le raffinage entraînera également une réduction du nombre d’animaux requis en raison de moins de variabilité, ce qui améliorera la puissance de l’analyse et des conclusions. En outre, la combinaison de mesures de contractilité cardiaque avec des modèles animaux de maladies cardiaques, y compris ceux induits par la stimulation neurohumorale ou par une surcharge de pression comme la bande aortique, qui imite par exemple les niveaux altérés de catécholamine / β-adrénergiques^1,2,3,4,fournit une méthode puissante pour les études précliniques. Compte tenu du fait que la méthode par cathéter reste l’approche la plus largement utilisée pour l’évaluation approfondie de la contractilité cardiaque^5,nous avons cherché à présenter ici une mesure affinée de la fonction cardiaque in vivo chez la souris par des mesures de boucle pression-volume (PVL) lors d’une stimulation β-adrénergique basée sur l’expérience antérieure incluant l’évaluation de paramètres spécifiques de cette approche^{6, 7}.

Pour déterminer les paramètres hémodynamiques cardiaques, des approches comprenant des techniques d’imagerie ou de cathéter sont disponibles. Les deux options s’accompagnent d’avantages et d’inconvénients qui doivent être soigneusement pris en compte pour la question scientifique respective. Les approches d’imagerie comprennent l’échocardiographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM); les deux ont été utilisés avec succès chez la souris. Les mesures échocardiographiques impliquent des coûts initiaux élevés d’une sonde à grande vitesse nécessaire à la fréquence cardiaque élevée des souris; il s’agit d’une approche non invasive relativement simple, mais elle est variable parmi les opérateurs qui, idéalement, devraient être expérimentés dans la reconnaissance et la visualisation des structures cardiaques. De plus, aucune mesure de pression ne peut être effectuée directement et les calculs sont obtenus à partir d’une combinaison de grandeurs de taille et de mesures de débit. D’autre part, il présente l’avantage que plusieurs mesures peuvent être effectuées sur le même animal et que la fonction cardiaque peut être surveillée par exemple pendant la progression de la maladie. En ce qui concerne la mesure du volume, l’IRM est la procédure de référence, mais comme pour l’échocardiographie, aucune mesure de pression directe n’est possible et seuls les paramètres dépendants de la précharge peuvent être obtenus⁸. Les facteurs limitatifs sont également la disponibilité, l’effort d’analyse et les coûts d’exploitation. Ici, les méthodes basées sur des cathéters pour mesurer la fonction cardiaque sont une bonne alternative qui permet en outre la surveillance directe de la pression intracardiaque et la détermination de paramètres de contractilité indépendants de la charge comme le travail d’AVC recrutable précharge (PRSW)⁹. Cependant, les volumes ventriculaires mesurés par un cathéter pression-conductance (par détermination de la conductivité) sont plus petits que ceux de l’IRM mais les différences de groupe sont maintenues dans la même plage¹⁰. Afin de déterminer des valeurs de volume fiables, l’étalonnage correspondant est nécessaire, ce qui est une étape critique lors des mesures PVL. Il combine des mesures ex vivo de la conductivité sanguine dans des cuvettes étalonnées en volume (conversion de la conductance en volume) avec l’analyse in vivo de la conductance parallèle du myocarde lors de l’injection en bolus de la solution saline hypertonique^11,12. Au-delà de cela, le positionnement du cathéter à l’intérieur du ventricule et l’orientation correcte des électrodes le long de l’axe longitudinal du ventricule sont essentiels pour la capacité de détection du champ électrique environnant produit par celles-ci. Toujours avec la taille réduite du cœur de la souris, il est possible d’éviter les artefacts produits par les changements d’orientation intraventriculaire du cathéter, même dans les ventricules dilatés^5,10, mais les artefacts peuvent évoluer sous stimulation β-adrénergique^6,13. En plus des méthodes de conductance, le développement de la méthode basée sur l’admission semblait éviter les étapes d’étalonnage, mais ici les valeurs de volume sont plutôt surestimées^14,15.

Étant donné que la souris est l’un des modèles précliniques les plus importants de la recherche cardiovasculaire et que la réserve β-adrénergique du cœur est d’un intérêt central en physiologie et pathologie cardiaques, nous présentons ici un protocole affiné pour déterminer la fonction cardiaque in vivo chez la souris par des mesures PVL lors de la stimulation β-adrénergique.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et réalisées conformément aux règlements du Conseil régional de Karlsruhe et de l’Université de Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) conformément aux directives de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les données présentées dans ce protocole proviennent de souris mâles sauvages de type C57Bl6/N (âgées de 17 ± 1,4 semaine). Les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes à l’animalerie (IBF) de la faculté de médecine de Heidelberg. Les souris ont été logées dans un cycle lumière-obscurité de 12 heures, avec une humidité relative comprise entre 56 et 60%, un changement d’air 15 fois par heure et une température ambiante de 22 ° C + / - 2 ° C. Ils étaient conservés dans des cages conventionnelles de type II ou de type II, longtemps munies de litière pour animaux et de papiers de soie comme enrichissement. Des aliments autoclavés standard et de l’eau autoclavée étaient disponibles pour être consommés ad libitum.

1. Préparation d’instruments et de solutions médicamenteuses

1. Cathéter veineux central: Coupez le microtube (diamètre extérieur de 0,6 mm) en tubes de cathéter d’environ 20 cm de long. Utilisez une pince pour tirer une extrémité du tube sur l’extrémité d’une canule de calibre 23. Coupez l’autre extrémité du tube en diagonale pour créer une pointe pointue qui peut percer la veine fémorale.
2. Tube endotrachéal: Pour un tube d’intubation, coupez une canule de ponction veineuse de calibre 20 de 3 cm de long pour retirer la fixation de la seringue.
   1. Si le tube d’intubation ne s’adapte pas parfaitement au raccord du ventilateur, enroulez le parafilm sur l’extrémité du tube où le dispositif de ventilation est connecté. La connexion doit être stable et scellée par l’épaississement (Figure 1A). Raccourcissez la broche de guidage métallique de la canule de ponction veineuse de calibre 20 à 2,7 cm et utilisez-la comme aide à l’intubation. Des approches affinées pour l’intubation, y compris des fibres légères pour faciliter la visualisation de la trachée, sont également bien décrites, par exemple par Das et ses collaborateurs¹⁶.
3. Mélange anesthésique utilisé pour l’intubation : Mélanger 200 μL d’héparine (1000 UI/mL) avec 50 μL de NaCl à 0,9 % et 750 μL d’étomidate de 2 mg/mL provenant d’un produit à base d’émulsion huile-dans-eau. Utiliser 7 μL/g de poids corporel (PSB) pour chaque souris (0,1 mg/kg de buprénorphine p.c. 10 mg/kg d’étomidate de p.c.).
4. Relaxant musculaire : Dissoudre 100 mg de bromure de pancuronium dans 100 mL de NaCl à 0,9 %. Utiliser 1,0 μL/g de poids corporel (1 mg/kg p.c.) pour chaque souris.
5. Solutions d’isoprotérénol : Dissoudre 100 mg d’isoprotérénol dans 100 mL de NaCl à 0,9 % (1 μg/μL). Préparer les dilutions suivantes (Tableau 1) et transférer chacune dans une seringue de 1 mL.
   1. Pour obtenir la dilution 1, diluer le stock 1:1.8. Pour obtenir la dilution 2, diluer le stock 1:6. Pour obtenir la dilution 3, diluer la dilution 1 en 1:10. Enfin, obtenir la dilution 4 par une dilution 1:10 de la dilution 2.
6. NaCl hypertonique à 15 % (p/v) : Dissoudre 1,5 g de NaCl à 0,9 % dans 10 mL de_H2O double distillé. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue à pores de 0,45 μm.
7. Préparation d’une solution d’albumine à 12,5 % (p/v) : Dissoudre 1,25 g d’albumine sérique bovine dans 10 mL de NaCl à 0,9 %. Incuber la solution à 37 °C pendant 30 min. Refroidir à température ambiante et filtrer la solution avec un filtre à seringue à pores de 0,45 μm.
8. Préparation de l’installation: Allumez d’abord la plaque chauffante et réglez-la à 39-40 ° C. Placez une seringue remplie de solution saline sur le coussin chauffant et transférez le cathéter à boucle pression-volume (PVL) dans la seringue. Pré-incuber le cathéter pendant au moins 30 minutes avant utilisation pour la stabilisation. La configuration que nous utilisons se compose d’un cathéter de conductance de pression de 1,4 F, d’une unité de commande et du logiciel correspondant, et elle est décrite graphiquement sur la figure 1B et les références du fournisseur sont répertoriées dans la table des matériaux.

2. Anesthésie

1. Injecter de la buprénorphine (0,1 mg/kg p.C. par voie intrapéritonéale) 30 min avant l’intubation.
2. Placez la souris dans une chambre en verre acrylique pré-saturée de 2,5% d’isoflurane et préchauffée avec un coussin chauffant placé à la base de la chambre.
3. Dès que la souris dort (absence de réflexe), injecter le mélange anesthésique (7 mL/kg p.c.) contenant 10 mg/kg d’étomidate et de l’héparine (1 200 UI/kg p.c.) par voie intrapéritonéale.

3. Ventilation

1. Transférer l’animal sur la plate-forme d’intubation (Figure 1C) 3-4 minutes après l’injection anesthésique. La souris est suspendue aux dents avec la vue dorsale face à l’opérateur.
2. Soulevez doucement la langue avec une pince. Pour identifier la glotte, soulevez légèrement la mâchoire inférieure de la souris avec une deuxième pince.
3. Insérez soigneusement le tube endotrachéal (Figure 1A) dans la trachée et retirez la tige guide.
4. Transférez l’animal sur la plaque chauffante, placez-le à l’arrière et connectez le tube d’intubation au respirateur pour petit animal.
5. Ajuster la fréquence respiratoire à 53,5 x (poids corporel en grammes)^-0,26 [min^-1], comme décrit par d’autres¹², et les volumes courants aux pressions inspiratoires maximales de 11 ± 1 cmH₂O. Établissez un PEEP de 2 cmH₂O.
6. Fixez soigneusement les extrémités de la souris sur la plaque chauffante avec des bandes adhésives et appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux pour éviter la sécheresse.
7. Insérez une sonde de température rectale et maintenez la température corporelle centrale à 37 ± 0,2 °C.
8. Installez un ECG à 1 dérivation et surveillez la fréquence cardiaque en ligne comme indicateur de la profondeur et de la stabilité de l’anesthésie.
9. En l’absence de réflexes interdigitaux, injecter 1 mg/kg de poids corporel du relaxant musculaire pancuronium-bromure par voie intrapéritonéale. Cela empêche les artefacts respiratoires lors des mesures PVL.

4. Chirurgie

1. Recommandations générales
   1. Pendant la chirurgie, ventiler avec ~ 1,5-2% d’isoflurane vaporisé avec O₂. La concentration d’isoflurane peut également dépendre de variables telles que la souche de souris, le sexe, l’âge et le poids des animaux, mais elle doit être déterminée individuellement et expérimentalement et les valeurs ici sont des références pour la souche de souris C57BL6 / N. Il est important de noter que le ventilateur est connecté à un système d’extraction pour empêcher l’opérateur d’inhaler de l’isoflurane.
   2. Utilisez un grossissement entre 1,5 et 4x du stéréomicroscope pour les interventions chirurgicales.
      REMARQUE : Se référer aux directives institutionnelles/locales sur la préparation de l’animal pour les chirurgies non liées à la survie.
2. Canulation fémorale
   1. Rincez le membre postérieur avec de l’éthanol à 70%, incissez la région inguinale gauche et exposez la veine fémorale gauche.
   2. Souffler l’artère épigastrique et la veine avec une cautérisation.
   3. Ligaturez la veine fémorale avec une suture placée distale à l’accès au cathéter.
   4. Passez une suture sous la veine fémorale et préparez un nœud crânien du site de ponction. Perforez la veine fémorale avec le microtube préparé (voir étape 1.1) attaché à une seringue de 1 mL.
   5. Attachez le nœud pour fixer le tube à l’intérieur du récipient.
   6. Contrer la perte de liquide par la perfusion de NaCl à 0,9% complété par 12,5% d’albumine à un débit de perfusion de 15 μL / min avec une pompe à seringue automatique. De plus, gardez les tissus exposés humides en utilisant du NaCl préchauffé à 0,9%.
3. Thoracotomie
   1. Rincez le thorax avec de l’éthanol à 70%.
   2. Inciser la peau juste en dessous du processus xyphoïde et séparer brutalement les muscles pectoraux de la paroi thoracique avec une pince ou une cautérisation.
   3. Soulevez le processus xyphoïde avec une pince, puis coupez à travers la paroi thoracique en se déplaçant latéralement des deux côtés avec une cautérisation jusqu’à ce que le diaphragme soit entièrement visible par en dessous.
   4. Inciser le diaphragme par le dessous et exposer l’apex cardiaque. Ensuite, retirez soigneusement le péricarde avec une pince.
   5. Effectuez une costotomie limitée sur le côté gauche comme décrit précédemment⁶.
   6. Passez une suture sous la veine cavale inférieure pour effectuer une réduction de la précharge au cours des étapes ultérieures.
   7. Perforez doucement l’apex cardiaque avec une canule de calibre 25 (maximum 4 mm). Retirez la canule et insérez le cathéter PV jusqu’à ce que toutes les électrodes soient dans le ventricule.
   8. Ajuster la position du cathéter par des mouvements doux et des virages jusqu’à ce que des boucles de forme rectangulaire soient obtenues (Figure 2A).
   9. Gardez toujours tous les tissus exposés humides en utilisant du NaCl préchauffé à 0,9%.

5. Mesures

1. Recommandations générales
   1. Pendant les mesures, ventilez avec ~ 1,5-2% d’isoflurane vaporisé avec 100% O_2.
   2. Effectuer 2 mesures de base ainsi que 2 occlusions de la veine cave à chaque étape du protocole dose-réponse.
      REMARQUE: Il est important qu’après la première et la deuxième occlusion de la veine cave, les valeurs de pression et de volume reviennent aux valeurs à l’état d’équilibre comme avant la première occlusion. Cette observation est nécessaire pour reconnaître un changement de position du cathéter dû à des réductions en série du volume intraventriculaire. Si un changement de position du cathéter était le cas, les valeurs de volume en particulier seraient décalées.
2. Effectuer une analyse en ligne des paramètres (fréquence cardiaque, volume de l’AVC, dP/dt_max)et attendre que la fonction cardiaque à l’état d’équilibre soit obtenue. Pour la plage de paramètres attendue avec le paramètre utilisé ici chez les souris C57Bl6/N, veuillez vous référer aux résultats publiés⁶.
3. Arrêtez le respirateur en position expiratoire et enregistrez les paramètres de base. Après 3 à 5 secondes, réduire la précharge cardiaque en soulevant la suture sous la veine cavale inférieure avec une pince afin d’obtenir des paramètres indépendants de la précharge(Figure 2B). Allumez le ventilateur. Attendez au moins 30 secondes pour la deuxième occlusion jusqu’à ce que les paramètres hémodynamiques soient stabilisés.
4. Après avoir obtenu les mesures dans des conditions basales, procédez à la dose-réponse de l’isoprotérénol en passant aux seringues préparées. Ici, le débit de perfusion reste inchangé afin d’éviter des modifications de la précharge cardiaque. Veillez à ne pas infuser de bulles d’air lors du changement de seringue.
   1. Attendez au moins 2 minutes jusqu’à ce qu’une nouvelle fonction cardiaque à l’état d’équilibre soit obtenue, puis arrêtez à nouveau le respirateur en position expiratoire et enregistrez les paramètres de base. Après 3 à 5 secondes, réduire la précharge cardiaque en soulevant la suture sous la veine cavale inférieure afin d’obtenir des paramètres indépendants de la précharge.
   2. Attendez au moins 30 secondes pour la deuxième occlusion. Ensuite, passez à la seringue préparée avec la prochaine concentration d’isoprotérénol et répétez les enregistrements des paramètres indépendants de la ligne de base et de la précharge.
      REMARQUE: Des artefacts tels que le pic de pression systolique terminale (ESPS, Figure 2C)peuvent se produire lors de l’augmentation de la dose d’isoprotérénol, qui résulte du piégeage du cathéter. Les artefacts qui se produisent avant le début des paramètres basaux peuvent être facilement corrigés via le repositionnement du cathéter.

6. Étalonnage

REMARQUE: Les procédures d’étalonnage peuvent varier en fonction du système PVL utilisé.

1. Étalonnage de conductance parallèle
   1. Connectez une seringue contenant une solution de NaCl à 15 % à la canule fémorale après la dernière mesure de la dose-réponse à l’isoprotérénol. Infuser soigneusement 5 μL de la solution hypertonique restant dans le tube jusqu’à ce que le PVL se déplace légèrement vers la droite pendant la visualisation en ligne. Attendez ensuite que les boucles reviennent à l’état d’équilibre.
   2. Arrêtez le respirateur à la fin de l’expiration et injectez un bolus de 10 μL de NaCl à 15 % en 2 à 3 secondes. Vérifiez si les PVL s’élargissent largement et sont déplacés vers la droite lors de la visualisation en ligne.
2. Calibrage de la conductance au volume
   1. Attendez 5 min, pas moins, pour que le bolus salin hypertonique soit complètement dilué. Ensuite, retirez le cathéter et prélevez au moins 600 μL de sang du ventricule gauche du cœur battant à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une canule de calibre 21. À ce stade, l’animal est euthanasié sous anesthésie profonde et analgésie par saignement massif, en arrêtant la ventilation et l’ablation du cœur.
   2. Transférer le sang dans la cuvette d’étalonnage préchauffée (au bain-marie à 37 °C) avec des cylindres de volume connu. Placez le cathéter PV au centre de chaque cylindre et enregistrez la conductance. En calculant une courbe standard pour chaque animal, les unités de conductance peuvent être converties en valeurs de volume absolu.

7. Analyse

1. Après des mesures PVL réussies dans des conditions basales et une stimulation isoprotérénol, visualisez, numérisez, calculez et extrayez les paramètres caractérisant la fonction cardiaque (comme PRSW, dP / dt, pression et volume diastoliques finaux, pression et volume systoliques finaux, constante de relaxation Tau, entre autres) à l’aide d’un logiciel d’analyse PVL approprié. D’autres analyses statistiques et représentations graphiques peuvent être effectuées avec un logiciel d’analyse standard.
2. Analyse des paramètres indépendants de la précharge
   REMARQUE: Pour cette étape, il est crucial de normaliser la procédure.
   1. Sélectionnez les 5 à 6 premiers PVL montrant une précharge décroissante dans toutes les mesures pour l’analyse des paramètres indépendants de la précharge(Figure 2D). Un nombre constant de PVL sélectionnés pour l’analyse lors de la réduction de la précharge diminuera la variabilité entre les mesures des paramètres obtenus.
   2. Calculez la valeur moyenne des deux mesures à chaque étape du protocole.

Résultats

La mesure de la boucle volumique de pression (PVL) est un outil puissant pour analyser la pharmacodynamique cardiaque des médicaments et pour étudier le phénotype cardiaque de modèles murins génétiquement modifiés dans des conditions normales et pathologiques. Le protocole permet l’évaluation de la réserve cardiaque β-adrénergique dans le modèle murin adulte. Nous décrivons ici une méthode à poitrine ouverte sous anesthésie isoflurane combinée à la buprénorphine (analgésique) et au pancuronium (rela...

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole pour analyser la fonction cardiaque in vivo chez les souris sous stimulation β-adrénergique croissante. La procédure peut être utilisée pour traiter à la fois les paramètres de base de la fonction cardiaque et la réserve adrénergique (par exemple, l’inotropie et la chronotropie) chez les souris génétiquement modifiées ou lors d’interventions. L’avantage le plus important des mesures en boucle pression-volume (PVL) par rapport à d’autres moyens de déterminer la fonc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.4F SPR-839 catheter	Millar Instruments, USA	840-8111
1 ml syringes	Beckton Dickinson, USA	REF303172
Bio Amplifier	ADInstruments, USA	FE231
Bridge-Amplifier	ADInstruments, USA	FE221
Bovine Serum Albumin	Roth, Germany	8076.2
Buprenorphine hydrochloride	Bayer, Germany	4007221026402
Calibration cuvette	Millar, USA	910-1049
Differential pressure transducer MPX	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 39912
Dumont Forceps #5/45	Fine Science tools Inc.	11251-35
Dumont Forceps #7B	Fine Science tools Inc.	11270-20
Graefe Forceps	Fine Science tools Inc.	11051-10
GraphPad Prism	GraphPad Software	Ver. 8.3.0
EcoLab-PE-Micotube	Smiths, USA	004/310/168-1
Etomidate Lipuro	Braun, Germany	2064006
Excel	Microsoft
Heparin	Ratiopharm, Germany	R26881
Hot plate and control unit	Labotec, Germany	Hot Plate 062
Isofluran	Baxter, Germany	HDG9623
Isofluran Vaporizer	Abbot	Vapor 19.3
Isoprenalinhydrochloride	Sigma-Aldrich, USA	I5627
Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID	Smiths Medical International Ltd, UK	Ref. 800/100/100
MiniVent ventilator for mice	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany	Type 845
MPVS Ultra PVL System	Millar Instruments, USA
NaCl	AppliChem, Germany	A3597
NaCl 0.9% isotonic	Braun, Germany	2350748
Pancuronium-bromide	Sigma-Aldrich, USA	BCBQ8230V
Perfusor 11 Plus	Harvard Apparatus	Nr. 70-2209
Powerlab 4/35 control unit	ADInstruments, USA	PL3504
Rechargeable cautery-Set	Faromed, Germany	09-605
Scissors	Fine Science tools Inc.	140094-11
Software LabChart 7 Pro	ADInstruments, USA	LabChart 7.3 Pro
Standard mouse food	LASvendi GmbH, Germany	Rod18
Stereo microscope	Zeiss, Germany	Stemi 508
Surgical suture 8/0	Suprama, Germany	Ch.B.03120X
Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge	Beckton Dickinson, USA	393224
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science tools Inc.	00574-11
Water bath	Thermo Fisher Scientific, USA
Syringe filter (Filtropur S 0.45)	Sarstedt, Germany	Ref. 83.1826