Établissement d’un modèle de rat d’occlusion sagittale-sinus supérieure par l’intermédiaire d’une méthode d’embolie filimatique

Résumé

Ici, nous établissons un modèle original de rat de Sprague-Dawley (écart-type) de la thrombose supérieure du sinus sagittal (SSS) par l’intermédiaire d’une méthode de fil-embolization, et la stabilité et la fiabilité du modèle ont été vérifiées.

Résumé

Les mécanismes contribuant au début naturel de la thrombose cérébrale de sinus veineux (CVST) sont la plupart du temps inconnus, et une série de facteurs incontrôlables sont impliqués dans le cours de la maladie, ayant pour résultat de grandes limitations dans la recherche clinique. Par conséquent, l’établissement de modèles animaux CVST stables qui peuvent normaliser une variété de facteurs de confusion incontrôlables a aidé à contourner les lacunes de la recherche clinique. Au cours des dernières décennies, divers modèles animaux CVST ont été construits, mais les résultats basés sur ces modèles ont été incohérents et incomplets. Par conséquent, afin d’explorer plus loin les mécanismes pathophysiologiques de CVST, il est nécessaire d’établir un modèle animal nouveau et fortement compatible, qui a la valeur pratique importante et la signification scientifique pour le diagnostic et le traitement de CVST. Dans la présente étude, un modèle original de rat de Sprague-Dawley (écart-type) de la thrombose supérieure du sinus sagittal (SSS) a été établi par l’intermédiaire d’une méthode de fil-embolization, et la stabilité et la fiabilité du modèle ont été vérifiées. En plus, nous avons évalué des changements du flux sanguin veineux cérébral chez les rats après la formation de CVST. Collectivement, le modèle de SD-rat SSS-thrombose représente un modèle animal original de CVST qui est facilement établi, réduit au minimum le trauma, donne la bonne stabilité, et tient compte de contrôler avec précision la synchronisation et l’emplacement ischémiques.

Introduction

La thrombose cérébrale des sinus veineux (CVST) est une maladie rare du système veineux cérébral qui ne représente que 0,5 à 1,0% de toutes les causes d’AVC, mais a un taux d’occurrence relativement élevé chez les enfants et les jeunes adultes¹. Au cours de l’autopsie, le CVST s’est avéré être la cause de 10% des décès par maladie cérébrovasculaire². La thrombose peut se produire dans n’importe quelle partie du système veineux intracrânien. Le sinus sagittal supérieur (SSS) est l’un des secteurs les plus généralement affectés dans CVST et peut impliquer de multiples vaisseaux sanguins. En raison de la sténose ou de l’occlusion des sinus veineux, le retour veineux intracrânien est bloqué, ce qui s’accompagne souvent d’une augmentation de la pression intracrânienne³. Les manifestations cliniques du CVST sont complexes et varient au fil du temps; bien qu’il y ait un manque de spécificité des symptômes, les symptômes les plus communs incluent le mal de tête (77.2%), les saisies (42.7%), et les déficits neurologiques (39.9%). Dans les cas graves, le coma et même la mort peuvent survenir^4,5. Au cours des dernières années, en raison de l’amélioration globale des normes médicales et sanitaires et de la sensibilisation à la santé publique, la proportion de facteurs de risque connexes a changé, la proportion de traumatismes et d’infections a diminué, et la proportion de CVST causée par la grossesse, la période puerpérale, les contraceptifs oraux et d’autres raisons a progressivement augmenté^{de 5}.

Actuellement, la pathogénie de CVST n’est toujours pas bien comprise. Pour explorer le CVST en profondeur, d’autres recherches physiopathologiques sont nécessaires. Cependant, la plupart de ces méthodes de recherche sont invasives et donc difficiles à mettre en œuvre cliniquement. En raison de nombreuses limites de la recherche clinique, les modèles animaux présentent des avantages irremplaçables en termes de recherche fondamentale et translationnelle.

La cause de CVST est complexe, car son début initial est souvent non reconnu et l’endroit de la formation de thrombus est fortement variable. Heureusement, les modèles animaux peuvent obtenir un meilleur contrôle de ces facteurs. Au cours des dernières décennies, une variété de modèles animaux CVST ont été établis, et chaque modèle a ses propres inconvénients. Selon les différentes méthodes de production, ils peuvent être grossièrement divisés en catégories suivantes: le modèle simple de ligature SSS^6,7; le modèle d’accélérateur d’injection interne^{SSS 8}; le modèle⁹de thrombose SSS induite par le chlorure ferrique ; le modèle photochimique-induit de thrombose SSS¹⁰; et le modèle SSS d’embolie-occlusion auto-fabriquée^11. Cependant, la plupart de ces modèles sont incapables de contourner les dommages invasifs au cortex cérébral de l’animal et ne sont pas en mesure de contrôler avec précision l’heure et l’emplacement ischémiques. Dans certains modèles, le thrombus va se recanaliser spontanément ; dans d’autres modèles, le SSS devient définitivement occlu. En outre, des opérations compliquées et/ou des dommages sérieux peuvent affecter des résultats pathophysiologiques suivants dans ces modèles.

Dans la présente étude, un bouchon de fil a été inséré dans le SSS des rats de Sprague-Dawley (écart-type) pour établir avec succès un modèle CVST qui a réduit au minimum des dommages, a permis le contrôle précis, et a donné la bonne stabilité. De plus, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour les petits animaux et l’imagerie du flux sanguin par moucheture laser ont été combinées pour vérifier l’efficacité du modèle. Nous avons évalué des changements du flux sanguin cérébral avant et après l’établissement de notre modèle, aussi bien que nous avons évalué la stabilité de notre modèle, posant une base pour d’autres études explorant l’occurrence, le développement, et les mécanismes pathophysiologiques relatifs de CVST.

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité des normes médicales et de l’éthique de l’Université médicale de Wenzhou et sont conformes à la législation chinoise sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire.

1. Préparation du bouchon de fil, des rats SD et de l’équipement expérimental

1. Utilisez un fil de nylon d’un diamètre de 0,28 mm comme corps principal du bouchon de filetage.
   REMARQUE: La douceur et la dureté du fil de nylon doivent être modérées.
2. Couvrez une extrémité du fil de nylon avec un matériau en silicone. La longueur de la partie silicone du bouchon de filetage est d’environ 1,2 cm et le diamètre est d’environ 1,2 mm. La tête est effilée et la partie silicone est cylindrique. Réservez encore 5-7 cm. Le fil de nylon est facile à serrer et peut être coupé en fonction des besoins spécifiques après l’opération.
3. Utilisez de l’éthanol à 75% pour tremper le bouchon de fil pendant 3 min avant l’opération et rincez tout éthanol résiduel avec une solution saline normale avant de le boucher.
4. Sélectionnez 12 rats SD mâles pesant entre 280 et 320 g, et divisez-les au hasard en un groupe fictif et un groupe expérimental (n = 6 par groupe). Après une semaine d’adaptation environnementale, jeûne les rats pendant 12 h et les prive d’eau pendant 4 h avant l’opération.
5. Préparer l’équipement expérimental suivant nécessaire à l’expérience : une machine d’anesthésie pour petits animaux, un instrument stéréotaxique cérébral, un microscope de dissection, une perceuse de crâne à grande vitesse, des ciseaux, des pinces à épiler, une pince vasculaire, un porte-aiguille, un fil d’aiguille, une seringue de 2 mL, un système d’imagerie du flux sanguin à mouchetage laser et un scanner IRM pour petits animaux.

2. Construction du modèle SD-Rat SSS-Embolization via l’embolisation de fil

1. Placez le rat SD dans une boîte d’anesthésie-induction et utilisez un appareil anesthésique pour petits animaux pour administrer 4% d’isoflurane afin d’induire une anesthésie. Par la suite, utilisez une pince pour confirmer que les membres postérieurs et les orteils du rat SD ne répondent pas au pincement modéré.
2. Fixez rapidement le rat SDavec les cheveux supérieurs rasés en position couchée sur un dispositif stéréotaxique cérébral. Maintenir l’anesthésie avec 1,5-2,0% d’isoflurane (à une vitesse de 0,5 L/min), et stabiliser la fréquence respiratoire à 40-60 respirations/min. Stabiliser la température corporelle du rat à l’moyen d’un coussin chauffant à 37±0,2 °C.
   1. Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile pour les yeux après que le rat a été placé sur le cadre stéréotaxique pour protéger les cornées du dessèchement pendant l’anesthésie.
3. Stériliser la surface sur le dessus de la tête du rat avec 5% d’iode povidone alternant trois fois avec 75% d’éthanol. Faites une incision de la peau (2,0 cm de long) au milieu de la tête, puis décollez soigneusement le fascia supérieur et le périoste pour exposer complètement le crâne.
   1. Confirmez les positions de la fontanelle antérieure, de la fontanelle postérieure, de la suture coronale, de la suture sagittale et de la suture à chevrons.
4. Utilisez la zone située entre la suture coronale et la suture à chevrons comme zone d’observation du flux sanguin. Pour empêcher le crâne d’affecter l’observation pendant l’imagerie du flux sanguin au laser, amincir le crâne dans la zone d’observation jusqu’à ce que les vaisseaux sanguins soient clairement visibles. La taille du crâne aminci doit être d’environ 1,0 cm × 1,0 cm. Cette étape et ce qui suit sont tous réalisés sous un microscope de dissection.
   1. Pendant le broyage du crâne, utilisez une solution saline à température normale pour rincer la perceuse à plusieurs reprises afin d’éviter les brûlures à haute température dans le cortex cérébral.
5. Utilisez une perceuse à grande vitesse pour broyer le crâne dans une fenêtre osseuse de 6,0 mm x 4,0 mm centrée sur bregma pour exposer le SSS de la zone bregma.
   1. Utilisez une solution saline normale pour refroidir le crâne pendant le broyage. Lorsque le crâne devient mince, utilisez une pince à épiler pour enlever soigneusement les morceaux d’os restants afin d’éviter de déchirer le SSS.
6. Choisissez un bouchon de filetage approprié, utilisez le point Bregma SSS comme point de bouchon, perforez-le soigneusement avec une aiguille de seringue de 2 mL et insérez rapidement la tête de bouchon de filetage dans le point de bouchon.
   1. À ce stade, l’angle entre l’extrémité de la tête de filetage et le SSS devrait être d’environ 30 à 45°; ajustez ensuite l’angle entre l’extrémité du bouchon de filetage et le SSS à 0-10 degrés, et insérez lentement le SSS dans le centre jusqu’à ce que la tête atteigne le bord postérieur de la confluence sinusale. Ensuite, coupez la partie excédentaire de la queue.
      REMARQUE: Saignement rapide peut se produire lorsque le SSS est perforé. Si l’extrémité du bouchon de filetage ne peut pas être rapidement insérée dans le point de bouchon en même temps, utilisez une petite gaze ou une boule de coton pour appuyer doucement sur le point de bouchon tout en glissant lentement vers le bas pour exposer soigneusement le point de bouchon, puis insérez rapidement l’extrémité du boulon métallique dans le SSS. Une fois le bouchon de fil inséré, s’il y a un saignement au point du bouchon, des matériaux hémostatiques tels qu’une éponge à gélatine peuvent être utilisés pour arrêter le saignement.

3. Détection du flux sanguin à la surface du cerveau des rats SD

1. Utilisez une source de lumière laser pour éclairer uniformément la zone d’observation du flux sanguin. La lumière réfléchie est recueillie par une caméra et est transmise à un ordinateur pour analyse. Utilisez les paramètres suivants pour le système d’imagerie du flux sanguin à moucheture laser : longueur d’onde : λ = 785 nm ; et temps d’exposition de l’image : T = 10 ms.
2. Centrez la zone d’observation du flux sanguin SD-rat dans le champ de vision du système d’imagerie du flux sanguin laser-moucheté et effectuez une surveillance continue du flux sanguin à la surface du cerveau pendant 2 minutes. Recueillir et traiter les données de flux sanguin avant et après embolization pour chaque rat d’écart-type, et obtenir la carte de flux sanguin de laser-moucheture de la zone observée.
3. Rincez à plusieurs reprises la zone opérée avec une solution saline normale pour éliminer les débris osseux et les résidus. Suturer la peau (0# fil) et désinfecter avec de l’iodophore.
4. Maintenez la température corporelle jusqu’à ce que le rat se réveille après la chirurgie, puis logez-vous dans une seule cage avec de la nourriture et de l’eau fournies ad libitum. Le groupe fictif ne peut pas être branché.
5. Une fois la collecte des données terminée, effectuez un post-traitement.
   1. Sélection complète de la région d’intérêt (ROI) via les outils fournis par le logiciel du système d’imagerie du flux sanguin laser-speckle. Les valeurs obtenues sont la valeur moyenne de flux sanguin dans le ROI, et les valeurs locales de cérébral-sang-flux avant et après embolization. Utilisez la valeur du flux sanguin avant l’embolisation comme valeur de base.
   2. Sélectionnez quatre ROIs et mesurez le changement relatif du flux sanguin cérébral dans chaque ROI, exprimé comme le changement en pourcentage de la valeur de référence.

4. Détection de la position du fil sur les petits animaux IRM

1. Utilisez les paramètres d’imagerie pondérés_{T2 (T2}WI) suivants pour le système d’imagerie IRM : temps d’écho (TE) = 33 ms, temps de répétition (TR) = 3000 ms, nombre d’excitation (NEX) = 4, tranches = 28, épaisseur de tranche = 0,8 mm, taille de matrice = 256*256 mm², angle de retournement = 80°, champ de vision (FOV) = 30*30 mm^2,temps de balayage = 6 min 24 s; Des paramètres de résonance magnétique de l’angiographie (MRA) ont été réglés comme suit : TE = 4.4 ms, TR = 12 ms, NEX = 4, tranches = 80, épaisseur de tranche = 0.4 millimètre, taille de matrice = 256*256 millimètre^2,angle de retournement = 80°, FOV = 30*30 mm^2,temps de balayage = 16 min 23 sec 40 ms.
2. Fixez l’animal sur la table de balayage d’IRM, calibrez la position du cerveau en positionnant le balayage, et effectuez le balayage de séquence T₂WI et MRA après avoir confirmé la position.
3. Utilisez l’anesthésie continue via la machine d’anesthésie animale pendant la détection. Ensuite, euthanasier les rats SD par injection intrapéritonéale de pentobarbital excessif.
4. Acquisition d’image et post-traitement: après avoir collecté les données d’image, afin d’observer plus clairement l’état du bouchon de fil dans le SSS, utilisez la méthode d’amélioration de la pseudo-couleur pour afficher l’image T₂WI du cerveau du rat.

Résultats

Pour établir le modèle SD-RAT SSS-thrombose au moyen de la méthode de suture, la suture doit être préparée à l’avance (figure 1A), et l’équipement requis pour l’expérience (Figure 1B) doit être préparé. En raison de la nature délicate de l’opération, la préparation du modèle doit être effectuée sous un microscope de dissection. Les principales étapes sont illustrées à la figure 2. Pour faciliter la descr...

Discussion

Dans cette étude, un nouveau type de modèle CVST a été établi avec succès en insérant un bouchon de fil auto-fabriqué dans le SSS des rats SD. En plus, la formation image de flux sanguin de laser-moucheture et le petit-animal MRI ont été combinés pour surveiller des changements du flux sanguin sur la surface de cerveau des rats d’écart-type avant et après l’embolization afin de normaliser la synchronisation et l’emplacement ischémiques.

En 1989, Longa et al. ont réalisé u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	Becton,Dickinson and Company	301940
brain stereotaxic instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	68025
dissecting microscope	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
high-speed skull drill	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	78046
laser-speckle blood-flow imaging system	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
needle holder	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F31022-12
needle thread	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F33303-08
scissors	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	S13029-14
silica gel	Heraeus Kulzer	302785
small animal anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R540
small-animal MRI	Bruker Medical GmbH	Biospec 94/30 USR
tweezers	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F11029-11
vascular forceps	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F22003-09