Un modèle de rat Sprague Dawley d’ostéosarcome orthotopique syngénique avec amputation pour contrôler le taux de métastases

Résumé

Ici, une implantation orthotopique syngénique suivie d’une procédure d’amputation de l’ostéosarcome avec métastases pulmonaires spontanées pouvant être utilisée pour l’investigation préclinique de la biologie des métastases et le développement de nouvelles thérapies est décrite.

Résumé

L’avancée la plus récente dans le traitement de l’ostéosarcome (SG) s’est produite dans les années 1980, lorsqu’il a été démontré que la chimiothérapie multi-agents améliorait la survie globale par rapport à la chirurgie seule. Pour résoudre ce problème, l’objectif de l’étude est d’affiner un modèle moins connu de SG chez le rat avec une approche chirurgicale histologique, d’imagerie, biologique, d’implantation et d’amputation complète qui prolonge la survie. Nous avons utilisé un modèle de rat syngénique Sprague-Dawley (SD) immunocompétent et consanguin avec une lignée cellulaire UMR106 OS implantée (provenant d’un rat SD) avec des implants de tumeur tibiale orthotopique chez des rats mâles et femelles âgés de 3 semaines pour modéliser la SG pédiatrique. Nous avons constaté que les rats développent des tumeurs pulmonaires primaires et métastatiques reproductibles, et que les amputations de membres à 3 semaines après l’implantation réduisent considérablement l’incidence des métastases pulmonaires et préviennent les décès inattendus. Histologiquement, les SYSTÈMES primaires et métastatiques chez le rat étaient très similaires à ceux de la SG humaine. En utilisant des méthodes d’immunohistochimie, l’étude montre que la SG du rat est infiltrée par des macrophages et des cellules T. Une étude de l’expression protéique des cellules OS révèle que ces tumeurs expriment des kinases de la famille ErbB. Étant donné que ces kinases sont également fortement exprimées dans la plupart des systèmes d’exploitation humains, ce modèle de rat pourrait être utilisé pour tester les inhibiteurs de la voie ErbB pour le traitement.

Introduction

L’ostéosarcome (SG) est la tumeur osseuse primaire la plus courante chez les enfants, les adolescents et les jeunes adultes. L’avancée la plus récente dans le traitement de la SG a eu lieu dans les années 1980, lorsqu’il a été démontré que la chimiothérapie multi-agents améliorait la survie globale par rapport à la chirurgie seule¹. La SG se développe au cours d’une croissance osseuse rapide, se produisant généralement dans les os tubulaires longs tels que le fémur, le tibia et l’humérus. Ils sont caractérisés par un aspect ostéolytique, ostéoblastique ou mixte avec une réaction périostée notable^2. La chimiothérapie et la résection chirurgicale peuvent améliorer les résultats pour les patients ayant une survie à 5 ans pour 65% des patients^2,3. Malheureusement, les patients atteints de SG de haut grade atteints d’une maladie métastatique ont une survie de 20%. La SG envahit la région et métastase principalement dans les poumons ou d’autres os et est plus répandue chez les hommes. Le besoin le plus impérieux pour ces jeunes patients est une nouvelle thérapie qui prévient et élimine la viabilité des métastases à distance.

Des modèles précliniques de SG ont été examinés^4,5,6^,7et peu de modèles immunocompétents disponibles utilisant l’amputation de la SG orthotopique ont été développés. En 2000, un modèle important a été développé en utilisant des souris BALB/c avec OS syngénique orthotopique et amputation^8. Par rapport à ce modèle murin, le modèle de rat est basé sur des animaux génétiquement élevés et 10 fois plus gros, ce qui présente certains avantages. Le modèle UMR106 du rat a été développé à partir d’une SG induite par ³²P chez un rat Sprague Dawley (SD), qui a été dérivé dans une lignée cellulaire^9. En 2001, l’implantation orthotopique d’UMR106-01 a été décrite pour la première fois dans des tibias implantés de souris athymiques présentant un développement tumoral primaire rapide et cohérent et des caractéristiques radiologiques et histologiques en commun avec la SG chez l’homme. Des métastases pulmonaires se sont développées et dépendaient du placement orthotopique d’UMR106 dans le microenvironnement osseux^10. En 2009, Yu et al.¹¹ ont établi un modèle reproductible de rat OS du fémur orthotopique en utilisant des cellules UMR106 chez des rats SD mâles plus grands. Les implantations tumorales réussies et le taux de métastases pulmonaires chez le rat sans amputation étaient similaires aux données présentées ici. Dans cette étude, une amputation supplémentaire au modèle utilisant de jeunes rats a été effectuée, ce qui suggère que le moment de l’ablation de la tumeur primaire est crucial dans la modélisation de la SG, en particulier en ce qui concerne la progression métastatique. Grâce à ce raffinement, l’amputation et l’imagerie in vivo améliorent ce modèle pour les études précliniques d’évaluation des nouveaux médicaments pour la SG.

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Protocole

Toutes les procédures et expériences impliquant des rats ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le comité de soins et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins.

1. Le protocole de culture cellulaire UMR-106 de la lignée cellulaire UMR-106 du rat SD

1. Cultiver des cellules dans du DMEM, complété par 10% (v/v) FBS, pénicilline (10 U/mL)-streptomycine (10 U/mL) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO_2. Effectuer des expériences en utilisant des cellules avec des passages de 2-8¹².

2. Protocole d’injection intratibiale de cellules OS

REMARQUE: Les rates SD gravides accouplées dans le temps donnent naissance dans l’établissement pour animaux et à l’âge de 3 semaines, des portées sont utilisées (puisque la lignée cellulaire UMR 106 est syngénique aux rats SD, aucune irradiation n’est nécessaire).

1. Induction
   1. Placez le rat dans une chambre d’induction de taille moyenne et induisez une anesthésie avec 2% à 3% d’isoflurane. Surveillez l’animal en permanence pour la profondeur de l’anesthésie par le pincement réflexe aux orteils, la fréquence respiratoire et le caractère.
   2. Insérez le nez dans le nosecone. Sécurisez avec du ruban adhésif, si nécessaire.
   3. Enlevez les poils de la jambe droite jusqu’au bas-ventre ventral et dorsal avec des tondeuses ou utilisez un agent dépilatoire. Placez le rat en position couchée.
   4. Frottez la zone chirurgicale de manière aseptique à l’aide d’éthanol à 70% et diluez l’acétate de chlorhexidine ou la bétadine diluée. Commencez autour de la zone du genou et frottez dans un mouvement circulaire à la fois proximaux et distalement. Répétez cette étape trois fois. Aucun drapé n’est utilisé pour l’implantation de la tumeur.
   5. Appliquez du lubrifiant pour les yeux dans les deux yeux du rat pour prévenir la dessiccation de la cornée causée par l’anesthésie. Placez le rat sur un coussin chauffant à faible chaleur. Assurez-vous que le rat a une température corporelle normale (37 °C) et une fréquence respiratoire normale.
2. Chirurgie
   1. Activez l’isoflurane à ~1,5%-2% (pour la maintenance). Assurez-vous que l’animal est à un plan d’anesthésie adéquat en l’absence d’un réflexe de pincement des orteils. Sinon, augmentez le pourcentage d’isoflurane à 2,5%.
   2. Marquez une aiguille stérile (environ 22 G) à 10 mm de la pointe pour guider la profondeur à insérer.
   3. Insérez l’aiguille de 10 mm dans la diaphyse du tibia en entrant dans le genou plié au milieu du plateau tibial, en étendant l’aiguille à travers la métaphyse dans la diaphyse à l’aide d’un léger mouvement de forage pour faire une ouverture. Retirez l’aiguille.
   4. Chargez la suspension cellulaire dans la seringue Hamilton directement avant l’injection dans le tibia. Pour ce faire, mélangez doucement les cellules avant de les aspirer dans la seringue car la gravité fait que les cellules se déposent dans le fond du tube.
      REMARQUE: Les cellules peuvent être stockées dans un tube de 1,5 à 2 mL (à température ambiante) avant d’être aspirées dans la seringue Hamilton (100 μL) après un mélange minutieux. Les cellules peuvent être maintenues à température ambiante pendant 2-3 h pendant la procédure d’implantation. Vérifiez toujours la viabilité cellulaire des cellules dans le tube avant puis après la séance d’implantation. L’exclusion du bleu de trypan est la méthode la plus simple pour l’évaluation de la viabilité cellulaire.
   5. Une fois l’os traversé avec la première aiguille, insérez une deuxième aiguille (aiguille de plus petit diamètre également marquée à 10 mm) attachée à la seringue Hamilton de 100 μL chargée de cellules. Assurez-vous d’insérer l’aiguille jusqu’à la marque de 10 mm dans le même trou s’étendant dans la diaphyse.
   6. Déchargez doucement 20 μL de suspension de 75 000 cellules OS dans le PBS dans la diaphyse et la cavité médullaire.
      REMARQUE: L’aiguille ne doit pas vaciller dans l’os et doit se sentir en sécurité. Si l’aiguille se déplace facilement, le cortex peut avoir été traversé à la diaphyse. Répétez l’insertion à nouveau pour obtenir un placement plus ferme avant l’injection de cellules.
   7. Retirez l’aiguille Hamilton de l’os.
      REMARQUE: Si une petite goutte de sang se forme, appliquez une légère pression. Si une goutte de liquide claire se forme au site de ponction, l’aiguille peut ne pas avoir été étendue assez loin dans l’os et la suspension des cellules tumorales peut avoir fui à travers le trou. Notez cela dans les notes, mais généralement, l’implantation de la tumeur sera réussie. Avec l’expérience, la procédure d’implantation de la tumeur devrait prendre 5 minutes par rat. Avec l’expérience, l’implantation tumorale des cellules dans l’os deviendra plus facile. L’injection accidentelle de cellules dans le muscle autour de l’os peut ne pas conduire au microenvironnement tumoral nécessaire aux métastases pulmonaires.
3. Récupération
   1. Assurez-vous que le rat est normotherme. Placez le rat dans une cage avec un coussin chauffant placé sous la cage pour la récupérer.
   2. Après avoir été complètement éveillé, mobile et bien respirer, injecter aux rats de la buprénorphine (1,0-1,2 mg / kg SC).
      REMARQUE: Pour avoir accès à la buprénorphine, vérifiez auprès de l’établissement pour voir les options d’approbation par le personnel vétérinaire pour passer la commande.
   3. Replacez les rats dans des cages propres et surveillez-les une fois par jour, chaque semaine.

3. Mesure et surveillance

1. Mesurez la taille de la tumeur 9 à 10 jours après l’implantation, puis tous les 2 jours jusqu’à 3 semaines après l’implantation pour établir un taux de croissance. Mesurez le diamètre maximal du tibia à l’aide d’un étrier électronique ou manuel. Stockez les données dans une feuille de calcul avec une formule pour calculer le volume de la tumeur. Mesurez le tibia controlatéral (non implanté) comme ligne de base.
   REMARQUE: Les diamètres des membres postérieurs implantés sont utilisés comme substitut pour la taille de la tumeur. Les membres postérieurs sont mesurés perpendiculairement à l’axe long du tibia au plus grand diamètre pour deux mesures, ventrale/dorsale et médiale/latérale sur le membre. Le volume tumoral estimé est calculé par la formule¹¹: Volume tumoral (mm³⁾= plus grand diamètre (mm) x plus petit diamètre (mm)²/2.
2. Considérez les rats pour l’amputation de survie ou le traitement de chimiothérapie lorsque les tumeurs approchent 15 mm dans la plus grande dimension ou 3 semaines après l’implantation de la tumeur. Le membre controlatéral mesure environ 7 à 9 mm chez la plupart des rats à cet âge.

4. Administration intraveineuse de doxorubicine

1. Anesthésier les rats avec 2% d’isoflurane. Préparer la peau sur la veine jugulaire avec trois lavages chirurgicaux à l’aide de bétadine et d’alcool comme décrit¹³.
2. Sous dissection minutieuse, visualisez la veine jugulaire droite ou gauche. Insérez l’aiguille dans le muscle sus-jacent, puis dirigez-la vers la tête du rat dans la lumière de la veine jugulaire telle qu’elle est visualisée dans la veine jugulaire antérieure au muscle pectoral.
   1. Lorsque l’aiguille est insérée dans la veine jugulaire, aspirer doucement le sang dans la seringue pour assurer une insertion correcte. Il est possible de croire que l’aiguille est à travers la veine, mais l’aiguille est sous la veine et non dans la lumière. Si la veine jugulaire devient trop petite pour les injections lors d’une dissection émoussée pour exposer la veine jugulaire, utilisez l’autre veine jugulaire pour l’injection.
3. Injecter la doxorubicine (2 mg/kg) lentement pendant 1 min dans un volume de 100-150 μL. La solution peut être visualisée par voie intraveineuse dans la veine jugulaire pendant l’accouchement.
4. Injecter des volumes similaires de solution saline normale chez des rats témoins.
5. Retirez l’aiguille et appliquez une légère pression sur la veine avec une gaze stérile.
6. Fermez l’incision cutanée à l’aide de 3-4 pinces à plaie. Retirez les clips 7 à 10 jours après l’injection.
   REMARQUE: Les rats n’essaient généralement pas d’enlever les clips métalliques, mais mordent et enlèvent les sutures. La méthode d’injection jugulaire est préférable aux injections de doxorubicine dans la veine caudale, car tout médicament qui fuit à l’extérieur du vaisseau provoque une nécrose de la queue pouvant nécessiter une amputation de la queue.

5. Protocole d’amputation du membre postérieur

1. Induction
   1. Placez le rat dans une chambre d’induction de taille moyenne et induisez une anesthésie avec 2% à 4% d’isoflurane. Surveillez le rat en permanence pour la profondeur de l’anesthésie.
      REMARQUE: La chambre d’induction est récupérée dans un bidon de charbon de bois et tous les autres gaz sont éliminés par une table à tirage descendant utilisée pour la chirurgie.
   2. Insérez le nez dans un nosecone. Sécurisez avec du ruban adhésif, si nécessaire.
      REMARQUE : Cette procédure est effectuée sur une table de tirage descendant pour éliminer les gaz volatils en excès (c.-à-d. l’isoflurane).
   3. Enlevez les poils de la jambe droite jusqu’au bas-ventre ventral et dorsal avec des tondeuses ou utilisez un agent dépilatoire. Placez le rat en position couchée.
   4. Frottez la zone chirurgicale de manière aseptique à l’aide d’éthanol à 70% et diluez l’acétate de chlorhexidine ou la bétadine diluée. Préparez la peau pour la chirurgie du milieu du mollet à la zone de la peau juste au-dessus de l’articulation de la hanche du bas-ventre droit. Frottez la jambe proximale et la zone distale de manière circonférentielle. Répétez cette étape trois fois.
   5. Appliquez le lubrifiant pour les yeux dans les deux yeux du rat. Assurez-vous que le rat a une température corporelle normale (37 °C) et des signes vitaux normaux. Surveillez et régulez la température corporelle à l’aide d’un coussin chauffant connecté à un moniteur de sonde de température rectale.
2. Chirurgie
   1. Activez l’isoflurane à 1,5% -3% (maintenance). Surveillez la profondeur de l’anesthésie, y compris la réaction au pincement des orteils, la fréquence respiratoire et le caractère. Ajuster le taux d’isoflurane au besoin pour maintenir un plan d’anesthésie approprié.
      REMARQUE: La fréquence respiratoire sous anesthésie devrait être comprise entre 50 et 100 respirations par minute. Des respirations profondes et peu fréquentes sont une indication que le rat est trop profondément anesthésié.
   2. Ouvrez des packs d’instruments stériles et des rideaux et enfilez des gants stériles. Prenez soin de maintenir la stérilité pendant toute la durée de la procédure. Les instruments chirurgicaux stériles de base nécessaires comprennent, le porte-lame de scalpel, la pince, les hémostats, le porte-aiguille, les ciseaux et l’applicateur de clip de plaie.
   3. Tirez la patte du rat à travers l’évent du drap chirurgical stérile. Assurez-vous que l’animal est à un niveau d’anesthésie adéquat par réflexe de pincement des orteils.
   4. À l’aide d’une lame de scalpel ou de ciseaux chirurgicaux, faites une incision cutanée circonférentielle juste proximale à l’étouffement (articulation du genou).
   5. Dégorgez le membre postérieur à l’aide de gaze ou d’une dissection émoussée pour exposer l’artère fémorale et la veine sur la surface ventrale-médiale du membre postérieur.
   6. Ligaturez les vaisseaux à l’aide de sutures résorbables 4-0 au niveau du milieu du fémur et transectez distalement.
   7. Serrez la veine distalement pour réduire les fuites pendant la dissection musculaire.
      REMARQUE: La musculature circonférentielle sera transectée distale au niveau de la ligature des vaisseaux de l’artère fémorale et des muscles élevés du fémur au niveau de l’articulation coxofémorale.
   8. À l’aide d’une dissection contondante, enlevez l’articulation de la hanche avec une rotation latérale vers l’extérieur.
   9. Trouvez la tête du fémur et désarticulez-la de l’acétabulum. Coupez tout tissu restant en gardant la jambe attachée au corps.
   10. Donner un bloc d’éclaboussures à l’acétabulum et au nerf sciatique avec environ 6 mg / kg de ropivacaïne.
   11. Fermez la musculature sur l’acétabulum à l’aide d’une simple suture interrompue (4-0, suture résorbable).
       REMARQUE: 0,5% de bupivacaïne ou de lidocaïne supplémentaire (0,15-0,2 mg au total) peut être injecté dans plusieurs sites le long de la couche musculaire fermée (infiltration locale / bloc d’éclaboussures).
   12. Opposez et fermez les bords de la peau à l’aide de clips de plaie placés séparés tous les 5 à 10 mm.
3. Récupération
   1. Placez le rat dans une cage de récupération propre avec support thermique à l’aide d’un coussin chauffant placé sous la cage.
      REMARQUE: Pour prévenir l’hyperthermie, le coussin chauffant ne doit pas être en contact direct avec l’animal et ne doit pas dépasser 40 ° C.
   2. Surveiller l’animal jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement et qu’il soit normotherme (37,5-39 °C).
      REMARQUE: L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il soit pleinement conscient et couché sévèrement et se déplace facilement autour de la cage.
   3. Après avoir été complètement éveillé, mobile et bien respirer, injecter aux rats de la buprénorphine (1,0-1,2 mg / kg SC).
      REMARQUE: L’administration de buprénorphine chez un rat anesthésié peut nuire à la récupération.
   4. Administrer 10 mL de solution de Ringer chaude et lactée par voie sous-cutanée entre les omoplates.
   5. Replacez les rats dans la cage propre et réunissez-les avec des congénères.
   6. Surveillez tous les animaux deux fois par jour pendant le mois suivant pour détecter tout signe de douleur et de détresse, y compris la piloérection, la posture voûtée ou l’inappétence ou les signes d’infection du site d’incision, y compris l’érythème, l’écoulement purulent ou la déhiscence de la plaie.
      REMARQUE: À ce jour, nous n’avons observé aucun signe clinique (comme des infections) après le rétablissement postopératoire chez aucun des animaux. Un seul rat avait une déhiscence avec des sutures, après quoi des clips de plaie ont été utilisés pour fermer les plaies sans autres problèmes.
   7. Administrer de la buprénorphine ou du méloxicam à des animaux présentant des signes cliniques de douleur à des doses publiées en consultation avec un vétérinaire d’animaux de laboratoire.
   8. Administrer des antibiotiques (c.-à-d. céphalosporine) aux animaux présentant des signes cliniques de douleur aux doses publiées en consultation avec un vétérinaire des animaux de laboratoire.
      REMARQUE: Tous les animaux présentant des signes prolongés de douleur ou de détresse qui ne s’améliorent pas avec des analgésiques ou les animaux présentant des signes d’infection qui ne répondent pas aux antibiotiques doivent être euthanasiés sans cruauté.

6. Imagerie par rayons X

1. Après l’implantation de la tumeur, imagez le tibia et les poumons de manière non invasive pour détecter la croissance tumorale à l’aide d’une radiographie avec une machine conçue pour les rongeurs.
2. Anesthésiez les rats comme cela a été fait précédemment.
3. Prenez des images à un grossissement de 3x pendant 6 s à 25 kV.
4. Traitez le film à l’aide du processeur à rayons X. Les radiographies peuvent également être numérisées numériquement.

7. Procédure de nécropsie

1. Euthanasier les rats avec du CO_2. Confirmez la mort par manque de rythme cardiaque et prélevez immédiatement 3 mL de sang du cœur pour des échantillons de sérum ou de plasma.
2. Ouvrez le thorax et l’abdomen pour examen.
3. Isolez la trachée et canulez avec un cathéter (18 G). Pour fixer le cathéter dans la trachée, attachez une suture de soie autour de la trachée avec le cathéter.
4. Raccordez le cathéter de perfusion à une seringue de 3 ou 5 mL. Infuser du formol ou une solution saline pour gonfler doucement les lobes pulmonaires pour de meilleurs échantillons d’histologie. Lors de la perfusion, les poumons vont gonfler et permettre une meilleure visualisation des métastases pulmonaires.
5. Examinez, disséquez et pesez tous les organes thoraciques et abdominaux sélectionnés (tels que le foie, les reins).
6. Fixez les organes dans le formol pour l’histopathologie ou congelez sur de la glace sèche, du 2-méthylbutane ou de l’azote liquide.
7. Pour l’évaluation de l’expression des protéines à l’aide du transfert western, fabriquez des lysats de tissus congelés. Les anticorps qui réagissent avec les tissus de rat sont détaillés¹³.

8. Immunohistochimie

1. Traiter le tissu primaire de la SG, l’incorporer dans de la paraffine et le sectionner pour la coloration immunohistochimique.
2. Récupérer l’antigène après déparaffinisation à l’aide d’un tampon de citrate (pH 6,0). Incuber dans 0,3%_H2O₂ dans du méthanol pendant 30 min pour éteindre la peroxydase endogène.
3. Bloquez les sections de paraffine de 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un sérum normal.
4. Incuber avec des anticorps primaires anti-CD68 et CD3 (voir tableau) pendant la nuit à 4 °C.
5. Rincez les sections dans PBS et incuubez-les dans un polymère HRP à l’aide d’un kit de détection.
   REMARQUE: Immunostaining a été développé avec la diaminobenzidine comme chromogène.

9. Transfert western

1. Lyser les cellules UMR-106 dans 200-300 μL de tampon de lyse¹⁴ pour effectuer l’électrophorèse sur gel standard et le western blot.
2. Utilisez 4% à 12% de gels Bis-Tris.
3. Incuber dans l’anticorps primaire anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actine ou anti-souris β2-AR (voir tableau) et l’anticorps secondaire lié à la peroxydase de raifort.
4. Ajouter le substrat chimiluminescent. Exposez les membranes à un film radiographique.
   REMARQUE: les niveaux de β-actine sont utilisés comme contrôles de chargement.

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Résultats

Des rats consanguins SD immunocompétents sont utilisés pour ces études sur la SG, qui offrent un modèle animal avec un système immunitaire intact. Nous avons utilisé la lignée cellulaire UMR106 d’ATCC, développée à partir de cellules initialement isolées d’un système d’exploitation d’un rat SD. Nous avons implanté les cellules dans des rats SD, fournissant ainsi un modèle syngénique pour OS. Les cellules UMR106 sont implantées dans le tibia de rats SD mâles et femelles âgés de 3 semaines, simul...

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Discussion

Les rats porteurs d’implants tibias OS développent des tumeurs mesurables 3 semaines après l’implantation. Si les membres avec des tumeurs sont amputés 3 semaines après l’implantation, l’incidence des métastases pulmonaires est considérablement réduite. Les systèmes d’exploitation sont à la fois ostéolytiques et ostéoblastiques. Les rats sans amputation développent des métastases pulmonaires multiples et de taille variable, observées par radiographie ou lors de la nécropsie 7 semaines après l’...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT	Cell Signaling TECHNOLOGY	4685S
absorbable suture	Ethicon	J214H
β-actin	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-47778
β2-AR antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-569	replaced by β2-AR (E-3): sc-271322
Bis–Tris gels	Thermo Fisher	NP0321PK2
Buprenorphine SR Lab	ZooPharm	IZ-70000-201908
CD3 antibody	Dako	#A0452
CD68 antibody	eBioscience	#14-0688-82
Chemiluminescent substrate	cytiva	RPN2232
CL-Xposure film	Thermo Fisher	34089
Complete Anesthesia System	EVETEQUIP	922120
diaminobenzidine	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Doxorubicin	Actavis	NDC 45963-733-60
EGFR antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-03	replaced by EGFR (A-10): sc-373746
ERBB2 antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-284	replaced by Neu (3B5): sc-33684
ERBB4 antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-283	replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050
ERK antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-514302
eye lubricant	PHARMADERM	NDC 0462-0211-38
Hamilton syringe (100 µL)	Hamilton	Model 1710 SN SYR
horseradish peroxidase-linked secondary antibody	cytiva	NA934
HRP polymer detection kit	VECTOR LABORATORIES	MP-7401
HRP polymer detection kit	VECTOR LABORATORIES	MP-7402
isoflurane	BUTLER SCHEIN	NDC 11695-6776-2
isoflurane vaporizer	EVETEQUIP	911103
UMR-106 cell	ATCC	CRL-1661
X-ray	Faxitron	UltraFocus
X-ray processor	Hope X-Ray Peoducts Inc	MicroMax X-ray Processor	Hope Processors are not available in USA anymore
wound clips	BECTON DICKINSON	427631