Imagerie 3D des fibres de collagène PDL pendant le mouvement orthodontique des dents dans le modèle murin mandibulaire

Résumé

Nous présentons un protocole pour générer le mouvement orthodontique de dent chez les souris et des méthodes pour la visualisation 3D des fibres de collagène et des vaisseaux sanguins du ligament parodontal sans sectionnement.

Résumé

Le mouvement orthodontique des dents est un processus biologique complexe de remodelage des tissus mous et durs altérés à la suite de forces externes. Afin de comprendre ces processus de remodelage complexes, il est essentiel d’étudier la dent et les tissus parodontals dans leur contexte 3D et donc de minimiser les sectionnements et les artefacts tissulaires. Les modèles murins sont souvent utilisés en biologie du développement et de la structure, ainsi qu’en biomécanique en raison de leur petite taille, de leur taux métabolique élevé, de leur génétique et de leur facilité de manipulation. En principe, cela en fait également d’excellents modèles pour les études dentaires. Cependant, un obstacle majeur est leur petite taille de dent, les molaires en particulier. Ce document vise à fournir un protocole étape par étape pour générer le mouvement orthodontique de dent et deux méthodes pour la formation image 3D du composant fibreux périodontique de ligament d’une molaire mandibulaire de souris. La première méthode présentée est basée sur une installation de micro-CT permettant l’imagerie d’amélioration de phase des tissus frais de collagène. La deuxième méthode est une méthode de nettoyage osseux utilisant du cinnamate d’éthyle qui permet l’imagerie à travers l’os sans sectionnement et préserve la fluorescence endogène. Combinant cette méthode de compensation avec des souris reporters comme Flk1-Cre; TdTomato a fourni une première occasion du genre d’imager la vascularisation 3D dans le PDL et l’os alvéolaire.

Introduction

Le processus biologique sous-jacent de base dans le mouvement orthodontique des dents (OTM) est le remodelage osseux. Le déclencheur de ce processus de remodelage est attribué à des changements dans la structure du ligament parodontal (PDL) tels que le stress de la matrice extracellulaire (ECM), la nécrose ainsi que la destruction et la formation des vaisseaux sanguins^1,2,3. D’autres déclencheurs possibles pour le remodelage alvéolaire d’os sont liés à la détection de force par les ostéocytes dans l’os, ainsi qu’à la déformation mécanique de l’os alvéolaire lui-même; cependant leur rôle dans OTM n’est pas encore entièrement élucidé^4,5.

Malgré de nombreuses études visant à révéler les relations structure-fonction du PDL au cours de l’OTM, un mécanisme fonctionnel clair doit encore être défini^6,7. La raison principale en est le défi de récupérer les données d’un tissu mou (PDL) situé entre deux tissus durs (cénume et os alvéolaire). Les méthodes acceptées pour recueillir des informations structurelles nécessitent généralement une fixation et un sectionnement qui perturbent et modifient la structure PDL. De plus, la plupart de ces méthodes produisent des données 2D qui, même si elles ne sont pas déformées, ne donnent que des informations partielles et localisées. Puisque le PDL n’est pas uniforme dans sa structure et fonction, une approche qui adresse la structure 3D intacte du complexe entier de dent-PDL-os est justifiée.

Cet article décrira une méthode pour générer un OTM chez la souris et deux méthodes qui permettent la visualisation 3D des fibres de collagène dans le PDL sans aucune section de l’échantillon.

Les modèles murins sont largement utilisés pour les expériences in vivo en médecine, en biologie du développement, en administration de médicaments et en études structurelles. Ils peuvent être génétiquement modifiés pour éliminer ou améliorer des protéines et des fonctions spécifiques; ils fournissent un contrôle du développement rapide, reproductible et prévisible; ils sont également faciles à imager en raison de leur petite taille⁸. Malgré leurs nombreux avantages, les modèles murins dans la recherche dentaire ne sont pas utilisés fréquemment, en particulier lorsque des manipulations cliniques sont justifiées, principalement en raison des dents de petite taille. Des modèles animaux tels que les rats^9,10,11,les chiens^12,13,les porcs^14,15,16 et les singes¹⁷ sont utilisés plus souvent que les souris. Avec le développement récent de techniques d’imagerie haute résolution, les avantages de l’utilisation d’un modèle murin pour déchiffrer les processus alambiqués dans OTM sont nombreux. Ce document présente une méthode pour générer un mouvement mesial de la dent molaire dans la mâchoire inférieure avec les niveaux constants de force qui déclenchent la retouche d’os. La plupart des expériences OTM chez les rongeurs sont faites dans le maxillaire supérieur, puisque la mobilité de la mandibule et la présence de la langue ajoutent un autre niveau de complexité. Cependant, la mandibule présente de nombreux avantages lorsque l’intégrité structurelle 3D est souhaitée. Il peut être facilement disséqué comme un os entier; chez certaines espèces, il peut être séparé en deux hémi-mandibules par la symphyse fibreuse; il est compact, plat et ne contient que les dents sans aucun espace sinusal. En revanche, le maxillaire supérieur fait partie du crâne et est étroitement lié à d’autres organes et structures, donc une section étendue est nécessaire afin de disséquer l’os alvéolaire avec les dents associées.

En utilisant une chambre d’humidité interne couplée à un système de chargement à l’intérieur d’un micro-CT haute résolution qui permet une amélioration de phase, nous avons développé une méthode pour visualiser les tissus fibreux frais en 3D comme décrit précédemment^{9,18,19,20,21,22,23.} Les tissus frais sont scannés immédiatement après le sacrifice de l’animal sans aucune coloration ou fixation, ce qui réduit les artefacts tissulaires ainsi que les altérations des propriétés biomécaniques. Ces données 3D peuvent être utilisées pour la distribution et les analyses de direction des fibres comme décrit ailleurs^19.

La deuxième méthode d’imagerie tissulaire entier 3D présentée ici est basée sur la clairance optique de la mandibule qui permet l’imagerie des fibres PDL à travers l’os sans aucune section. Fait intéressant, il permet également la visualisation des fibres de collagène de l’os lui-même, mais cela ne sera pas discuté ici. En général, il existe deux méthodes pour la clairance tissulaire. Le premier est le déblaiement à base aqueuse où l’échantillon est immergé dans une solution aqueuse avec un indice de réfraction supérieur à 1,4 soit par une simple immersion, hyperhydratation ou incorporation d’hydrogel. Cependant, cette méthode est limitée dans le niveau de transparence ainsi que la préservation structurelle du tissu et nécessite donc la fixation du tissu. La seconde méthode qui donne des échantillons très transparents et ne nécessite pas de fixation est la méthode de compensation à base de solvant^24,25. Nous avons généré une méthode de compensation modifiée à base de solvant basée sur le 3-phénylprop-2-énoate d’éthyle (cinnamate d’éthyle, ECi) pour les échantillons mandibulaires. Cette méthode présente les avantages d’utiliser un agent de compensation de qualité alimentaire non toxique, un rétrécissement minimal des tissus et la conservation des protéines fluorescentes.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux Lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Harvard (Protocole no 01840).

1. Mouvement orthodontique des dents

1. Pour générer un lit de souris, utilisez une plate-forme en plastique plat avec un appui-tête incliné de 45 ° en forme de coin. L’appui-tête peut être généré en coupant une boîte en plastique.
   1. Surélevez la tête de la plate-forme pour générer un angle d’environ 30° entre l’appuie-tête et le plan de la table. Fixez un trombone épais plié (0,036 po de diamètre) à l’extrémité de la tête pour maintenir les incisives supérieures.
   2. À l’extrémité de la queue, générez une surface surélevée à laquelle une chaîne de puissance orthodontique peut être attachée pour maintenir les incisives inférieures. Consultez la figure 1 pour obtenir un exemple de plateforme.
2. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de xylazine à 10 mg/kg et de kétamine à 100 mg/kg à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de calibre 27.
3. Placez la souris anesthésiée sur une plate-forme sur mesure et immobilisez la mâchoire supérieure en accrochant les incisives supérieures sur la boucle du trombone. Ouvrez la mâchoire inférieure de la souris avec la chaîne de puissance orthodontique accrochée aux incisives inférieures. Gardez les joues rétractées avec le rétracteur de bouche mini-colibri.
4. Placez la plate-forme sous un microscope chirurgical ou tout autre stéréoscope pouvant atteindre un grossissement de 5 à 6x.
5. Appliquer 50 μL de solution saline (environ 1 goutte) sur les yeux de la souris pour prévenir la déshydratation cornéenne. Réapprovisionnez la solution saline toutes les 20 minutes.
6. Couper un morceau de fil d’aluminium (0,08 mm de diamètre) de 1 cm de longueur. Faites glisser le fil du côté buccal lingualement dans la zone interproximale ci-dessous le point de contact entre les première et deuxième molaires à l’aide d’un support d’aiguille microchirurgical. Laisser un bord libre de 2 mm devant la première molaire afin d’être enfilé dans l’extrémité du ressort.
7. Coupez un morceau de bobine de nickel titane (NiTi), d’environ 7 à 9 fils de longueur.
   REMARQUE: Les propriétés élastiques de la bobine fourniront une force constante pour le mouvement orthodontique. La longueur totale non entraînée de la bobine doit être plus courte que l’espace entre l’inciseur et la molaire. Gardez à l’esprit que 2 fils supplémentaires sont nécessaires à chaque extrémité pour ancrer la bobine à la dent. Le fil d’aluminium est sélectionné afin de réduire les artefacts de balayage tels que le durcissement du faisceau pendant le micro-CT scan.
8. Insérez un ressort hélicoïdal NiTi (diamètre de fil de 0,15 mm, diamètre de bobine interne de 0,9 mm; délivre une force de 10 g) entre la première molaire inférieure et l’incisive inférieure. Utilisez la ligature du fil insérée autour de la première molaire à l’étape 1.6, tournez le fil étroitement autour de 2 fils du ressort hélicoïdal pour fixer la bobine sur le côté molaire.
9. Pour assurer un niveau de force uniforme, utilisez exactement 3 fils actifs entre la première molaire et l’incisive. Retirez temporairement la chaîne d’alimentation de l’inciseur et bouclez 2 à 3 fils non entraînés sur l’inciseur pour ancrer la bobine. Faites glisser les fils vers le bas jusqu’à la marge gingivale libre de l’incisive.
10. Placez une couche de résine composite fluide sur la bordure incisive de la bobine et durcissez-la avec une lumière de durcissement dentaire. Remplacez la chaîne d’alimentation après avoir durci la résine.
11. En utilisant la même lumière de durcissement, chauffez la bobine NiTi pendant 20 s. Cela resserrera la bobine NiTi. Le placement fini est illustré à la figure 1C.
12. Laissez le côté controlatéral intact ou insérez une imposture telle que le fil entre les première et deuxième molaires.
13. Placez la souris anesthésiée sous une lumière chauffée pour la garder au chaud jusqu’à la récupération.
14. Replacez la souris dans une cage individuelle et surveillez-la quotidiennement. Aucun changement de régime alimentaire n’est nécessaire pendant le mouvement orthodontique.
    REMARQUE: Le dispositif OTM d’un côté provoque une certaine gêne, mais ne nuit pas à l’alimentation. Cependant, les dispositifs d’insertion des deux côtés ne sont pas conseillés en raison de la quantité supplémentaire d’inconfort. Les médicaments contre la douleur ne sont pas nécessaires à moins que des signes extérieurs de douleur ne soient observés.

2. Micro-CT scan des fibres de PDL dans les hémi-mandibules fraîches

1. Montage de l’hémi-mandibule (Figure 2)
   1. Après la durée souhaitée du mouvement orthodontique, sacrifiez la souris via la luxation cervicale. Retirez la mandibule et séparez-la en hémi-mandibules.
      REMARQUE: Puisque l’échantillon ne sera pas fixé, il est essentiel d’effectuer la dissection de la mâchoire et le montage dès que possible, idéalement dans les 30 minutes.
   2. Retirez doucement les tissus mous environnants avec une lingette propre et non pelucheux.
   3. Retirez l’appareil orthodontique à l’aide de ciseaux microchirurgicaux et d’une pince à épiler sous un stéréomicroscope avec un grossissement d’au moins 4x.
   4. Conservez l’échantillon humide dans un tube de micro-centrifugeuse d’un volume de 1,5 mL avec un morceau de lingette pelucheuse humidifié avec de l’eau.
   5. Placez la résine composite dentaire emballable dans la fente d’échantillon sur la scène, puis placez l’hémi-mandibule fraîche dans le composite. Avant le montage, assurez-vous que la surface osseuse en contact avec le composite dentaire est exempte de tout tissu mou et sèche, sinon le composite dentaire ne durcira pas correctement.
   6. Ajustez la position de l’hémi-mandibule jusqu’à ce que la première molaire soit centrée au niveau de la rainure médiane de la scène. Assurez-vous que la surface occlusale est horizontale. Durcir le composite lorsqu’il est satisfait du positionnement.
      REMARQUE: De petites quantités supplémentaires de composites dentaires peuvent être placées sur les côtés de l’hémi-mandibule et / ou à travers l’inciseur pour aider à stabiliser l’échantillon.
   7. Placez la lingette non pelucheuse humidée à l’intérieur des bassins d’humidité au stade de l’échantillon. Placer le composite dentaire sur la surface occlusale de la première molaire. Avant de fermer la chambre, assurez-vous que rien ne bloque le chemin des rayons X au niveau de l’échantillon.
   8. Fixez la chambre dans le micro-CT. Vissez la chambre dans l’étape d’échantillonnage micro-CT afin que le mouvement pendant l’imagerie soit minimisé.
   9. Allumez les rayons X et prenez des images 2D tout en abaissant l’enclume verticalement, jusqu’à ce que la pointe de l’enclume soit entourée par le composite mais qu’aucune augmentation de la force ne soit détectée.
   10. Une fois que l’enclume est intégrée dans le composite, fermez la source de rayons X. Ensuite, ouvrez la chambre micro-CT et durcissez le composite à travers la fenêtre en plexiglas claire.
2. Paramètres de micro-TDM
   1. Réglez la tension source sur 40 kV et le courant sur 200 μA. À l’aide d’un détecteur à grossissement 10x, placez l’échantillon dans le cadre de la vue. Utilisez le binning de 2 pour les images capturées.
      REMARQUE: Étant donné que la LDO est significativement moins dense que l’os et la dent, la visualisation de la LDO nécessite une puissance et un temps d’exposition plus élevés. Ce protocole fournira des paramètres pour visualiser le PDL.
   2. Définissez le temps d’exposition d’une seule image sur 25 s. Définissez la rotation de l’étage d’échantillonnage sur une plage de 183 degrés ou plus. Définissez l’analyse pour 2500 projections. N’utilisez aucun filtre source de rayons X, les scans résultants ont une taille de voxel de 0,76 μm de chaque côté.
   3. Recueillir un balayage de référence pour une reconstruction appropriée selon les directives de micro-CT. Utilisez 1/3 de nombre d’images de référence comme projections totales. Reconstruisez le volume sans binning supplémentaire, à l’aide d’un algorithme filtré par rétroprojection.

3. Méthode de compensation (Figure 3)

1. Préparer cinq tubes à micro-centrifugeuses de 1,5 mL.
2. Préparer 1,4 mL des solutions suivantes dans des tubes micro-centrifugeuses de 1,5 mL : 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 50 % d’éthanol (EtOH) dans de l’eau désionisée (DI), 70 % d’EtOH dans de l’eau DI et deux tubes à 100 % d’EtOH.
   REMARQUE: Le PFA est utilisé pour la fixation de l’échantillon. L’effacement ECi fonctionnera également sur des échantillons non fixes. Pour effacer les échantillons non corrigés, ignorez simplement l’étape PFA.
3. Placez l’hémi-mâchoire inférieure disséquée dans 4% PFA. Couvrir avec du papier d’aluminium et placer sur la bascule sur un réglage doux à température ambiante pendant 6 h.
4. Déplacez l’hémi-mandibule à 50% EtOH. Placez-le sur la bascule recouverte de lumière pendant 16 h.
5. Déplacez l’hémi-mandibule à 70% EtOH. Placez-le sur la bascule recouverte de lumière pendant 16 h.
6. Déplacez l’hémi-mandibule à 100% EtOH. Placez-le sur la bascule recouverte de lumière pendant 16 h.
7. Répétez 3.6. dans le deuxième tube 100% EtOH.
8. Préparer 5 mL d’ECi dans un tube en verre ou en polypropylène.
   NOTA : L’ECi dissout le polystyrène, mais pas le polypropylène. En outre, si vous n’utilisez pas un tissu avec des protéines fluorescentes, l’échantillon peut être exposé à la lumière pendant la procédure de nettoyage.
9. Déplacez l’hémi-mandibule vers le tube ECi. Couvrir le tube avec du papier d’aluminium et placer sur la bascule sur un réglage doux pour un minimum de 12 h.
   Remarque : le protocole peut être suspendu ici. L’échantillon déshydraté peut être stocké dans eCi à température ambiante. Le point de congélation ou de fusion de l’ECi est de 6,5 à 8,0 °C. Ne pas conserver à 4 °C.
10. L’hémi-mandibule est prête pour l’imagerie avec microscope à fluorescence.
    REMARQUE: Pendant l’imagerie, l’échantillon doit être immergé dans l’ECi pour rester optiquement transparent.

Résultats

Ce document présente une méthode pour produire OTM aussi bien que deux méthodes pour la formation image 3D des fibres de collagène à l’intérieur du PDL sans n’importe quelle sectionnement. À des fins de recherche sur les animaux, lorsque l’alignement des dents n’est pas nécessaire, un mouvement dentaire est considéré comme orthodontique s’il génère un remodelage de l’os alvéolaire à tous les niveaux racinaires. Un niveau de force constant appliqué sur les dents est nécessaire afin de générer...

Discussion

La génération d’OTM chez la souris est fortement souhaitée en raison de la taille, de la génétique et des avantages de la manipulation. L’utilisation de la mandibule permet une manipulation facile à la fois en termes de dissection tissulaire ainsi que de préparation des échantillons et d’imagerie. Ici nous avons présenté une méthode pour générer OTM avec le mouvement translationnel de la dent à l’intérieur de l’os dans les 7 jours d’OTM. En utilisant ce protocole, la durée globale du mouvement...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2