Analyse du vasospasme cérébral dans un modèle murin d’hémorragie sous-arachnoïdienne avec ultrason duplex transcrânien à haute fréquence

Résumé

Le but de ce manuscrit est de présenter une méthode basée sur l’échographie qui permet l’imagerie in vivo du flux sanguin dans les artères cérébrales chez la souris. Nous démontrons son application pour déterminer les changements des vitesses de flux sanguin liées au vasospasm dans les modèles murins de l’hémorragie sous-arachnoïdienne (SAH).

Résumé

Le vasospasme cérébral qui survient dans les semaines qui suit l’hémorragie sous-arachnoïdienne, un type d’accident vasculaire cérébral hémorragique, contribue à retarder l’ischémie cérébrale. Un problème rencontré dans les études expérimentales utilisant des modèles murins de SAH est que les méthodes pour la surveillance in vivo du vasospasm cérébral chez la souris manquent. Ici, nous démontrons l’application de l’échographie à haute fréquence pour effectuer des examens d’échographie duplex transcrâniens sur des souris. Utilisant la méthode, les artères carotides internes (AIC) ont pu être identifiées. Les vitesses de flux sanguin dans l’ICAs intra-crânien ont été accélérées de manière significative après induction de SAH, alors que les vitesses de flux sanguin dans l’ICAs extracranial demeuraient basses, indiquant le vasospasm cérébral. En conclusion, la méthode démontrée ici permet la surveillance in vivo fonctionnelle et non envahissante du vasospasm cérébral dans un modèle murin de SAH.

Introduction

L’hémorragie sous-arachnoïdienne spontanée (HSA) est une forme d’accident vasculaire cérébral hémorragique principalement causée par la rupture d’un anévrisme intracrânien^1. Le résultat neurologique est principalement influencé par deux facteurs: lésion cérébrale précoce (EBI), qui est causée par les effets du saignement et de l’ischémie cérébrale globale transitoire associée, et ischémie cérébrale retardée (ICD), qui se produit pendant les semaines suivant le saignement^2,3. DCI a été signalé à affecter jusqu’à 30% des patients sah². La physiopathologie de la DCI implique le vasospasm cérébral angiographique, une microcirculation perturbée causée par des microvasospasmes et des microthromboses, des dépressions de propagation corticales, et des effets déclenchés par l’inflammation^4. Malheureusement, la physiopathologie exacte reste incertaine et il n’y a aucun traitement disponible qui empêche efficacement DCI³. Par conséquent, DCI est étudié dans de nombreuses études cliniques et expérimentales.

De nosjours, la plupart des études expérimentales sur l’HSA utilisent des modèles de petits animaux, en particulier chez les souris^{5,6,7,8,9,10,11,12,13.} Dans de telles études, le vasospasm cérébral est fréquemment étudié comme point final. Il est courant de déterminer le degré de vasospasme ex vivo. C’est parce que les méthodes non envahissantes pour l’examen in vivo du vasospasm cérébral exigeant le temps court d’anesthésie et imposant seulement peu de détresse aux animaux manquent. Cependant, l’examen du vasospasm cérébral in vivo serait avantageux. C’est parce qu’il permettrait des études longitudinales in vivo sur le vasospasme chez la souris (c.-à-d. l’imagerie du vasospasme cérébral à différents moments pendant les jours suivant l’induction de SAH). Cela améliorerait la comparabilité des données acquises à différents moments. De plus, l’utilisation d’un plan d’étude longitudinale est une stratégie visant à réduire le nombre d’animaux.

Ici, nous démontrons l’utilisation de l’échographie transcrânienne à haute fréquence pour déterminer le flux sanguin dans les artères cérébrales chez la souris. Nous montrons que, semblable à l’échographie transcranial de Doppler (TCD) ou à l’échographie duplex couleur-codée transcranial (TCCD) dans la pratique clinique^{14,15,16,17,18,}cette méthode peut être employée pour surveiller le vasospasm cérébral en mesurant les vitesses de flux sanguin des artères intracrâniennes après induction de SAH dans le modèle murin.

Protocole

Les expérimentations animales ont été approuvées par le comité responsable de la protection des animaux (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) et menées conformément à la loi allemande sur le bien-être des animaux (TierSchG). Toutes les lignes directrices internationales, nationales et institutionnelles applicables pour le soin et l’utilisation des animaux ont été suivies. Dans cette étude, nous avons exécuté des mesures des vitesses de flux sanguin des artères intra-crâniennes et extracranial chez les souris femelles de C57BL/6N âgées 11-12 semaines avec un poids corporel entre 19-21 g. Les souris ont été soumises soit à l’induction de SAH, soit à une chirurgie simulée, qui a été décrite en détail ailleurs^10,12,13.

1. Préparation du matériel

1. Allumez l’appareil à ultrasons et entrez l’ID de l’animal.
2. Chauffer la plaque chauffante du système à ultrasons à 37 °C. Assurez-vous que la sonde de température rectale est prête à l’emploi.
3. Utilisez un bain-marie pour chauffer le gel à ultrasons à 37 °C. Préparez une crème d’épilation, une crème de contact pour les électrodes et une pommade pour les yeux.

2. Anesthésie

1. Induire l’anesthésie en mettant la souris dans une chambre rincée avec 4% d’isoflurane et 40% d’O2 pendant 1 min. Protégez les yeux avec une pommade pour les yeux. Continuer seulement après qu’une anesthésie suffisamment profonde a été atteinte (absence de réactions aux stimuli de douleur).
2. Maintenir l’anesthésie avec 1,5% d’isoflurane et 40%_d’O2 à l’aide d’un masque d’anesthésie tout au long de la procédure.

3. Détermination des vitesses de flux sanguin des artères carotides internes intracrânienne avec échographie duplex transcrânienne à haute fréquence

1. Placez la souris en position couchée sur la plaque chauffante du système à ultrasons pour maintenir une température corporelle de 37 °C.
2. Enrobez les quatre extrémités de l’animal de pâte conductrice et fixez-les avec du ruban adhésif sur les électrodes ECG intégrées dans la carte. Vérifiez si les paramètres physiologiques (ECG, signal respiratoire) sont affichés correctement sur l’écran du système d’imagerie (p. ex. Vevo3100). Si nécessaire, ajustez le niveau d’anesthésie pour obtenir la fréquence cardiaque cible de 400-500 battements par minute (bpm).
3. Placez du lubrifiant sur une sonde de température rectale et insérez-la soigneusement pour surveiller la température corporelle. Utilisez une lampe chauffante supplémentaire si nécessaire.
4. Avant le premier examen, retirez chimiquement la fourrure à l’occiput à l’aide de crème d’épilation. Utilisez un coton-tige pour étaler et frotter la crème pendant 2 min jusqu’à ce que les poils commencent à tomber.
   1. Après 2 minutes supplémentaires, retirez la crème et les poils avec une spatule et désinfectez la peau avec un antiseptique alcoolique. Enrobez-le de gel à ultrasons réchauffé à 37 °C.
5. Utilisez un transducteur linéaire à réseau de 38 MHz et une fréquence d’images supérieure à 200 images/s pour acquérir des images ultrasonores et fixer la sonde dans le bras mécanique. Placez le transducteur sur l’occiput incliné vers l’arrière de 30°.
6. Utilisez le mode Doppler de luminosité(B) et le mode Doppler d’onde-(CW) pour visualiser l’artère carotide interne intracrânienne droite et déplacez le transducteur avec l’unité de commande en arrière et en avant, jusqu’à ce que l’écoulement maximal des artères soit trouvé.
7. Pour collecter des informations anatomiques, utilisez les modes B et Doppler traditionnels et commencez l’acquisition en cliquant sur le bouton Acquérir.
   1. Pour enregistrer des informations sur les caractéristiques d’écoulement des vaisseaux intracrâniens, cliquez sur le bouton Doppler Pulse-Wave (PW), placez le volume de l’échantillon au centre du vaisseau et acquérez une boucle de cinéma de plus de 3 s.
8. Procédez de la même manière que le côté gauche.
9. Procédez avec les artères carotides extracrâniennes.

4. Détermination des vitesses de flux sanguin des artères carotides internes extracrâniennes avec échographie duplex à haute fréquence

1. Placez la souris en décubitus dorsal sur la plaque chauffante du système à ultrasons pour maintenir une température corporelle de 37 °C.
2. Enrobez les quatre extrémités de l’animal de pâte conductrice et fixez-les avec du ruban adhésif sur les électrodes ECG intégrées dans la carte. Vérifiez à nouveau l’affichage correct des paramètres physiologiques à l’écran.
3. Avant le premier examen, retirez chimiquement les cheveux au niveau du cou avant en utilisant une crème d’épilation comme décrit ci-dessus. Enrobez le cou avant de gel à ultrasons réchauffé à 37 °C.
4. Utilisez un transducteur linéaire à matrice de 38 MHz et une fréquence d’images supérieure à 200 images/s pour acquérir des images ultrasonores. Placez le transducteur parallèlement à l’animal et ajustez la position afin d’obtenir des images longitudinales de l’artère carotide droite.
5. Utilisez le mode Doppler de luminosité (B) et le mode Doppler d’onde de couleur (CW) pour visualiser l’artère carotide droite. L’image devrait contenir l’artère carotide commune droite (RCC), l’artère carotide interne droite (RICA) et l’artère carotide externe droite (RECA).
6. Pour collecter des informations anatomiques, utilisez les modes B et Doppler traditionnels et commencez l’acquisition en cliquant sur le bouton Acquérir.
   1. Pour enregistrer des informations sur les caractéristiques d’écoulement de l’artère carotide extracrânienne, cliquez sur le bouton Doppler Pulse-Wave (PW), placez le volume d’échantillon au centre du milieu de l’artère carotide commune, de l’artère carotide interne et de l’artère carotide externe et acquérez une boucle ciné de plus de 3 s.
7. Procédez de la même manière que le côté gauche.
8. Terminez l’anesthésie et retirez l’animal de la plaque chauffante. Ramener l’animal dans une cage placée dans un incubateur chauffé à 37 °C pendant 1 heure pour prévenir l’hypothermie et vérifier la récupération complète.

5. Traitement des données d’échographie

1. Utilisez un poste de travail externe pour le post-traitement des données ultrasonores à haute fréquence. Exportez les images et les boucles de cinéma en mode B, CW-Doppler et PW-Doppler.
2. Ouvrez l’étude d’échographie exportée. Sélectionnez un animal et ouvrez la boucle de cinéma PW-Doppler de l’artère carotide intracrânienne. Dans ce protocole typiquement 7 à 8 battements de coeur et les courbes d’écoulement-vitesse correspondantes sont enregistrés.
3. Mettez en pause la boucle de cinéma et cliquez sur le bouton Mesure. Choisissez le paquet vasculaire et cliquez sur RICA PSV pour mesurer la pression systolique maximale (PSV). Maintenant, cliquez à gauche sur le pic d’une courbe de vitesse et tirez la ligne droite à la ligne zéro. Déterminez la mesure en cliquant avec le bouton droit de la souris.
4. Choisissez maintenant RICA EDV pour mesurer la vitesse enddiastolique (EDV). Cliquez à gauche sur éruption minimale de la courbe de vitesse à la fin de la diastole. Tirez la ligne directement à la ligne zéro et déterminez la mesure en cliquant avec le bouton droit de la souris.
5. Choisissez RICA VTI pour mesurer l’intégrale de temps de vitesse (VTI). Cliquez à gauche au début d’une courbe de vitesse et suivez la courbe avec la souris jusqu’à la fin du plateau diastolique. Cliquez ensuite à nouveau à droite pour déterminer la mesure.
6. Exportez les données des artères carotides internes intracérébrales à l’aide du bouton rapport. Appuyez sur Exporter et enregistrez les données en tant que fichier de rapport VSI.
7. Utilisez la même approche pour mesurer le PSV, l’EDV et le VTI des artères carotides internes extracrânienne droites et exportez les données en conséquence.
8. Procédez de la même manière que le côté gauche.

Résultats

Chez 6 souris, dans 3 dont SAH a été induit utilisant le modèle endovascular de perforation de filament tandis que 3 ont obtenu la chirurgie feinte, les vitesses de flux sanguin de l’artère carotide interne intra-crânienne (AIC) et de l’AIC extracranial ont été déterminées un jour avant chirurgie, et 1, 3, et 7 jours après chirurgie. Les mesures ont été réalisées dans le cadre des examens d’échocardiographie d’une autre étude sous anesthésie à l’isoflurane tout en maintenant la température co...

Discussion

Au meilleur de notre connaissance, cette étude est la première à présenter un protocole pour la surveillance du vasospasm cérébral dans un modèle murin de SAH avec l’ultrason duplex couleur-codé par couleur transcranial à haute fréquence. Nous montrons que cette méthode peut mesurer une augmentation des vitesses de flux sanguin intracrânien après induction de SAH chez la souris. En médecine humaine ce phénomène est bien connu^3,15. Plusieurs étu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balea hair removal creme	Balea; Germany	ASIN B0759XM39V	hair removal creme
C57BL/6N mice	Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France	n.a.	mice
Corneregel	Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA	REF 81552983	eye ointment, lube
cotton swabs	Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany	REF 44302010	cotton swabs
Ecco-XS razor	Tondeo; Soligen, Germany	DE 28693396	razor
Electrode cream	GE; Boston, MA, USA	REF 21708318	conductive paste
Heating plate	Medax; Kiel, Germany	2005-205-01
Isoflurane	Abvie; Wiesbaden, Germany	n.a.	volatile anesthetic
Leukofix	BSN medical; Hamburg, Germany	REF 02137-00	tape
Mechanical arm + micromanipulator	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11277
Microbac tissues	Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany	REF 981387	antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51068-30	ultrasound transducer
Sonosid	ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany	REF 782010	ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11179
UniVet-Porta	Groppler; Oberperasberg, Germany	S/N BKGM0437	isoflurane vaporizer
Vevo3100	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51073-45	ultrasonography device
VevoLab software	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	n.a.	evaluation software