Évaluation et quantification des lacunes micro-épithéliales dans la muqueuse colique à l’aide de la coloration par immunofluorescence

Résumé

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode pour visualiser l’emplacement spécifique de l’endroit où la perméabilité transcellulaire et paracellulaire est renforcée dans la muqueuse colique enflammée. Dans ce test, nous appliquons un colorant fluorescent de 10 kDa conjugué à un dextran fixable à la lysine pour visualiser les régions à haute perméabilité (HPR) dans la muqueuse colique.

Résumé

Les cellules épithéliales qui tapissent la muqueuse intestinale créent une barrière physique qui sépare le contenu luminal de l’interstitium. L’altération de la barrière épithéliale a été associée au développement de diverses pathologies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Dans la muqueuse enflammée, les érosions superficielles ou micro-érosions qui corrompent les monocouches épithéliales correspondent à des sites de haute perméabilité. Plusieurs mécanismes ont été impliqués dans la formation des micro-érosions, notamment la mue cellulaire et l’apoptose. Ces micro-érosions représentent souvent des trous épithéliales microscopiques répartis de manière aléatoire dans le côlon. La visualisation et la quantification de ces lacunes épithéliales sont devenues un outil important pour étudier la fonction de la barrière épithéliale intestinale. Ici, nous décrivons une nouvelle méthode pour visualiser l’emplacement spécifique de l’endroit où la perméabilité transcellulaire et paracellulaire est renforcée dans la muqueuse colique enflammée. Dans ce test, nous appliquons un colorant fluorescent de 10 kDa conjugué à un dextran fixable à la lysine pour visualiser les régions à haute perméabilité (HPR) dans la muqueuse colique. L’utilisation supplémentaire de marqueurs de mort cellulaire a révélé que les HPR englobent les foyers apoptotiques où l’extrusion/excrétion épithéliale se produit. Le protocole décrit ici fournit une approche simple mais efficace pour visualiser et quantifier les micro-érosions dans l’intestin, ce qui est un outil très utile dans les modèles de maladies, dans lesquels la barrière épithéliale intestinale est compromise.

Introduction

La muqueuse gastro-intestinale (GI) crée une barrière physique qui sépare l’environnement extracellulaire et le milieu interne de l’hôte, et participe à l’absorption des nutriments, de l’eau et des électrolytes. La barrière intestinale comprend une couche de mucus constituée de glycoprotéines, une monocouche de cellules épithéliales et la lamina propria sous-jacente sont des cellules immunitaires et stromales. Les cellules épithéliales intestinales formant la barrière physique sont reliées entre elles par différents complexes protéiques, notamment la jonction adhérente (AJ), la jonction serrée (TJ) et les desmosomes (DM). L’altération de la fonction de la barrière épithéliale augmente la perméabilité intestinale et permet la translocation de substances nocives et d’agents pathogènes de la lumière vers l’interstitium¹. Il existe un nombre croissant de maladies où la barrière épithéliale est compromise, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI) comme la maladie de Crohn (MC), la colite ulcéreuse (CU) et la colite indéterminée (CI). L’incidence des MICI augmente dans le monde entier, avec une prévalence approchant les 0,5 % en Occident. Bien que les causes des MICI ne soient pas claires, la réponse immunitaire/inflammatoire excessive déclenchée dans la paroi intestinale contribue directement à la perturbation de la barrière épithéliale en limitant le rétablissement de l’homéostasie épithéliale intestinale ^2,3,4. De plus, les patients atteints d’inflammation colique de longue date présentent un risque élevé de développer un cancer colorectal (CCR)⁵. D’autres pathologies associées à la perturbation de la barrière épithéliale intestinale sont le syndrome du côlon irritable, l’obésité, la maladie cœliaque, la sensibilité au gluten non cœliaque et les allergies alimentaires⁶. Pour ces raisons, il est urgent de développer des approches expérimentales permettant d’analyser l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale dans des modèles animaux imitant la pathogenèse se produisant chez l’homme.

Ici, nous avons évalué la paracellule passive gastro-intestinale et la perméabilité transcellulaire associée à un processus inflammatoire dans l’épithélium colique à l’aide d’une technique simple. Pour étudier le flux transmural des macromolécules, nous avons mesuré la diffusion passive du FITC-dextran (4 kDa) et du RITC-dextran (10 kDa) dans les sacs côliques ex vivo. De plus, en injectant un dextran fluorescent de 10 kDa fixable à la lysine dans la lumière des sacs intestinaux, nous avons spécifiquement identifié les zones à haute perméabilité dans la muqueuse enflammée. L’utilisation de marqueurs d’apoptose et d’anticorps contre les protéines AJ nous a permis de démontrer que les zones de haute perméabilité de la muqueuse enflammée correspondent à des régions spécifiques où les cellules épithéliales subissent une apoptose et où les jonctions cellule-cellule sont perturbées. Cette nouvelle technique peut être utilisée pour évaluer l’intégrité de l’épithélium dans n’importe quel modèle où la barrière épithéliale intestinale est compromise.

Protocole

Toutes les procédures ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (CICUAL) de CINVESTAV.

1. Préparation des matériaux et des réactifs

1. Préchauffer la solution de Hartmann (130 mM de NaCl, 28 mM de lactate, 4 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl₂) à 37 °C tout en bouillonnant avec 95 % d’O₂/5 % de CO₂. Maintenez le pH physiologique (7,4) de la solution.
2. Pour analyser la perméabilité paracellulaire passive, préparer une solution de travail en dissolvant 1 mg/mL de FITC-Dextran (4 kDa) et 1 mg/mL de RITC-Dextran (10 kDa) dans une solution de Hartmann préchauffée.
3. Préparez une solution de 4 μg/mL d’Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) dans la solution de Hartmann. Conservez les solutions de travail dans un tube conique de 15 ml et protégez-les de la lumière jusqu’à l’utilisation.
   REMARQUE : 300 μL de solution de travail par côlon seront nécessaires.
4. Préparez une suture chirurgicale en coupant deux sections de 5 cm pour chaque gros intestin. Enroulez les sutures en un nœud non fermé.

2. Dissection et préparation du trac gastro-intestinal

1. Retenir la nourriture solide pendant 6 heures avant d’euthanasier les souris. Fournir de l’eau potable à volonté.
   REMARQUE : Si possible, placez les souris sur des suppléments de gel nutritif (eau purifiée, mélasse, citrouille, sirop de maïs, graines de tournesol, protéines de blé, huile végétale, acide alimentaire, hydrocolloïdes, électrolytes, fibre de maïs, mélange minéral NIH-31M, mélange de vitamines NIH-31M).
2. Euthanasier les souris dans une chambre de CO₂ suivie d’une luxation cervicale conformément aux protocoles éthiques de l’établissement.
3. Stérilisez l’abdomen et le thorax avec de l’éthanol à 70 %.
4. À l’aide d’une paire de ciseaux, faites une incision au milieu de l’abdomen et exposez la cavité péritonéale.
5. À des fins d’orientation, séparez et disséquez le gros intestin en coupant à l’extrémité de l’intestin grêle (partie terminale de l’iléon) juste avant le cæcum, puis au niveau de la bordure anale. À l’aide d’une pince chirurgicale, on retire délicatement le mésentère et on place le côlon dans la solution de Hartmann.
6. Il est important de noter que, pour maintenir l’uniformité entre les animaux, identifiez les sections similaires et utilisez-les pour évaluer la perméabilité. L’utilisation de régions proches du caecum est fortement recommandée.
7. Utilisez une seringue à insuline équipée d’une canule en plastique émoussée pour rincer doucement le contenu luminal présent dans le côlon. Si les selles sont fermes, poussez soigneusement à l’aide d’une pince émoussée. Une fois les matières fécales retirées, laver 3 fois avec 400 μL de solution Hartmann.
8. Attachez la région proximale (la plus proche du cæcum) et placez une boucle de suture pré-nouée dans la région distale du côlon. À l’aide d’une seringue équipée d’une canule en plastique émoussée, remplissez le sac intestinal avec la solution contenant la sonde de désir. Retirez délicatement la canule en plastique et attachez la boucle dans la région distale.
9. Placez le sac intestinal dans un tube conique de 15 mL avec 6 mL de solution de Hartmann et incubez pendant 1 h pour évaluer le flux paracellulaire passif de FITC/RITC-Dextran ou 30 min pour analyser le flux de l’Alexa Fluor Fixable-Dextran.
   1. Maintenez les tubes coniques contenant les sacs intestinaux à 37 °C avec 5 % de CO₂ et protégez-les de la lumière.
10. Mesurer la perméabilité passive à l’aide de FITC/RITC-Dextran. À 0 et 60 min, prélever un échantillon de 100 μL dans le tube conique et le transférer sur une plaque à 96 puits. Rajoutez 100 μL de support frais pour remplacer le volume perdu.
11. Mesure d’échantillons et d’étalons pour FITC/RITC sur un lecteur de plaques fluorescentes (excitation/émission FITC : 495 nm/519 nm ; Excitation/émission RITC : 570/595 nm).
12. Pour mesurer la perméabilité passive à l’aide d’Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, retirez les intestins, coupez près du nœud de cravate chirurgical et coupez l’intestin pour exposer la lumière afin d’éliminer la solution avec la sonde. Lavez la lumière de l’intestin 2 fois avec la solution froide de Hartmann.
13. Placez le tissu dans un moule à moules préalablement rempli de composé à température de coupe optimale (O.C.T.). Orientez le tissu verticalement ou horizontalement en fonction du côté à sectionner. Conservez les échantillons à -80 °C.

3. Coloration immunofluorescente

1. Fixez des sections congelées de 20 micromètres avec 3,7 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 min à température ambiante, puis lavez-les 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS ; 37 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ et 1,8 mM KH₂ PO₄).
   REMARQUE : Les sections verticales des intestins ont tendance à se détacher si les lavages sont très forts.
2. Perméabiliser avec 0,2 % TX-100/PBS pendant 12 min à température ambiante puis laver 3 fois avec du PBS froid.
3. Bloc avec 0,2 % BSA/PBS pendant 1 heure à température ambiante.
4. Diluer l’anticorps primaire dans une solution bloquante et incuber pendant 1 h à température ambiante. Laver 3 fois avec du PBS froid.
5. Incuber pendant 1 h avec des anticorps secondaires dans une solution bloquante. Laver 3 fois avec du PBS froid.
6. Appliquez un produit de montage sur les coupes et scellez-le à l’aide d’une lamelle. Les lames peuvent être stockées jusqu’à 3 mois à -20 °C.

Résultats

Dans la muqueuse enflammée, les érosions superficielles ou les microérosions compromettent l’intégrité de la monocouche de cellules épithéliales et représentent des sites de haute perméabilité ^7,8. Pour évaluer de telles possibilités, nous avons analysé la perméabilité passive dans la muqueuse colique enflammée dans un modèle murin de colite au sulfate de sodium dextran. En bref, pendant 5 jours, les souris C57...

Discussion

L’homéostasie épithéliale résultant de l’équilibre entre la prolifération cellulaire et l’apoptose épithéliale maintient une barrière intestinale correcte et fonctionnelle. De nombreux troubles cliniques, tels que les MICI, sont accompagnés ou caractérisés par des altérations de la perméabilité intestinale, une inflammation de la muqueuse et une perturbation de l’homéostasie épithéliale¹. L’interaction entre ces processus est encore tr?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Confocal microscope (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD detectors  and White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%	Generic
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionic, fixable
FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescein isothiocyanate–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene Plate	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloidin (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secondary antibodies (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-conjugated secondary antibodies
Suture threads	Generic		Braided silk and braided polyester surgical sutures are prefered.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1