Modèles artériels 3D cultivés en cellules in vitro pour l’étude du ciblage de médicaments vasculaires sous flux

Résumé

Ici, nous présentons un nouveau protocole pour étudier et cartographier le dépôt ciblé de porteurs de drogue aux cellules endothéliales dans les modèles fabriqués, réels, tridimensionnels d’artère humaine sous l’écoulement physiologique. La méthode présentée peut servir de nouvelle plate-forme pour cibler des porteurs de drogue dans le système vasculaire.

Résumé

L’utilisation de modèles tridimensionnels (3D) d’artères humaines, conçus avec les dimensions et l’anatomie correctes, permet la modélisation appropriée de divers processus importants dans le système cardiovasculaire. Récemment, bien que plusieurs études biologiques aient été réalisées à l’aide de tels modèles 3D d’artères humaines, elles n’ont pas été appliquées pour étudier le ciblage vasculaire. Cet article présente une nouvelle méthode pour fabriquer des modèles artériels humains reconstruits de taille réelle à l’aide d’une technique d’impression 3D, les aligner sur des cellules endothéliales humaines (CE) et étudier le ciblage des particules sous flux physiologique. Ces modèles ont l’avantage de reproduire la taille physiologique et les conditions des vaisseaux sanguins dans le corps humain en utilisant des composants à faible coût. Cette technique peut servir de nouvelle plate-forme pour étudier et comprendre le ciblage des médicaments dans le système cardiovasculaire et peut améliorer la conception de nouvelles nanomédecines injectables. De plus, l’approche présentée peut fournir des outils importants pour l’étude de l’administration ciblée de différents agents pour les maladies cardiovasculaires dans des conditions physiologiques et de flux spécifiques au patient.

Introduction

Plusieurs approches ont récemment été appliquées en utilisant des modèles 3D d’artères humaines^1,2,3,4,5. Ces modèles reproduisent l’anatomie physiologique et l’environnement de différentes artères dans le corps humain in vitro. Cependant, ils ont été principalement utilisés dans les études de biologie cellulaire. Les études actuelles sur le ciblage vasculaire des particules vers l’endothélium comprennent des simulations informatiques in silico ^6,7,8,des modèles microfluidiques in vitro ^9,10,11et des modèles animaux in vivo ^12. Malgré les informations qu’ils ont fournies, ces modèles expérimentaux n’ont pas réussi à simuler avec précision le processus de ciblage qui se produit dans les artères humaines, dans lesquelles le flux sanguin et l’hémodynamique constituent des facteurs dominants. Par exemple, l’étude du ciblage des particules vers les régions athérosclérotiques dans la bifurcation de l’artère carotide, qui sont connues pour leur schéma d’écoulement de recirculation complexe et leur gradient de contrainte de cisaillement de la paroi, peut avoir un impact sur le trajet effectué par les particules avant qu’elles n’atteignent l’endothélium^13,14,15,16. Par conséquent, ces études doivent être effectuées dans des conditions qui reproduisent l’environnement physiologique, c’est-à-direla taille, la dimension, l’anatomie et le profil d’écoulement.

Récemment, ce groupe de recherche a fabriqué des modèles artériels humains reconstruits en 3D pour étudier le dépôt et le ciblage des particules sur la vascularisation^17. Les modèles étaient basés sur des répliques géométriques 3D de vaisseaux sanguins humains, qui ont ensuite été cultivés avec des CE humains qui ont ensuite tapoté leurs parois internes. De plus, lorsqu’ils sont soumis à un système de perfusion qui produit un flux physiologique, les modèles reproduisent avec précision les conditions physiologiques. Le système de perfusion a été conçu pour perfuser les fluides à débit constant, à l’aide d’une pompe péristaltique dans les configurations fermées et en circuit ouvert(Figure 1). Le système peut être utilisé comme circuit fermé pour cartographier le dépôt de particules et le ciblage vers les cellules ensemencées à l’intérieur du modèle carotide. En outre, il peut être utilisé comme circuit ouvert pour laver les particules non adhérentes à la fin des expériences et pour nettoyer et entretenir le système. Cet article présente des protocoles pour la fabrication de modèles 3D de la bifurcation carotide humaine, la conception du système de perfusion et la cartographie du dépôt de particules ciblées à l’intérieur des modèles.

Protocole

REMARQUE: Ce protocole décrit la fabrication d’un modèle 3D de l’artère carotide et peut être appliqué pour générer toute autre artère d’intérêt en modifiant simplement les paramètres géométriques.

1. Conception et fabrication d’une bifurcation 3D du modèle de l’artère carotide humaine

1. Choisissez des images de patients ou des géométries précédemment étudiées de la bifurcation humaine de l’artère carotide, et créez un modèle de conception assistée par ordinateur du moule qui doit être imprimé.
   REMARQUE: La bifurcation de l’artère carotide a une entrée et deux sorties. Il est important de concevoir un cadre de moule 3D autour de l’artère et des supports d’impression temporaires entre le cadre et le moule de l’artère(Figure 2A-C).
2. Imprimez les géométries à l’aide d’une imprimante 3D. Coupez les supports d’impression temporaires et utilisez du papier de verre pour polir et lisser les moules, en particulier dans les zones où les supports ont été coupés. Rincez le modèle poncé avec de l’alcool isopropylique pour éliminer la poussière plastique et laissez sécher complètement dans une hotte chimique pendant 2-3 h.
   NOTE : Ici, les moules imprimés étaient en résine transparente v4(figure 2D,E).
3. Pour dissoudre facilement le plastique, vaporisez les moules avec de la laque transparente à l’intérieur d’une hotte chimique et laissez sécher à l’air pendant 1 h. Répétez ce 3x.
   REMARQUE: Ici, 2X Ultra Cover Clear Spray a été utilisé, mais tout autre type devrait convenir tant qu’il ne s’agit pas de laque en bois. Confirmez qu’il n’y a plus de plastique exposé car le plastique peut réagir avec le silicone et l’empêcher de se solidifier correctement. La qualité de la surface pulvérisée déterminera la qualité de la surface du modèle silicone final.
4. Coupez des lames /bandes rectangulaires transparentes de plastique lisse des mêmes dimensions que le cadre du moule, et collez-les à l’aide de la laque sur le cadre de tous les côtés et d’un côté du cadre, de sorte qu’il sera scellé en bas et ouvert en haut. Appliquez la laque à l’aide d’un pinceau à l’intérieur d’une hotte chimique et laissez les lames sécher complètement pendant au moins 24 h(figure 2F).
5. Pour préparer le mélange de caoutchouc de silicone, ajoutez du silicone liquide avec son agent de durcissement (rapport de masse 1:10) dans une plaque en plastique et remuez bien pour assurer un mélange complet. Pour le modèle carotide, ajouter 54 g de silicone et 6 g de son agent de durcissement.
6. Refroidir le mélange pendant 15 min à 4 °C, puis le dégazer dans un dessicateur sous vide jusqu’à ce que toutes les bulles d’air aient été éliminées. Placez le moule dans le dessicateur (avec le côté ouvert vers le haut), versez lentement le mélange de silicone dans le moule et retirez à nouveau les bulles d’air jusqu’à ce que le mélange soit clair.
7. Laissez le moule reposer avec le silicone pendant la nuit à température ambiante (si possible, laissez-le dans le dessicateur sans vide). Si le mélange n’a pas complètement séché, incuber à 60 °C pendant encore quelques heures.
8. Une fois le mélange complètement sec, retirez les lames transparentes et plongez le modèle dans de l’acétone absolue pendant 48 h dans une hotte chimique jusqu’à ce que le plastique soit complètement dissous. Retirez tous les restes de plastique avec un bâton en bois. Pour évaporer l’acétone piégée à l’intérieur du modèle, incuber à 60 °C pendant au moins 4 jours avant l’ensemencement cellulaire.

2. Culture cellulaire et ensemencement dans des modèles

1. Préparer trois connecteurs pour le modèle carotide : un pour l’entrée et deux pour les sorties (voir la table des matériaux). Stériliser le modèle et les connecteurs par irradiation ultraviolette dans une hotte biologique pendant 20 min.
2. Enrober les modèles de 4 mL de fibronectine à 100 μg/mL (dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) pendant 2 h à 37 °C ou pendant une nuit à 4 °C. Injecter la solution de fibronectine dans le modèle à travers l’entrée à l’aide d’une seringue en plastique de 5 ou 10 mL. Retirez la fibronectine par la sortie et lavez le modèle avec un milieu EC.
3. Suspendre 2,5 × 10^cellules/mL de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs, passage < 6), et remplir le modèle avec 4 mL de la suspension cellulaire à l’aide d’une seringue en plastique de 5 ou 10 mL(Figure 3A). Placer le modèle sur un rotateur à l’intérieur d’un incubateur (37 °C) à une vitesse de 1 tr/min pendant 48 h pour assurer un ensemencement homogène. Assurez-vous que le modèle est bien fixé au rotateur(Figure 3B). Changer le milieu après 24 h à l’intérieur d’une hotte biologique, et revenir au rotateur à l’intérieur de l’incubateur pour un autre 24 h.
   REMARQUE: Après 24 h, les cellules sont ensemencées et peuvent être iimages à l’aide d’un microscope.
4. Retirez le modèle du rotateur et lavez-le avec 1x PBS à l’aide d’une seringue en plastique de 10 mL. Pour fixer les cellules, incuber les cellules avec 4 mL de paraformaldéhyde à 4% (PFA) sur le modèle pendant 15 min à l’intérieur d’une hotte chimique, puis rincer 3x avec du PBS. Ajouter 4 mL de PBS et les conserver à 4 °C jusqu’à l’expérience(figure 3C). Colorer les cellules à l’intérieur du modèle à l’aide de protocoles de coloration standard(p. ex., coloration nucléaire avec du 4′,6-diamidino-2-phénylétoïne (DAPI), figure 3D).

3. Conception du système de perfusion

1. Le système de perfusion a deux entrées et deux tubes de sortie. Fusionner les deux entrées en un seul tube d’identification de 4 mm et à nouveau en deux tubes d’identification de 6 mm, qui se connectent à la pompe péristaltique. Fusionner les deux tubes ID de 6 mm sortant de la pompe péristaltique en un seul tube de 4 mm, et le connecter à un amortisseur d’oscillation pour éliminer toute oscillation de la pompe. Utilisez une bouteille à bouche étroite de 250 mL avec un couvercle à trois orifices comme amortisseur.
2. Connectez un orifice à l’entrée de la pompe, fermez le second avec un bouchon utilisé pour la ventilation sous pression en cas d’urgence et étendez le troisième orifice (qui est la sortie) jusqu’au fond de la bouteille.
3. Connectez l’amortisseur à l’entrée du modèle carotide cultivé à l’aide du tube de sortie. Fusionner les deux prises du modèle en un seul tube, qui sera la sortie du système (Tous les tubes sont de 4 mm ID).
4. Diviser le tube de sortie en deux tubes de sortie (un pour le circuit fermé et l’autre pour le conteneur à déchets dans le circuit ouvert). Fixez une pince en plastique à chaque tube.
   REMARQUE : La combinaison de pinces ouvertes/fermées déterminera si le système est dans une configuration de circuit fermé ou ouvert. Comme le montre la figure 1,si les pinces a et d sont proches alors que b et c sont ouvertes, le système est un circuit fermé ; l’inverse amène le système à la configuration du circuit ouvert.
5. Préparer trois contenants : un pouvant contenir 300 mL de liquide (pour circuit fermé) et deux autres de 1 L chacun : un pour le lavage et l’autre pour les déchets (pour circuit ouvert).

4. Configuration en circuit fermé : expérience de perfusion et imagerie

1. Ajouter 300 mL de PBS au conteneur en circuit fermé, ce qui est suffisant pour remplir l’ensemble du système, y compris le tube et le modèle. Placez un tube d’entrée et un tube de sortie (pinces ouvertes b et c) à l’intérieur du récipient.
2. Remplissez le récipient de lavage de 1 L avec de l’eau distillée (pour le lavage à la fin de l’expérience) et laissez l’autre récipient à déchets de 1 L vide. Placer les autres tubes d’entrée et de sortie (serres fermées a et d) dans les récipients de lavage et de déchets, respectivement.
3. Sortir le modèle carotide à culture cellulaire fixe du stockage à 4 °C et vider le PBS. Raccorder l’entrée et les sorties de la carotide comme décrit aux étapes 3.3-3.4. Ne laissez pas le modèle sec pendant une longue période. Une fois le modèle connecté, activez la pompe pour perfuser le fluide.
4. Placez le modèle carotide au microscope. Ouvrez le tube avant l’entrée et après la sortie du modèle carotide. Réglez la pompe péristaltique à 10 tr / min et allumez-la. Augmentez la vitesse par incréments de 5 tr / min, toutes les 4-5 minutes. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites.
5. À 100 tr/min, ce qui équivaut au débit maximal de la forme d’onde physiologique de l’artère carotide humaine (~400 mL/min), ajouter des particules fluorescentes de polystyrène carboxylé (PS) (2 μm, à une concentration de 1,6 μg/mL) aux 300 mL de PBS dans le contenant en circuit fermé. Imagez la région d’intérêt tous les 10 s pendant 1,5 h (images fixes ou vidéo selon les besoins).

5. Configuration en circuit ouvert : l’étape de lavage

1. Ouvrez les pinces des tubes de lavage et de déchets dans les récipients de 1 L (pinces a et d), et fermez immédiatement les pinces des tubes d’entrée et de sortie dans le récipient de 300 mL (pinces b et c) pour changer le système d’une configuration de circuit fermé à ouvert.
2. Laissez la majeure partie de l’eau s’écouler du récipient de lavage vers le conteneur à déchets à 100 tr / min. Avant qu’il ne soit complètement transféré, appuyez sur l’arrêt de la pompe péristaltique et fermez les pinces du tube avant l’entrée et après la sortie du modèle carotide.
3. À l’aide des filtres appropriés, capturez des images du modèle dans la région d’intérêt pour montrer le dépôt et l’adhérence des particules aux cellules. Déconnectez le modèle carotide. Ajoutez soigneusement et lentement 4 mL de PBS avec une seringue de 10 mL à travers l’entrée du modèle.
4. Connectez un « modèle factice » (qui est également un modèle carotide 3D en caoutchouc de silicone utilisé uniquement pour le lavage, sans cellules cultivées) au lieu du modèle carotide, et rincez le système. Ajoutez encore 1 L d’eau et lavez à nouveau le système jusqu’à ce que toute l’eau soit transférée du récipient de lavage aux déchets. Éteignez la pompe péristaltique.

6. Acquisition et analyse des données

1. Acquérir un film numérique de dépôt de particules dans la région d’intérêt avec les images prises pendant l’expérience, à l’aide d’un code logiciel personnalisé (voir la table des matériaux).
2. Pour cartographier le dépôt des particules le long du modèle, carreler plusieurs images pour couvrir la région d’intérêt examinée(Figure 4A,B).
   REMARQUE: Un code logiciel personnalisé peut être écrit pour quantifier le nombre de particules adhérentes sur un site d’intérêt (un exemple de fichier a été fourni en tant qu’informations supplémentaires)^17.

Résultats

Cet article présente un nouveau protocole pour cartographier le dépôt de particules à l’intérieur de modèles d’artères humaines 3D de taille réelle, qui pourraient fournir une nouvelle plate-forme pour la recherche sur l’administration de médicaments. À l’aide d’une technique d’impression 3D, un modèle de l’artère de bifurcation carotide humaine a été fabriqué(figure 2). Le modèle était en caoutchouc de silicone et ensemencé avec des CE humains (

Discussion

Les approches actuelles pour étudier le ciblage vasculaire des particules ne parviennent pas à reproduire les conditions physiologiques présentes dans le corps humain. Présenté ici est un protocole pour fabriquer des modèles 3D-reconstruits des artères humaines pour étudier le ciblage de particules aux ECs tapissant l’artère sous le flux physiologique appliqué utilisant un système de perfusion personnalisé. Lors du choix du matériau pour l’impression 3D, il est préférable d’utiliser un plastique tran...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID