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Résumé

Ce protocole décrit la méthodologie de suivi non invasif des lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs d’antigènes chimériques in vivo avec une plate-forme cliniquement disponible.

Résumé

Les lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs de l’antigène chimérique (CAR) ont montré des résultats sans précédent dans des essais cliniques pivots chez des patients atteints de tumeurs malignes à cellules B ou de myélome multiple (MM). Cependant, de nombreux obstacles limitent l’efficacité et interdisent l’utilisation généralisée des thérapies à base de cellules CAR-T en raison d’un mauvais trafic et d’une infiltration dans les sites tumoraux ainsi que d’un manque de persistance in vivo. De plus, les toxicités potentiellement mortelles, telles que le syndrome de libération de cytokines ou la neurotoxicité, sont des préoccupations majeures. L’imagerie et le suivi efficaces et sensibles des cellules CAR-T permettent l’évaluation du trafic, de l’expansion et de la caractérisation in vivo des lymphocytes T et permettent le développement de stratégies pour surmonter les limites actuelles de la thérapie cellulaire CAR-T. Cet article décrit la méthodologie pour incorporer le symporteur d’iodure de sodium (NIS) dans les cellules CAR T et pour l’imagerie des cellules CAR T en utilisant la tomographie par émission de tétrafluoroborate-positron [18F] ([18F]TFB-PET) dans des modèles précliniques. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles en plus de ceux utilisés pour cette étude.

Introduction

La thérapie cellulaire par récepteur T de l’antigène chimérique (CAR T) est une approche émergente et potentiellement curative dans les hémopathies malignes1,2,3,4,5,6. Des résultats cliniques extraordinaires ont été rapportés après une thérapie par cellules CAR T (CART19) dirigée par CD19 ou par antigène de maturation des cellules B (BCMA)2. Cela a conduit à l’approbation par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis des cellules CART19 pour le lymphome agressif à cellules B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 et lisocabtagene maraleucel)7, la leucémie lymphoblastique aiguë (Tisa-Cel)5,8, le lymphome à cellules du manteau (brexucabtagene autoleuce)9 et le lymphome folliculaire (Axi-Cel)10 . Plus récemment, la FDA a approuvé la thérapie cellulaire CAR-T dirigée par BCMA chez les patients atteints de myélome multiple (MM) (idecabtagene vicleucel)11. De plus, la thérapie par cellules CAR-T pour la leucémie lymphoïde chronique (LLC) est à un stade avancé de développement clinique et devrait recevoir l’approbation de la FDA au cours des trois prochaines années1.

Malgré les résultats sans précédent de la thérapie par cellules CAR-T, son utilisation généralisée est limitée par 1) une expansion insuffisante in vivo des cellules CAR-T ou un mauvais trafic vers les sites tumoraux, ce qui entraîne des taux plus faibles de réponse durable12,13 et 2) le développement d’événements indésirables potentiellement mortels, y compris le syndrome de libération de cytokines (SRC)14,15 . Les caractéristiques du SRC comprennent non seulement l’activation immunitaire entraînant des niveaux élevés de cytokines inflammatoires / chimiokines, mais aussi la prolifération massive des lymphocytes T après perfusion de cellules CAR-T15,16. Ainsi, le développement d’une stratégie validée de qualité clinique pour imager les cellules CAR T in vivo permettrait 1) le suivi des cellules CAR T en temps réel in vivo pour surveiller leur trafic vers les sites tumoraux et découvrir les mécanismes potentiels de résistance, et 2) la surveillance de l’expansion des cellules CAR T et potentiellement prédire leurs toxicités telles que le développement de CRS.

Les caractéristiques cliniques d’un SRC léger sont une forte fièvre, de la fatigue, des maux de tête, des éruptions cutanées, de la diarrhée, de l’arthralgie, de la myalgie et un malaise. Dans les CAS plus sévères, les patients peuvent développer une tachycardie/hypotension, une fuite capillaire, un dysfonctionnement cardiaque, une insuffisance rénale/hépatique et une coagulation intravasculaire disséminée17,18. En général, il a été démontré que le degré d’élévation des cytokines, y compris l’interféron-gamma, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages, l’interleukine (IL)-10 et l’IL-6, est en corrélation avec la gravité des symptômes cliniques17,19. Cependant, l’application étendue de la surveillance des cytokines sériques « en temps réel » pour prédire le SRC est difficile en raison du coût élevé et de la disponibilité limitée. Pour exploiter les caractéristiques bénéfiques de la thérapie par cellules CAR-T, l’imagerie non invasive des lymphocytes T adoptifs peut être potentiellement utilisée pour prédire l’efficacité, les toxicités et la rechute après perfusion de cellules CAR-T.

Plusieurs chercheurs ont mis au point des stratégies pour utiliser l’imagerie à base de radionucléides avec la tomographie par émission de positons (TEP) ou la tomodensitométrie par émission monophotonique (TEMP), qui fournit une haute résolution et une sensibilité élevées20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 pour le visualisation et surveillance in vivo du trafic de cellules CAR-T. Parmi ces stratégies d’imagerie à base de radionucléides, le symporteur d’iodure de sodium (NIS) a été développé comme une modalité sensible aux cellules d’imagerie et aux virus à l’aide de TEP31,32. L’imagerie des cellules NIS+CAR T avec [18F]TFB-PET est une technologie sensible, efficace et pratique pour évaluer et diagnostiquer l’expansion, le trafic et la toxicité des cellules CAR-T30. Ce protocole décrit 1) le développement de cellules NIS+CAR T par double transduction avec une grande efficacité et 2) une méthodologie d’imagerie des cellules NIS+CAR T avec [18F]TFB-PET scan. Les cellules BCMA-CAR T pour MM sont utilisées comme modèle de preuve de concept pour décrire NIS en tant que rapporteur pour l’imagerie des cellules CAR T. Cependant, ces méthodologies peuvent être appliquées à toute autre thérapie cellulaire CAR-T.

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Protocole

Le protocole suit les lignes directrices du comité d’examen institutionnel de la clinique Mayo, du comité de biosécurité institutionnel et du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la clinique Mayo.

1. Production de cellules NIS+ BCMA-CAR T

REMARQUE : Ce protocole suit les lignes directrices du Comité d’examen institutionnel de la Mayo Clinic (CISR 17-008762) et du Comité de biosécurité institutionnelle (IBC Bios00000006.04).

  1. Production de BCMA-CAR, NIS et de lentivirus codant pour la protéine fluorescente vert luciférase (GFP).
    NOTE: Une construction BCMA-CAR de deuxième génération a été synthétisée de novo (voir la table des matériaux) et clonée en un vecteur lentiviral de troisième génération sous le contrôle d’un promoteur de facteur d’allongement alpha (EF-1α). La construction BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) comprenait une costimulation 4-1BB et un fragment variable à chaîne unique (scFv) dérivé d’un clone d’anticorps BCMA anti-humain C11D5.333,34. Le NIS est sous le contrôle du promoteur EF-1α et se lie au gène de résistance à la puromycine via des peptides auto-clivants (P2A). Le vecteur lentiviral codant pour la luciférase-GFP (voir la Table des matériaux) est utilisé pour transduire les cellules tumorales, qui expriment ensuite la GFP et la luciférase.
    1. Préparer des plasmides vectoriels lentiviraux : pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) et pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      REMARQUE: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro et pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro contiennent le gène de résistance à la puromycine. Par conséquent, les cellules transduites par NIS ou luciférase-GFP peuvent être sélectionnées avec 1 μg/mL ou 2 μg/mL de dichlorhydrate de puromycine, comme décrit précédemment14,35.
    2. Ensemencer 20 × 106 des cellules 293T dans une fiole T175 et incuber pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2. Confirmez que les cellules 293T sont réparties uniformément sur la fiole à une confluence de 70 à 90 % par visualisation directe au microscope.
    3. Préparez un mélange principal de 15 μg du vecteur d’expression (p. ex. CAR, NIS ou ADN linéaire luciférase-GFP), de 7 μg du vecteur enveloppe (VSV-G) et de 18 μg du vecteur d’emballage (gag, pol, rev et tat). Diluer le mélange maître d’ADN dans 4,5 mL du milieu de transfection, puis ajouter 111 μL du réactif pré complexant (mélange A).
    4. Préparer un nouveau tube et diluer 129 μL du réactif de transfection liposomale dans 4,5 mL du milieu de transfection (mélange B).
    5. Mélanger les mélanges A et B et faire glisser le tube pour mélanger le contenu. Incuber pendant 30 min à température ambiante (RT).
    6. Après l’incubation, il suffit d’aspirer le surnageant cellulaire sans détacher les cellules et d’ajouter 16 mL d’un milieu de croissance contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine-glutamine. Ensuite, ajoutez le mélange des mélanges A et B sur les cellules 293T goutte à goutte. Enfin, incuber les cellules transfectées à 37 °C, 5% de CO2 pendant 24 h.
    7. Les jours 1 et 2 après la transfection, récoltez le surnageant de 293T, tournez à 900 × g pendant 10 min et filtrez à travers un filtre en nylon de 0,45 μm. Concentrer le filtrat à 24 et 48 h par ultracentrifugation à 112 700 × g pendant 2 h, et congeler à -80 °C.
  2. Ex-vivo Isolement des lymphocytes T (Figure 1)
    REMARQUE: Effectuer tous les travaux de culture cellulaire dans une armoire à flux laminaire en utilisant une technique aseptique et un équipement de protection individuelle. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont prélevées sur du sang de donneur volontaire sain prélevé lors de l’aphérèse36. Le dépistage des agents pathogènes a été effectué sur les cellules humaines utilisées dans cette étude.
    1. Utilisez la technique de gradient de densité standard pour isoler les PBMC.
      1. Ajouter doucement 15 mL de milieu de gradient de densité (densité de 1,077 g/mL) (contenant de l’alpha-D-glucopyranoside, de l’homopolymère bêta-D-fructofuranosyl et du 3-(acétylamino)-5-(acétylméthylamino)-2,4,6-triodobenzoïque) dans un tube de séparation à gradient de densité de 50 mL sans créer de bulles d’air (voir la Table des matériaux).
      2. Pour éviter le piégeage cellulaire, diluer l’échantillon de sang avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 0,2 g/L de chlorure de potassium, 0,2 g/L de phosphate de potassium monobasique, 8 g/L de chlorure de sodium et 1,15 g/L de phosphate de sodium dibasique) contenant 2 % de FBS à un rapport volumique de 1:1. Transférez doucement le sang dilué sur le milieu de gradient de densité sans rompre l’interface entre les deux. Tourner vers le bas à 1 200 × g pendant 10 min à RT.
        REMARQUE: Un tube de séparation à gradient de densité de 50 mL peut être utilisé pour l’isolement de 4 à 17 mL d’un échantillon de sang. Le tube de séparation à gradient de densité de 50 mL (voir le tableau des matériaux) utilisé dans ce protocole ne nécessite pas le « freinage » pendant la centrifugation. Cependant, lorsque des tubes standard de 50 mL sont utilisés, le frein doit être éteint et nécessite une centrifugation de 30 minutes.
      3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube conique de 50 mL, laver avec PBS + 2% FBS en remplissant jusqu’à 50 mL, puis tourner à 300 × g pendant 8 min à RT.
      4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules granulées dans 50 mL de PBS + 2% FBS. Comptez le nombre de cellules, puis tournez vers le bas à 300 × g pendant 8 min à RT. Répétez l’étape précédente pour un total de 2 lavages.
    2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules granulées à une concentration de 50 × 106 cellules/mL avec PBS + 2% FBS.
    3. Effectuez l’isolation des lymphocytes T à partir de PBMC à l’aide d’un kit de billes magnétiques à sélection négative.
      REMARQUE: Un kit idéal de sélection négative comprend des billes magnétiques attachées à des anticorps contre les antigènes exprimés sur des cellules autres que les cellules T. Un kit couramment utilisé contient des anticorps conjugués à des billes magnétiques contre CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 et CD16 (voir tableau des matériaux).
      1. Transférez les PBMC dans un tube à fond rond en polystyrène de 14 mL. Ensuite, placez les PBMC et le cocktail d’anticorps à sélection négative dans un séparateur de cellules entièrement automatisé et effectuez l’isolement des lymphocytes T conformément au protocole du fabricant.
  3. Stimulation des lymphocytes T et expansion des lymphocytes T (Figure 1)
    1. Pour cultiver les lymphocytes T isolés, préparez un milieu d’expansion des lymphocytes T (MTC) à base de milieu cellulaire hématopoïétique sans sérum complété par 10 % d’albumine sérique humaine et 1 % de pénicilline-streptomycine-glutamine14. Après l’isolement des lymphocytes T, compter les cellules et les cultiver à une concentration de 2 × 106 cellules/mL avec la MTC.
    2. Lavez les billes anti-CD3/CD28 trois fois avec de la MTC avant de les cultiver avec des lymphocytes T.
      1. Mélanger le flacon contenant les perles en tourbillonnant. Ensuite, pipettez le volume requis de perles (3:1 perles:cellule) (par exemple, lors de la stimulation de 1,0 × 106 cellules de lymphocytes T, utilisez 3,0 × 106 perles anti-CD3/CD28) dans un tube de microcentrifugeuse stérile (1,5 mL) et remettez en suspension 1 mL de MTC.
    3. Placez le tube de microcentrifugation avec les perles sur un aimant pendant 1 min et aspirez le surnageant. Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension les billes lavées dans 1 mL de MTC. Répétez les deux étapes précédentes pour un total de 3 lavages.
    4. Remettre en suspension les billes dans 1 mL de MTC et les transférer aux lymphocytes T. Ensuite, diluez les lymphocytes T à une concentration finale de 1,0 × 106 cellules/mL avec la MTC. Transférer la suspension de lymphocytes T/billes dans une plaque de 6 puits traitée par culture tissulaire et la placer dans l’incubateur (37 °C, 5 % de CO2).
  4. Titrage des lentivirus (Figure 2)
    1. Préparer les lymphocytes T pour le test de titrage. Assurez-vous qu’environ 1,0 x 106 cellules sont disponibles pour titrer un type de virus.
    2. Stimuler les lymphocytes T comme décrit à la rubrique 1.3.2.
    3. La plaque 1.0 × 105 cellules de lymphocytes T stimulés dans une plaque de 96 puits (plaque de titre) et incube à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h (figure 2A). Isoler et stimuler les lymphocytes T comme décrit à la rubrique 1.2.
    4. Préparer une plaque de dilution (plaque de 96 puits) en ajoutant 100 μL de MTC dans les puits des colonnes désignées et les puits témoins non transductés (figure 2B).
    5. Décongeler un flacon de particules lentivirales sur de la glace et pipeter doucement de haut en bas pour bien mélanger. Transférer 50 μL du surnageant du virus dans les puits de la colonne 6 de la plaque de 96 puits (dilution 3) (figure 2B). Pipette de haut en bas pour bien mélanger.
    6. Effectuer des dilutions en série (dilution série 2 fois) : transférer 50 μL du puits A6 au puits B6, puis 50 μL du puits B6 au puits C6 ; répétez jusqu’à G6. Ensuite, ajoutez 50 μL du virus dilué à la plaque de titre (Figure 2B).
    7. Incuber la plaque de titre à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 48 h, et déterminer les pourcentages de cellules CAR, NIS ou GFP positives par cytométrie en flux (Figure 2C).
      1. Lavez les puits en faisant tourner la plaque de titre deux fois à 650 × g à 4 °C pendant 3 min.
      2. Colorez les lymphocytes T transductés comme décrit aux étapes 1.5.3 à 1.5.9.
      3. Déterminez les titres en fonction des pourcentages de cellules CAR, NIS ou GFP positives à l’aide de la formule (1) :
        Titres = Pourcentage de lymphocytes T BCMA-CAR+ ou NIS+ × nombre de lymphocytes T à la transduction × la dilution / volume spécifique (1)
  5. Transduction des lentivirus et des NIS+Expansion des cellules BCMA-CAR T
    1. Vingt-quatre à 48 h après la stimulation des lymphocytes T, effectuer une transduction lentivirale sur les lymphocytes T stimulés (les lymphocytes T doivent former des grappes).
      1. Décongeler les lentivirus congelés codant pour le CAR ou le NIS à 4 °C.
      2. Mélangez bien les lymphocytes T stimulés pour briser les grappes et ajoutez simplement le virus fraîchement décongelé à une multiplicité d’infection (MOI) de 5,0 (lors de la transduction de 1,0 × 106 lymphocytes T, utilisez 5,0 × 106 de lentivirons). Incuber les cellules transduites à 37 °C, 5% de CO2.
      3. Aux jours 3, 4 et 5, comptez les lymphocytes T transduis à l’aide d’un hématocytomètre37 ou d’un compteur cellulaire entièrement automatisé38 et ajustez la concentration cellulaire à 1,0 × 106 cellules/mL en ajoutant de la MTC fraîche et préchauffée. Pour les lymphocytes T transductés par NIS porteurs du gène de résistance à la puromycine, traiter les cellules avec 1 μg/mL de dichlorhydrate de puromycine aux jours 3, 4 et 5.
    2. Le jour 6, retirez les billes anti-CD3/CD28 des lymphocytes T transductés (à partir de l’étape 1.3.4) en mélangeant bien pour briser les amas de lymphocytes T et en les plaçant dans un aimant pendant 1 min. Ensuite, il suffit de remettre en culture les lymphocytes T transductés collectés à une concentration de 1,0 × 106 cellules/mL. Après avoir retiré les billes des lymphocytes T, évaluez l’expression de la CAR et du NIS par cytométrie en flux.
      REMARQUE: Comme le fragment variable à chaîne unique du BCMA-CAR est dérivé de la souris, il peut être coloré avec des IgG anti-souris de chèvre (H + L) conjuguées avec Alexa Fluor 647. Le NIS peut être détecté à l’aide d’ETNL anti-humain [peptide synthétique correspondant à aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Cet anticorps reconnaît le C-terminus cytosolique du NIS. Par conséquent, les lymphocytes T doivent être perméabilisés avant l’incubation avec un anticorps anti-NIS humain.
    3. Effectuer la coloration de surface de BCMA-CAR en utilisant des IgG anti-souris de chèvre (H + L).
      1. Prendre une aliquote de la culture (p. ex., 50 000 lymphocytes T) et laver avec un tampon d’écoulement (PBS, 1 % FBS et 1 % d’azoture de sodium). Ensuite, remettez en suspension les cellules avec 50 μL de tampon d’écoulement et colorez les cellules avec 1 μL d’anticorps anti-souris de chèvre pour détecter l’expression de car et 0,3 μL d’eau vivante morte pour exclure les cellules mortes.
      2. Incuber pendant 15 min dans l’obscurité à TA, laver les cellules en ajoutant 150 μL de tampon d’écoulement, et centrifuger les cellules à 650 × g pendant 3 min à 4 °C.
    4. Après coloration CAR de surface, fixer et perméabiliser les cellules en ajoutant 100 μL de milieu de fixation (PBS avec 4,21% de formaldéhyde) et incuber pendant 20 min à 4 °C. Lavez les cellules deux fois avec 100 μL d’un tampon contenant un agent perméabilisant cellulaire tel que la saponine (650 × g pendant 3 min à 4 °C).
    5. Remettre en suspension les cellules fixes/perméabilisées dans 50 μL d’un tampon perméabilisant. Ensuite, ajouter 0,3 ng d’anticorps anti-HUMAIN ETNL NIS dans 50 μL de tampon d’écoulement et incuber pendant 1 h à 4 °C.
    6. Ajouter 150 μL de tampon d’écoulement et centrifuger les cellules à 650 × g pendant 3 min à 4 °C. Incuber les cellules avec 2,5 μL d’anticorps secondaire anti-lapin dans 50 μL de tampon d’écoulement pendant 30 min à 4 °C, laver les cellules en ajoutant 150 μL de tampon d’écoulement et centrifuger à 650 × g pendant 3 min à 4 °C.
    7. Enfin, remettez en suspension dans 200 μL de tampon d’écoulement et effectuez une cytométrie en flux pour déterminer l’efficacité de transduction (Figure 3A,B).
    8. Le jour 8, comptez et faites tourner les lymphocytes T à 300 × g pendant 8 min à 4 °C. Remettre en suspension les lymphocytes T avec un milieu de congélation (90 % FBS + 10 % de diméthylsulfoxyde [DMSO]) à une concentration de 10 × 106/mL, puis transférer 1 mL chacun dans des cryoviales marquées.
    9. Placer les flacons au congélateur à -80 °C pendant 48 h. Après 48 h (et au jour 10), transférer les lymphocytes T dans de l’azote liquide.
      REMARQUE : Voir la figure 1 pour une vue d’ensemble de la production de cellules CAR T NIS+ . La figure 3D représente des exemples d’expansion ex vivo de lymphocytes T provenant de trois donneurs différents.

2. Imagerie des cellules NIS+ BCMA-CAR T avec [ 18F]TFB-PET scan

REMARQUE: Ce protocole suit les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Mayo Clinic (IACUC A00001767-16), de la CISR et du CIB (Bios00000006.04). OPM-2 est une lignée cellulaire BCMA+ MM, qui est souvent utilisée comme lignée cellulaire cible pour les cellules BCMA-CAR T39,40.

  1. Établissez des cellules luciferase+ BCMA+ OPM-2.
    1. Ensemencez 500 000 cellules OPM-2 dans une plaque de 24 puits traitée par culture tissulaire. Décongeler le lentivirus codant pour la luciférase-GFP à 4 °C.
    2. Ajouter le virus fraîchement décongelé à un MOI de 3,0 aux cellules OPM-2 et bien mélanger par pipetage. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5 % de CO2).
    3. Quarante-huit heures après la transduction, ajouter 2 μg/mL de puromycine pour sélectionner les cellules transduites. Quatre jours après la transduction, évaluer les cellules GFP positives (luciférase positive) par cytométrie en flux (Figure 3E).
  2. Établissez des modèles murins de xénogreffe BCMA+ OPM-2 (Figure 4).
    1. Comptez les cellules OPM-2 de la luciférase+ et faites-les tourner deux fois pour éliminer tout le milieu de culture cellulaire. Remettre en suspension les cellules OPM-2 à une concentration de 10 × 106 cellules/mL avec PBS.
    2. Le jour -21, injecter 100 μL (1,0 × 106 cellules) de cellules LUCIFERASE+ OPM-2 dans la queue de souris IL2rγnull (NSG) immunodéprimées âgées de 8 à 12 semaines (NOD-scid) (Figure 4).
    3. Le jour 20 après l’injection de cellules OPM-2 (jour -1 de l’injection de cellules CAR-T), vérifiez la charge tumorale via l’imagerie par bioluminescence (BLI) (Figure 4).
      REMARQUE: Les cellules OPM-2 forment une tumeur à croissance lente, qui prend généralement 2-3 semaines à greffer.
    4. Administrer 10 μL/g de D-luciférine à des souris xénogreffes OPM-2 par injection intrapéritonéale (IP). Après 10 min, effectuer BLI sur les souris sous 2% de gaz isoflurane (Figure 5A). Après avoir confirmé la greffe tumorale, randomisez les souris en fonction de la charge tumorale.
    5. Le jour -1 de l’injection de cellules CAR T, décongeler les cellules NIS+BCMA-CAR T et retirer le milieu de congélation par centrifugation (300 × g, 8 min, 4 °C). Ensuite, les cellules de remise en suspension avec TCM à 2,0 × 106 cellules/mL et incubent pendant la nuit (37 °C, 5 % de CO2).
    6. Le jour 0, compter et centrifuger les cellules NIS+BCMA-CAR T (300 × g, 8 min, 4 °C). Remettre en suspension les cellules NIS+BCMA-CAR T à 50 × 106 cellules/mL avec PBS.
    7. Administrer 100 μL (5,0 × 106 cellules) de cellules NIS+BCMA-CAR T par injection de veine caudale aux souris xénogreffes OPM-2. Les jours 7 et 15, imagez les souris à l’aide d’un PET scan.
  3. Imagerie in vivo des cellules NIS+BCMA-CAR T à l’aide d’un modèle murin de xénogreffe BCMA+OPM-2.
    1. Pesez les souris avant l’imagerie et retirez toutes les étiquettes d’oreille en métal pour éliminer les artefacts liés au métal.
    2. Préparez [18F]TFB comme décrit précédemment41.
      NOTE: [18F]TFB doit être produit le jour de son utilisation. La pureté radiochimique doit être >99% et l’activité molaire >5 GBq/mmol.
    3. Injecter 9,25 MBq [18F]TFB par voie intraveineuse par injection de veine caudale. Prévoyez une période d’absorption d’environ 40 minutes pour que le radiotraceur soit distribué dans le corps et nettoie le sang.
    4. Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane (2 %).
      REMARQUE: L’isoflurane est l’anesthésique inhalé préféré car il a une apparition et une récupération rapides et fiables.
    5. Avant d’anesthésier la souris, nettoyez toutes les surfaces de l’appareil d’anesthésie avec des nettoyants désinfectants.
    6. Placez la souris à l’intérieur de la chambre d’induction. Tournez le cadran du vaporisateur à 2% et attendez que la souris devienne couchée et non réactive dans les 1-2 minutes.
    7. Surveillez la souris pour éviter une anesthésie insuffisante ou une dépression excessive des fonctions respiratoires. En bref, pincez l’orteil pour confirmer l’anesthésie insuffisante.
      REMARQUE: La fréquence respiratoire normale est jusqu’à 180 / min, et le taux de chute acceptable est de 50%.
    8. Appliquez une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement de la cornée et les traumatismes.
    9. Acquérir des images TEP/TDM 45 min après l’injection avec la souris anesthésiée dans un poste de travail d’imagerie micro TEP/TDM (voir la Table des matériaux). Ensuite, acquérez des images PET statiques pendant 15 minutes, suivies d’une acquisition d’images CT pendant 5 minutes avec une rotation à 360 ° et 180 projections à 500 μA, 80 keV et 200 ms d’exposition.
  4. Analyse des données d’imagerie acquises
    1. Analysez les images à l’aide d’un logiciel de traitement d’images PET (Figure 5B et Vidéo supplémentaire S1).
    2. Définissez le volume d’intérêt (VOI).
    3. Calculez la valeur d’absorption normalisée (VUS) à l’aide de la formule (2).
      SUV dans VOI = Concentration d’activité dans VOI (MBq/mL) × poids corporel (g) / dose administrée (MBq) (2)
  5. Confirmation du trafic de cellules NIS+BCMA-CAR T vers les sites tumoraux avec cytométrie en flux
    1. Après l’imagerie [18F]TFB-PET, replacez la souris dans la cage. Après l’arrêt de l’anesthésie, surveillez les animaux jusqu’à ce qu’ils soient capables de se déplacer de manière ciblée et assurez-vous qu’ils ont accès à de la nourriture et de l’eau.
    2. Surveillez les souris jusqu’à la désintégration du [18F]TFB injecté. Une fois que le radio-isotope n’est pas détectable, euthanasier les souris avec du CO2.
    3. Pour euthanasier, placez les souris dans la cage (pas plus de 5 souris par cage).
    4. Exposez les souris au CO2 jusqu’à l’arrêt complet de la respiration en environ 5 à 10 minutes.
      REMARQUE : Cette méthode d’euthanasie doit être conforme aux Lignes directrices de l’AVMA pour l’euthanasie des animaux (édition 2020).
    5. Pour assurer la mort des souris, effectuez une luxation cervicale en saisissant l’arrière de la tête et la base de la queue de l’animal, puis en écartant les mains les unes des autres.
    6. Prélevez la moelle osseuse pour confirmer que les cellules NIS+BCMA-CAR T circulent efficacement vers le site tumoral.
    7. Transférer les fémurs et le tibia récoltés sur une plaque de 6 puits contenant 5 mL de milieu de culture cellulaire. Retirez les muscles et les tendons des fémurs et du tibia et coupez simplement les deux extrémités (au-dessus des articulations) des fémurs et du tibia.
    8. Remplissez une seringue à insuline avec le milieu de culture cellulaire et rincez la moelle osseuse sur la plaque de 6 puits. Pour les fémurs, utilisez des aiguilles de 22 G et des seringues de 5 mL car le diamètre du fémur est plus grand que celui du tibia.
    9. Utilisez l’extrémité plate du piston pour broyer la moelle osseuse. Placez une passoire cellulaire de 70 μm sur un tube conique stérile de 50 mL et filtrez la moelle osseuse broyée. Ensuite, remplissez le tube avec le tampon d’écoulement et centrifugez le tube à 300 × g pendant 8 min à 4 °C.
    10. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la moelle osseuse avec 5 mL de tampon d’écoulement. Transférer 200 μL de moelle osseuse sur une plaque de 96 puits. Centrifuger la plaque à 300 × g pendant 3 min à 4 °C. Décantez le surnageant et remettez en suspension les cellules avec 50 μL de tampon d’écoulement.
    11. Colorer la moelle osseuse avec des anticorps d’écoulement contre 0,25 μg de CD45 de souris, 0,03 μg de CD45 humain, 0,06 μg de CD3 humain, 0,24 μg de BCMA humain et 0,3 μL d’eau vivante/morte. Incuber la plaque pendant 15 min à RT dans l’obscurité.
    12. Centrifuger la plaque à 300 × g pendant 3 min à 4 °C. Ensuite, ajoutez 200 μL de tampon d’écoulement et exécutez sur le cytomètre de flux (Figure 5C).

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Résultats

La figure 1 représente les étapes de génération des cellules NIS+BCMA-CAR T. Le jour 0, isolez les PBMC, puis isolez les lymphocytes T par sélection négative. Ensuite, stimulez les lymphocytes T avec des billes anti-CD3/CD28. Le jour 1, transduire les lymphocytes T avec les lentivirus NIS et BCMA-CAR. Aux jours 3, 4 et 5, comptez les lymphocytes T et nourrissez-les avec un milieu pour ajuster la concentration à 1,0 × 106/mL. Pour les lymphocytes T transduites pa...

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Discussion

Cet article décrit une méthodologie pour incorporer le NIS dans les cellules CAR T et l’imagerie des cellules CAR T perfusées in vivo par [18F]TFB-PET. Comme preuve de concept, les cellules NIS+BCMA-CAR T ont été générées par double transduction. Nous avons récemment signalé que l’incorporation de NIS dans les cellules CAR-T n’altère pas les fonctions et l’efficacité des cellules CAR-T in vivo et permet le trafic et l’expansion des cellules C...

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Déclarations de divulgation

SSK est un inventeur de brevets en immunothérapie CAR sous licence Novartis (par le biais d’un accord entre Mayo Clinic, l’Université de Pennsylvanie et Novartis) et Mettaforge (par l’intermédiaire de Mayo Clinic). RS, MJC et SSK sont des inventeurs de brevets dans le domaine de l’immunothérapie CAR qui sont concédés sous licence à Humanigen. SSK reçoit des fonds de recherche de Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs et Lentigen. Les figures ont été créées avec BioRender.com.

Remerciements

Ce travail a été en partie soutenu par le pipeline K2R de la Mayo Clinic (SSK), le Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) et la Predolin Foundation (RS). Les figures 1, 2 et 4 ont été créées avec BioRender.com.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
22 Gauge needleCovidien8881250206
28 gauge insulin syringeBD329461
96 well plateCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow antibody
Anti-rabbit IgGR&DF0110Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generationIDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652flow cytometer
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok TipsBD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scannerSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PMOD softwarePMODPBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma DerivedInnovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 flaskCorning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

Références

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