Dosage de dépistage de médicaments et de radiothérapie à moyen débit à l’aide d’organoïdes dérivés de patients

Résumé

Nous décrivons des protocoles détaillés pour l’utilisation d’organoïdes dérivés de patients pour les dépistages de sensibilité au traitement à moyen débit. Les thérapies testées comprennent la chimiothérapie, la radiothérapie et la chimio-radiothérapie. Les niveaux d’adénosine triphosphate sont utilisés comme lecture fonctionnelle.

Résumé

Les modèles d’organoïdes dérivés de patients (PDO) permettent l’expansion et le maintien à long terme de cellules épithéliales primaires cultivées en trois dimensions et dans un état quasi natif. Lorsqu’ils sont dérivés de tissus tumoraux réséqués ou biopsiés, les organoïdes récapitulent étroitement la morphologie tumorale in vivo et peuvent être utilisés pour étudier la réponse au traitement in vitro. Les biobanques d’organoïdes tumoraux reflètent la grande variété de tumeurs cliniques et de patients et sont donc très prometteuses pour les applications précliniques et cliniques. Cet article présente une méthode de criblage de médicaments à moyen débit utilisant des organoïdes de carcinome épidermoïde de la tête et du cou et de l’adénocarcinome colorectal. Cette approche peut facilement être adoptée pour être utilisée avec n’importe quel modèle d’organoïde dérivé de tissus, à la fois normal et malade. Des méthodes sont décrites pour l’exposition in vitro d’organoïdes à la chimiothérapie et à la radiothérapie (soit en tant que modalité de traitement unique, soit en combinaison). La survie cellulaire après 5 jours d’exposition au médicament est évaluée en mesurant les niveaux d’adénosine triphosphate (ATP). La sensibilité aux médicaments est mesurée par la concentration inhibitrice demi-maximale (CI₅₀), l’aire sous la courbe (AUC) et le taux de croissance (GR). Ces paramètres peuvent permettre de savoir si une culture d’organoïdes est jugée sensible ou résistante à un traitement particulier.

Introduction

Les modèles d’organoïdes établis à partir de cellules souches adultes et cultivés dans une matrice extracellulaire (MEC) tridimensionnelle (3D) et un cocktail de facteurs de croissance spécifiques (également connus sous le nom d’organoïdes HUB) gagnent du terrain en tant que plateformes de dépistage oncologique préclinique. Les cultures d’organoïdes dérivés de patients (PDO) peuvent être établies à partir de biopsies de tissus normaux et malades en 1 à 2 semaines et peuvent être étendues pendant au moins 1 à 2 mois jusqu’à des périodes illimitées. La cryoconservation permet une utilisation à long terme de cultures bien caractérisées. Contrairement aux modèles de lignées cellulaires bidimensionnelles traditionnels qui sont dérivés par clonage, les modèles PDO récapitulent étroitement le tissu tumoral d’origine, à la fois phénotypiquement et génétiquement, et préservent l’hétérogénéité tumorale. Les criblages de médicaments à débit moyen sur les AOP, testant un large éventail de thérapies, fournissent une plate-forme unique pour la médecine personnalisée.

Des études antérieures ont décrit l’utilisation de modèles d’organoïdes pour le dépistage thérapeutique, en particulier les médicaments et la radiothérapie, dans des modèles établis à partir de différents types de tumeurs et ont montré le potentiel prédictif des organoïdes pour guider la prise de décision clinique 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Cet article décrit les méthodes de dépistage en thérapie oncologique à l’aide d’AOP à débit moyen (Figure 1A). Ce protocole est configuré dans un format de plaque à 384 puits avec semi-automatisation, permettant de tester la thérapie pour jusqu’à huit modèles d’organoïdes, 16 composés et jusqu’à huit plaques à 384 puits. Outre les criblages de médicaments composés, cet article décrit également des méthodes pour mesurer la sensibilité et la sensibilisation à la radiothérapie. De plus, l’utilisation de la robotique à haut débit pour faire passer le dépistage de drogues à l’automatisation complète est discutée. Il est important de noter que les organoïdes de différents tissus peuvent nécessiter des milieux et une manipulation différents.

Ici, un protocole général de test de dépistage de drogues est décrit, qui peut nécessiter une adaptation en fonction de l’organoïde d’intérêt. Des points de départ et des suggestions d’optimisation sont inclus dans la discussion, ainsi que des recommandations générales concernant la configuration expérimentale et la pratique des organoïdes. Des exemples sont donnés en utilisant des organoïdes de carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC), qui ont généralement une morphologie dense, et des organoïdes de cancer colorectal (CRC) qui peuvent avoir une morphologie kystique ou dense. Veuillez noter que les méthodes d’établissement et d’expansion des organoïdes primaires ne sont pas couvertes par ce protocole ; Pour les techniques organoïdes de base, le lecteur doit se référer à d’autres protocoles (par exemple, ¹²). Ce protocole visuel donnera un aperçu du processus de criblage de médicaments à moyen débit à l’aide de modèles organoïdes.

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Protocole

REMARQUE : Avant d’utiliser ce protocole, assurez-vous de respecter les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche sur les êtres humains de l’établissement. La collecte des tissus et des données du patient décrite dans ce protocole a été effectuée conformément aux directives de l’EUREC et aux lois européennes, nationales et locales. Tous les organoïdes ont été dérivés de patients consentants, et le consentement peut être retiré à tout moment.

1. Avant le dépistage

1. Confirmer l’identité des modèles nouvellement établis (par exemple, par histologie et/ou séquençage de l’ADN 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11) afin d’exclure la possibilité d’une prolifération cellulaire normale, et s’assurer que le dépistage du médicament est effectué sur des cultures d’organoïdes tumoraux (voir exemple dans Figure 2D).
2. Concevez la configuration expérimentale de la plaque, en utilisant les recommandations générales données dans la section de discussion (voir l’exemple dans la figure supplémentaire S1).
3. Calculez le nombre requis d’organoïdes et préparez suffisamment d’organoïdes prêts à être divisés au jour 0 (utilisez le tableau 1 comme référence).
   REMARQUE : Selon le RG du type et du modèle d’organoïde, environ 1 à 2 plaques complètes à 6 puits sont nécessaires pour chaque plaque de criblage à 384 puits. À titre indicatif, un puits plein d’une plaque à 6 puits contient ± 20 000 organoïdes kystiques ou jusqu’à 50 000 organoïdes denses/ressemblant à du raisin.
4. Vérifiez si le distributeur de cellules est calibré à l’aide d’un colorant rapporteur et calibrez selon le protocole du fabricant si nécessaire.

2. Préparation du réactif

1. Préparez le support de base : DMEM/F12+++ avancé (aDF+++). Ajouter 5 ml chacun de 1 substitut de L-glutamine (v/v), 1 M d’acide éthanesulfonique M 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine (HEPES) et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine dans une bouteille de 500 ml de DMEM/F12 avancé. Conservez aDF+++ à 4 °C jusqu’à 1 mois.
2. Préparez le milieu d’expansion (c.-à-d. de croissance) approprié pour le type d’organoïde utilisé ^9,10.
3. Préparez le milieu de criblage, qui peut être différent du milieu d’expansion en fonction de la configuration expérimentale. Pour faciliter la récupération après la distribution des organoïdes, ajoutez 5 μM d’inhibiteur de la Rho kinase (ROCK) (Y-27632) au milieu de criblage.
4. Préparez une solution à 100 mg/mL de Dispase II dans aDF+++.
   REMARQUE : Une solution 100x de la dispase est stable à -20 °C pendant 2 mois.

3. Jour 0 : Préparation des organoïdes

REMARQUE : Les volumes indiqués ci-dessous proviennent d’une plaque complète de 6 puits d’organoïdes, équivalente à 1200 μL d’organoïdes/ECM (200 μL d’organoïdes/ECM par puits).

1. Inspecter les organoïdes à l’aide d’un microscope à fond clair pour détecter une éventuelle infection, une densité et un aspect général ; Prenez des images de tous les modèles pour référence avant de passer.
2. Passez les organoïdes et les graines selon les étapes suivantes. Effectuez ces étapes à température ambiante pour réduire les fluctuations de température des organoïdes. Lors de la manipulation de suspensions d’organoïdes, utilisez des pointes à faible rétention ou des pipettes et des plastiques pré-humidifiés pour éviter la perte d’organoïdes.
   1. Lorsque vous utilisez de plus grands volumes de MEC/organoïdes (>1200 μL de MEC), envisagez la digestion de la MEC avec dispase comme suit pour faciliter l’élimination des organoïdes de la MEC.
      REMARQUE : La dispase désintègre l’ECM, mais n’affecte pas les organoïdes.
      1. Facultatif : Ajouter 1 mg/mL de dispase dans chaque puits et incuber les organoïdes dans un incubateur à 37 °C pendant 30 minutes avant de passer comme d’habitude.
         REMARQUE : Comme la dispase n’est pas inactivée par les composants du milieu, lavez-la (à l’aide d’aDF+++) avec au moins 20 fois le volume de la dispase ajouté.
   2. Prélever les organoïdes dans trois tubes de 15 mL (jusqu’à 400 μL d’ECM par tube). Compléter à 12 mL avec aDF+++ et centrifuger pendant 5 min à RT à 85 × g. S’il est correctement granulé, aspirez le surnageant. Si les organoïdes n’ont pas clairement été granulés, centrifuger à une vitesse plus élevée (jusqu’à 450 × g, selon le type et la taille de l’organoïde) pendant 5 minutes supplémentaires. Remettez la pastille en suspension et répétez le lavage.
      REMARQUE : Une couche semblable à du verre au-dessus de la pastille indique la présence d’ECM. Vérifiez qu’aucun organoïde n’est piégé dans l’ECM à l’aide d’un microscope à fond clair (un faible nombre d’organoïdes piégés peut être acceptable) et retirez soigneusement l’ECM restant avec une pipette p1000. Si (trop) d’organoïdes sont présents dans l’ECM, répétez l’étape de dissociation de la dispase, ou lavez la pastille et essorez-la à une vitesse plus élevée (maximum 450 × g).
   3. Pour chaque tube de 15 mL, remettre en suspension la pastille organoïde dans 1 mL d’aDF+++, et dissocier soigneusement les organoïdes jusqu’à ce qu’ils aient atteint la bonne taille. Utiliser la méthode de dissociation utilisée pour le fractionnement régulier, en fonction du type/morphologie (tableau 1).
      1. Dans le cas d’organoïdes kystiques et de type raisin, les perturber mécaniquement, en les cisaillant en petits fragments (<100 μm) en pipetant de haut en bas avec un p1000 avec une pointe p2 sur le dessus, ou avec une pipette Pasteur en verre pré-humidifiée dont l’extrémité a été rétrécie dans une flamme.
         REMARQUE : Confirmez la perturbation des organoïdes à l’aide d’un microscope à fond clair après avoir pipeté vers le haut et vers le bas toutes les 5 fois, en visant à ce que les organoïdes soient inférieurs ou dans la plage de taille de l’écran (Tableau 1).
      2. Pour les organoïdes denses, ajouter 1 mL de solution à 50 % v/v de TrypLE dans aDF+++ pour remettre en suspension la pastille cellulaire, et incuber pendant au moins 2 min à 37 °C. Ensuite, secouez vigoureusement le tube de haut en bas et vérifiez au microscope à fond clair. En utilisant la même approche que ci-dessus, perturbez mécaniquement les organoïdes à l’aide d’une pipette, en vérifiant constamment au microscope tout au long du processus. Pour les organoïdes HNSCC, incuber dans une solution à 100 % du TrypLE pendant 5 min.
         REMARQUE : Selon le type de culture, visez à obtenir de petits groupes de cellules (p. ex., organoïdes du CCR, >20 μm) ou des cellules uniques (p. ex., organoïdes HNSCC). S’assurer que l’incubation protéolytique ne dépasse pas 15 minutes, car cela pourrait affecter la viabilité des organoïdes.
   4. Lavez les organoïdes avec 10 mL d’aDF+++. Faites tourner les organoïdes à 85 × g pendant 5 min ; Aspirez le surnageant s’il est correctement granulé. Sinon, si les organoïdes sont difficiles à granuler, centrifuger jusqu’à 450 × g pendant 5 min.
   5. Organoïdes de semences à haute densité dans un milieu d’expansion de 50 % et une MEC à 50 % (ce qui permet de les retirer facilement de la MEC en section 4). Visez une densité environ deux fois supérieure à celle d’une division régulière, ce qui entraîne souvent une division 1:1 (voir les exemples de la figure 1). Grainez les organoïdes en gouttelettes de 10 μL (un total de 200 μL par puits) d’une plaque préchauffée à 6 puits.
      REMARQUE : Conservez les plaques préchauffées dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit ou dans un four à 60 °C pendant au moins 1 h pour assurer une solidification rapide de l’ECM, empêchant ainsi la propagation de l’ECM et assurant ainsi une bonne formation du dôme de l’hémisphère.
   6. Retournez la plaque et remettez-la dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min pour permettre
   l’ECM à régler. Après 30 à 60 min, ajoutez doucement le fluide d’expansion (température ambiante) dans les puits.

4. Jour 2 (plage : jours 1 à 3) : Distribution d’organoïdes

REMARQUE : Selon l’organoïde GR, cela peut également se produire au jour 1 ou 3. Tout au long du dépistage de drogues, les organoïdes sont maintenus en suspension. À cette fin, ils sont distribués dans une faible concentration d’ECM (5-10 %) à laquelle la croissance des organoïdes est maintenue, mais où aucune solidification de l’ECM ne se produit. Cela permet une distribution automatisée, une interaction organoïde-composé optimale et une lyse cellulaire reproductible, mais limite également la possibilité de changer de milieu.

1. Calculer la concentration et la quantité de suspension organoïde requise pour le dépistage de drogues.
   1. En fonction du distributeur de cellules utilisé, tenez compte du volume mort lors du calcul.
      REMARQUE : Lors de la distribution de 40 μL de suspension organoïde par puits, une plaque 384 nécessite un volume total de 15,4 mL. En moyenne, chaque tube de distribution à cellules Multidrop a un volume mort de ~1 ml, ce qui donne un volume mort de 8 ml lors de l’utilisation de toutes les buses. Cela donne un total de 23,4 mL pour chaque modèle d’organoïde pour une plaque entière de 384 puits. La préparation de 25 mL de suspension organoïde permet donc d’assurer une quantité suffisante d’organoïdes pour la distribution et une analyse de suivi facultative (polymorphisme mononucléotidique, SNP) (voir 4.4.7).
2. Préparation pour la collecte d’organoïdes
   1. Pour préparer le tampon de lavage, ajoutez l’inhibiteur de ROCK (Y-27632) à aDF+++ jusqu’à une concentration finale de 10 μM. (±100 mL est nécessaire pour chaque culture d’organoïdes qui sera dépistée).
   2. Inspecter les organoïdes de tous les puits à l’aide d’un microscope à fond clair pour évaluer la récupération des organoïdes après le passage et pour exclure les infections potentielles. Vérifiez si les organoïdes sont de la bonne taille en prenant une image microscopique et en mesurant les organoïdes à l’aide d’une barre d’échelle numérique (tableau 1).
      REMARQUE : Si les organoïdes ne sont pas de la bonne taille (trop gros ou trop petits), ils seront perdus dans le processus de filtration, et il se peut qu’il n’y ait pas assez de matériel pour entreprendre le dépistage de drogues. Si tel est le cas, il est conseillé de reporter le dépistage de drogues.
   3. Ajouter 1 mg/mL de dispase dans chaque puits et incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 30 à 60 minutes (jusqu’à 120 minutes maximum) pour digérer la MEC. Vérifiez la progression de la dissociation de l’ECM au microscope pour voir si les gouttes de l’ECM flottent. Sinon, placez le contenu du puits sur les gouttelettes de MEC, qui devraient se détacher facilement une fois la digestion terminée.
3. Préparez les organoïdes pour la distribution dans une plaque de 384 puits selon les étapes suivantes. Effectuez ces étapes à température ambiante (y compris la centrifugation) pour réduire les fluctuations de température des organoïdes.
   1. Prélever la suspension organoïde de la plaque de culture à l’aide d’une pipette p1000.
   2. En fonction des étapes de filtrage requises (selon le type d’organoïde, voir tableau 1), suivez l’étape correspondante.
      REMARQUE : Il est essentiel de prémouiller les filtres avec un tampon de lavage pour empêcher les organoïdes d’adhérer au filtre.
      1. Effectuer un filtrage unique en incluant tous les petits fragments et les cellules uniques, par exemple, pour les organoïdes tumoraux HNSCC, filtrer pour les organoïdes < 70 μm. Recueillir les organoïdes récoltés dans un tube de 15 mL et les laver deux fois avec 12 mL de tampon de lavage. Filtrez les organoïdes sur un filtre pré-humidifié de 70 μm dans un tube de 50 mL, lavez le filtre avec 3 x 4 mL d’aDF+++ et transférez-les dans un tube de 15 mL. Si le volume est trop élevé, essorer à 85 × g pendant 5 min et transférer la pastille dans 12 mL d’aDF+++ dans un tube de 15 mL ; Passez à la section 4.3.3.
      2. Effectuez un double filtrage pour éliminer les débris et les gros organoïdes, par exemple, pour les organoïdes tumoraux du CCR, filtrez les organoïdes de >100 μm et <20 μm. Filtrez immédiatement les organoïdes récoltés sur un filtre pré-humidifié de 100/70/40 μm (tableau 1) dans un tube de 50 mL, et lavez le filtre avec 2 x 10 mL de tampon de lavage. Utilisez un filtre pré-humidifié de 20 μm par trois puits à partir d’une plaque de 6 puits d’organoïdes. Filtrez les organoïdes de < 100 μm sur les filtres de 20 μm et lavez le filtre avec 2 x 10 ml de tampon de lavage. Récupérez les organoïdes du filtre en le retournant sur un tube propre de 50 mL et en le lavant avec 3 x 4 mL d’aDF+++. Transférer la suspension organoïde dans un tube de 15 mL ; si le volume est de >15 mL (car un lavage supplémentaire du filtre peut être nécessaire), essorez à 85 × g pendant 5 min et transférez la pastille dans 12 mL d’aDF+++ dans un tube de 15 mL.
         REMARQUE : Les organoïdes qui sont piégés dans le filtre peuvent être récupérés pour une utilisation ultérieure (passage) ; Des organoïdes < 100 μm sont utilisés à l’étape suivante. Les cellules et les débris qui ont traversé le filtre seront jetés, les organoïdes pris dans le filtre (>20 μm, <100 μm) sont utilisés pour le criblage.
   3. Centrifuger à 450 × g pendant 3 min et aspirer soigneusement le surnageant. Remettez la pastille en suspension avec précaution dans 1 mL de milieu de tamisage, complétez avec un autre milieu de 1 à 9 mL (selon la taille de la pastille ; visez à avoir ~75-150 organoïdes/10 μL), et remettez en suspension en pipetant de haut en bas avec une pipette sérologique pré-humidifiée.
      REMARQUE : Il est recommandé d’ajouter 5 μM d’inhibiteur de ROCK au milieu de criblage.
   4. Mélangez soigneusement la suspension organoïde en pipetant de haut en bas avec une pipette sérologique pré-humidifiée 5x, et comptez le nombre d’organoïdes dans 10 μL de la suspension en pipetant une ligne dans une boîte de Pétri et en les comptant au microscope. Pour les organoïdes plus petits (<70 μm), ajoutez 10 μL de la suspension organoïde à une lame à 10 chambres avec une grille d’hémocytomètre, et comptez le nombre d’organoïdes. Calculer le nombre d’organoïdes/mL en suivant les instructions du fabricant.
   5. Préparez la quantité requise de produit de distribution en ajoutant 5 % (v/v) de MEC au produit de dégrillage glacé (p. ex., pour 25 mL de milieu de distribution, ajoutez 1,25 mL de MEC à 23,75 mL de produit de dégrillage glacé). N’ajoutez l’ECM qu’à un support glacé pour éviter que l’ECM ne se solidifie. Lors du criblage de plusieurs modèles d’organoïdes, préparez le milieu de distribution en vrac pour assurer l’uniformité du % d’ECM sur tous les modèles.
   6. Ajouter le nombre requis d’organoïdes (voir le tableau 1 pour les lignes directrices et la discussion pour les notes) dans un nouveau tube de 15 mL et centrifuger à 450 × g pendant 3 min. Aspirez soigneusement sans déranger le granulé, et remettez soigneusement le granulé en suspension dans 100 μL de milieu de criblage à l’aide d’une pipette p200. Assurez-vous que la pastille est homogène et qu’elle est complètement remise en suspension sans amas d’organoïdes. Complétez ensuite la suspension avec la quantité requise de produit de distribution glacé et maintenez la suspension organoïde sur la glace dès lors.
4. Distribuez les organoïdes dans des plaques de 384 puits à l’aide d’un distributeur de cellules (par exemple, Multidrop).
   1. Configurer le distributeur de cellules pour distribuer 40 μL de suspension cellulaire par puits.
      1. Menu principal | Sélectionner le type de plaque | D’accord | 384 Norme | D’ACCORD
      2. Type de cassette Cassette à tube standard (côté droit) | sélectionnez le volume à l’aide des flèches haut et bas (40 μL).
      3. Sélectionnez Plaque complète ou Colonnes, selon la disposition de la plaque.
   2. Lavez le tube avec de l’éthanol à 70 % (EtOH), suivi d’une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) ; utiliser >15 mL par lavage. Laissez un peu d’air entre chaque liquide pour visualiser le début et la fin de chaque lavage. Vérifiez si toutes les têtes de distribution sont « droites » et lavez à nouveau lorsque ce n’est pas le cas.
   3. Dans le menu Paramètres , sélectionnez pré-distribution et réglez sur 60 μL pour pré-distribuer la suspension organoïde après l’amorçage et avant la distribution.
   4. Amorcez le distributeur avec la suspension organoïde tout en maintenant la suspension sur de la glace. Remise en suspension par pipetage continu avec une pipette p1000. Attention à ne pas générer de bulles d’air dans la solution. Une fois amorcés et la plaque en place, distribuez les organoïdes en appuyant sur Start.
      REMARQUE : Cette étape est plus facile à faire avec deux personnes : une personne qui remet en suspension et l’autre qui fait fonctionner le distributeur.
   5. Si nécessaire, pour chaque modèle d’organoïde inclus dans le tamis, distribuez au moins 5 puits supplémentaires dans une plaque de criblage supplémentaire.
      REMARQUE : Cela permettra une lecture T=0 plus tard dans la journée (voir la section 7 et la discussion). Cette distribution peut également être effectuée manuellement si vous le souhaitez.
   6. Remettez immédiatement le couvercle sur la plaque pour éviter la contamination des puits. Confirmez au microscope que tous les puits ont été correctement remplis et si les organoïdes sont répartis uniformément dans toute la plaque.
   7. Si nécessaire, une fois le placage terminé, récupérez la suspension organoïde du tube (cliquez sur Vide) et faites tourner les organoïdes restants. Transférer dans un tube de 1,5 mL et congeler pour une analyse ultérieure du SNP.
      REMARQUE : Si de l’air a pénétré dans le tube pendant la distribution et que certains puits n’ont pas été remplis correctement, remplissez les puits manuellement en ajoutant 40 μL par puits.
   8. Si plusieurs modèles d’organoïdes sont distribués, rincez la tubulure avec du PBS, de l’EtOH et du PBS, et répétez les étapes 4.4.4 à 4.4.8 pour chaque modèle.
   9. Transférez les plaques dans une atmosphère à 5 % de CO₂ dans un incubateur à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être distribuées. Pour éliminer les différences d’échange d’air entre les différentes plaques, évitez d’empiler les plaques dans l’incubateur.
   10. Nettoyez le tube dès que possible avec du PBS puis de l’EtOH. Assurez-vous de sécher complètement le tube en faisant circuler de l’air dans le système.

5. Jour 2 (intervalle : jours 1 à 3) : Distribution de médicaments à l’aide d’un distributeur de médicaments (p. ex ., D300e)

NOTE:. Selon la question de recherche, l’impression de médicaments peut également être effectuée un jour après l’ensemencement.

1. Configurer le distributeur de médicaments
   1. Démarrez le logiciel du distributeur et sélectionnez le format de plaque utilisé pour l’écran en mettant en surbrillance Plaque 1 et en sélectionnant l’outil crayon pour faire apparaître l’éditeur de plaques.
   2. Sélectionnez le type de plaque et réglez le volume supplémentaire de chaque puits (volume de liquide (suspension organoïde) déjà dans la plaque). Pour un format à 384 puits, utilisez 40 μL/puits.
   3. Dans la barre de gauche, utilisez le symbole + pour ajouter chaque solution médicamenteuse qui sera utilisée à l’écran.
   4. Modifiez chaque fluide en sélectionnant l’outil crayon . Modifiez le nom du médicament, la classe de médicament (par exemple, à base de DMSO ou aqueux (par exemple, eau, PBS)) et la concentration de base du médicament.
      REMARQUE : Ne pas dépasser 10 mM de concentration de stock de chaque médicament. Idéalement, la concentration maximale de solvant devrait être de 0,8 % pour le DMSO et de 3 % pour le PBS/0,3 % pour le détergent (par exemple, Tween) (voir la normalisation ci-dessous et la discussion).
   5. Une fois que tous les médicaments ont été ajoutés dans le programme, sélectionnez les puits pour l’ajout des médicaments en mettant en surbrillance un puits sur la disposition des plaques et en le faisant glisser. Faites un clic droit sur les puits sélectionnés et ajoutez la concentration.
      1. Réglez la valeur pour définir la concentration souhaitée de chaque médicament (μM).
      2. Pour le titrage, définissez la concentration maximale et la concentration la plus faible souhaitées de chaque médicament (μM), la distribution (logarithmique ou linéaire), les répétitions par niveau (par exemple, 3) et le modèle de titrage.
      3. Pour le titrage ciblé, définissez la concentration la plus élevée et la plus faible de chaque médicament, la distribution (logarithmique ou linéaire), la concentration cible (μM), la région cible (niveaux), la plage cible (log), les répétitions par niveau (p. ex., 3) et le modèle de titrage.
   6. Normaliser tous les puits de médicament à leur solvant approprié (p. ex., DMSO ou aqueux + Tween-20). Pour les médicaments dissous dans des solutions aqueuses, ajouter Tween-20 (concentration finale de 0,3 % dans le stock de médicament) pour assurer une tension superficielle appropriée de la solution médicamenteuse pour la distribution à l’aide du D300e (voir 5.2.6). Sélectionnez tous les puits, y compris ceux sans médicament (contrôles négatifs), cliquez avec le bouton droit de la souris, sélectionnez Normalisation, puis Normaliser. Sélectionnez le solvant approprié, puis sélectionnez Normaliser au volume de la classe la plus élevée pour normaliser à la concentration la plus élevée de médicament sélectionnée.
      REMARQUE : Des triangles noirs apparaissent maintenant dans le coin inférieur gauche de chaque puits pour confirmer la normalisation. Visez à avoir un minimum de 6 (idéalement >9) puits de contrôle négatifs pour chaque solvant de médicament utilisé.
   7. Sélectionner un minimum de 3 puits (idéalement >6) pour utiliser des réactifs cytotoxiques connus tels que la staurosporine comme témoins positifs (1-5 μM) selon les cultures. Si la concentration cytotoxique du témoin positif est inconnue, optez pour une concentration élevée pour tuer tous les organoïdes dans les puits de contrôle positif.
      REMARQUE : Alternativement, le Navitoclax (20 μM) peut être utilisé pour assurer la mort des organoïdes pendant le dépistage de drogues.
   8. Une fois la disposition des plaques terminée, sélectionnez Exécuter (si la machine est allumée) dans le coin supérieur gauche. Enregistrez le protocole pour continuer.
      REMARQUE : Le programme a maintenant calculé le volume requis de chaque médicament pour l’administration. Comme cela inclut les erreurs de pipetage, il s’agit de la quantité exacte de médicament nécessaire pour l’ensemble du protocole. Facultatif : Si vous sélectionnez Simuler , vous simulerez l’ensemble du protocole (sans ajouter de médicaments) pour observer comment le protocole s’exécutera. Dans les modes Exécution et Simulation , un rapport est généré qui documente l’heure, l’ordre et les volumes de médicaments ajoutés à chaque puits. Cela peut être utile pour s’assurer que le protocole est correct et pour déterminer le volume exact et le nombre de cassettes qui seront nécessaires avant de poursuivre l’expérience.
2. Préparer et imprimer des médicaments
   1. Ajouter 0,3 % (v/v) de Tween-20 à des stocks de médicaments aqueux (par exemple, de l’eau ou du PBS) pour assurer une tension superficielle appropriée de la solution médicamenteuse pour la distribution à l’aide du D300e. S’assurer que la concentration de Tween-20 ne dépasse pas 3 % de PBS/0,3 % de Tween-20 (v/v) et maintenir la concentration finale de Tween-20 en dessous de 0,01 %.
      REMARQUE : N’ajoutez le Tween-20 aux stocks de médicaments que juste avant de l’ajouter à la cassette de l’imprimante de médicaments, car la forte concentration de Tween-20 dans le stock peut inactiver les médicaments (à base de protéines) (par exemple, les médicaments à base d’anticorps). Cette étape n’est pas requise pour les médicaments dissous dans le DMSO ; cependant, assurez-vous que le pourcentage final de DMSO dans chaque puits ne dépasse pas 0,8 à 1 %.
   2. Ayez à portée de main les cassettes D8+ à faible volume et D4+ à haut volume. Cochez la case Utiliser des cassettes à haut volume dans le programme lorsque vous utilisez de grands volumes de liquide de normalisation.
   3. Exécutez le protocole pour commencer à distribuer les médicaments.
      REMARQUE : Le programme exécutera le protocole par étapes et indiquera quand et combien de chaque composé doit être ajouté. Utilisez des embouts filtrants pour manipuler de fortes concentrations de médicaments. Veillez à éliminer les déchets chimiques et les pointes usagées en suivant les directives de biosécurité.
   4. Une fois le protocole terminé, utilisez des joints adhésifs perméables à l’air et aux liquides (p. ex., joints en polyuréthane de qualité médicale ; Table des matériaux) pour couvrir les plaques et les ramener à 37 °C, 5 % de CO₂.
      REMARQUE : L’utilisation de ces joints empêche l’évaporation « à effet de bord » (voir discussion). Si vous n’utilisez pas les sceaux, assurez-vous que les bords extérieurs de la plaque ne sont pas utilisés dans le dépistage de drogues. N’empilez pas les assiettes les unes sur les autres et assurez-vous que les plaques sont maintenues vers l’arrière de l’incubateur, ou utilisez un incubateur qui n’est pas ouvert (fréquemment) pour éviter les fluctuations de température.
   5. Si la radiothérapie est associée à des médicaments imprimés, passez à la section 6. Si ce n’est pas le cas, laissez les plaques dans l’incubateur pendant 5 jours.
      REMARQUE : Selon le type d’organoïde et le type de médicament, certaines expériences peuvent durer plus de 5 jours. Pour les expériences d’une durée de >7 jours, changer soigneusement le milieu et les composés à mi-chemin de la procédure expérimentale (par exemple, en remplaçant 50 % du milieu par un milieu de criblage frais) pour éviter une mort cellulaire importante dans les puits de contrôle négatif.

6. Jour 2 (durée : jours 2 à 4) : Traitement des organoïdes par faisceau de photons

REMARQUE : Les étapes suivantes décrivent l’irradiation des organoïdes. Pour évaluer les effets radiosensibilisants des composés médicamenteux, l’irradiation est effectuée 24 h après l’exposition des organoïdes à la chimiothérapie. Le même protocole est utilisé pour évaluer les effets de l’irradiation seule, dans laquelle les organoïdes sont ensemencés et irradiés 24 h après l’ensemencement. Cela peut nécessiter une certaine optimisation en fonction de l’hypothèse et des cultures d’organoïdes. Les étapes suivantes décrivent le processus utilisé pour irradier des organoïdes à l’aide de faisceaux de photons de 6 MV spécifiquement générés (Tableau des matériaux). Cette machine est optimisée pour les applications cliniques et reflète donc la pratique clinique réelle. Différentes machines peuvent nécessiter une configuration différente et peuvent également nécessiter une optimisation du dosage, car la dose efficace peut différer de celle sélectionnée.

1. Retirez les plaques de l’incubateur à 37 °C et remettez les couvercles sur chaque plaque au-dessus des joints ; Ne retirez pas les joints. Emportez la plaque 0 Gy dans ce processus pour vous assurer que la plaque de contrôle a été soumise à des conditions identiques.
2. Transportez les organoïdes vers l’irradiateur. Installez l’appareil d’irradiation en remplissant une boîte en plastique avec de l’eau tiède du robinet et fixez-le dans le support de plaque pour éviter que la plaque ne flotte.
3. Plongez la plaque dans l’eau de manière à ce que l’eau soit au niveau de la surface supérieure de la plaque. Fixez la plaque en position à l’aide d’un appareil qui ne permet pas à la plaque de flotter (comme indiqué dans la vidéo). Quittez la pièce et irradiez les plaques à des doses croissantes (par exemple, 1, 2, 4, 6, 8 et 10 Gy). N’irradiez qu’une seule plaque à la fois, car un empilement de plaques ne permet pas une dispersion uniforme du rayonnement.
   REMARQUE : S’assurer que les doses d’irradiation appropriées sont choisies pour obtenir une courbe dose-réponse.
4. Séchez soigneusement les plaques après l’irradiation avec des mouchoirs en papier et replacez le couvercle dur. Ramenez les plaques à la salle de culture. Retirez le couvercle rigide et essuyez l’extérieur de chaque plaque avec des mouchoirs EtOH légèrement vaporisés. Ne retirez pas les joints respirants.
5. Placez les plaques à l’arrière de l’incubateur pour éviter les fluctuations de température dues à l’ouverture de la porte ; N’empilez pas les plaques.

7. Jour 2. En option : plaque de mesure CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay (CTG) T=0 (requise pour l’analyse GR)

1. Si vous souhaitez calculer des métriques GR (voir 11.3.5 et discussion), mesurez les valeurs CTG dans la plaque T=0 en suivant les étapes 9.1-10.4.

8. Un jour avant le dépistage de drogues : préparation

1. Calculez le volume total de CTG requis. Pour une plaque de 384 puits, utilisez 40 μL de CTG par puits (ajoutez CTG 1:1 selon les recommandations du fabricant). Tenez compte du volume mort pour la distribution multidrop (1 mL par tube). Décongeler le CTG pendant la nuit à 4 °C, à l’abri de la lumière.
2. Testez si le distributeur doit être étalonné.

9. Jour 7 (intervalle : jours 7 à 14) : Lecture du dépistage de drogues : dosage CTG

1. Laissez le CTG atteindre la température ambiante. Inspectez visuellement tous les puits de la plaque de 384 puits avant la lecture, notez si des infections se sont produites.
2. Imagez les puits pertinents au microscope à fond clair. Inclure des témoins positifs (staurosporine), des témoins négatifs (puits de normalisation) et la concentration la plus élevée de chaque médicament.
3. Lavez et apprêtez la machine multidrop selon les étapes décrites à la section 4.4. Distribuez 40 μL de CTG dans chaque puits, selon la configuration de la plaque. Agitez à l’aide de l’agitateur à plaques du distributeur multidrop (Shake) pendant 5 min et incubez à température ambiante, à l’abri de la lumière pendant 25 min.
   REMARQUE : La réaction CTG est une réaction enzymatique et est donc affectée par la température et le temps d’incubation. Le signal est censé être stable pendant 30 à 60 minutes ; cependant, l’utilisation du même temps d’incubation pour toutes les plaques, en particulier lors du calcul des mesures GR, augmente la précision.

10. Mesures de bioluminescence CTG

1. Allumez le lecteur de plaques de bioluminescence d’une capacité de 384 puits et l’ordinateur. Ici, un lecteur de plaques Spark a été utilisé.
2. Ouvrez le logiciel d’édition de méthode Spark (voir la Table des matériaux). Sélectionnez le format de la plaque : COS384fb-Corning 384 flat black | pas de couvercle | pas de cassette d’humidité ; Sélectionnez les puits qui doivent être mesurés.
3. Dans le menu en bas à gauche, sélectionnez Détection | Luminescence, et traînée sous la plaque. Type : atténuation, deuxième menu : aucun. Réglez le temps d’intégration [ms] : 500.
4. Placez la plaque, sélectionnez-la et exécutez la méthode en cliquant sur Démarrer. Enregistrez la feuille de calcul exportée.

11. Analyse des données

1. Calculez le facteur Z (Z') pour évaluer la qualité de l’écran.
   1. Calculez la moyenne (Av) et les écarts-types (ET) des contrôles négatifs (Ctrl^neg, par exemple, DMSO) et positifs (Ctrl^pos, par exemple, Staurosporine).
   2. Calculez le facteur Z = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos]).
      REMARQUE : Z' exprime la variation à l’intérieur et l’espace ratiométrique entre les témoins positifs et négatifs et est donc une mesure de la plage dynamique du test¹³. Exclure les résultats de dépistage de drogues dont le Z' est inférieur à 0,3 ; il est recommandé d’utiliser des données avec un Z' > 0,5. Le Z' moyen varie généralement entre 0,5 et 0,7 (selon les modèles d’organoïdes utilisés). Pour que le Z soit informatif, tous les organoïdes dans les puits de contrôle positif doivent être morts.
2. Calculez la viabilité relative des organoïdes pour chaque puits en définissant Ctrl^neg sur 100 % et Ctrl^pos sur 0 % de viabilité.
   1. Utilisez cette formule pour calculer la viabilité des organoïdes.
      Viabilité de l’organoïde = 100 % × (valeur du puits expérimental - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. Pour les organoïdes irradiés, calculer la valeur en pourcentage.
         Pourcentage de viabilité organoïde = 100 % × (valeur de puits expérimental de x GY) / (valeur de puits^{de négation} Av Ctrl de 0 GY)
   2. Visualisez les données dans un logiciel d’analyse de données en copiant les données de viabilité dans une table xy, en sélectionnant le nombre approprié de valeurs répétées par concentration.
   3. Pour obtenir des concentrations logarithmiques de médicament, transformez les concentrations de médicament et copiez ces valeurs dans la première colonne du tableau.
   4. Pour formater le graphique, sélectionnez le type de graphique (XY), sélectionnez l’erreur standard de la moyenne (SEM) et définissez l’origine en bas à gauche.
3. Déterminez les métriques relatives IC₅₀, aire sous la courbe (AUC) et GR.
   1. Pour la régression non linéaire, dans l’onglet Analyser , sélectionnez Ajuster une courbe avec la régression non linéaire. Choisissez l’option log (inhibiteur) vs. réponse normalisée - pente variable pour créer une courbe de destruction.
   2. Cliquez sur l’onglet Résultats pour afficher la CI₅₀ relative pour chaque médicament.
      REMARQUE : Il s’agit de la concentration du médicament qui donne une réponse à mi-chemin entre le bas et le haut de la courbe. Le bas et le haut sont des plateaux dans les unités de l’axe des y.
   3. Pour l’aire sous la courbe (AUC), sous l’onglet Analyser , sélectionnez l’aire sous la courbe, utilisez les paramètres prédéfinis, puis sélectionnez OK.
   4. Cliquez sur l’onglet Résultats pour afficher l’ASC (surface totale) de chaque médicament.
      REMARQUE : L’ASC est une mesure intégrée d’un effet mesurable, qui est utilisée comme mesure cumulative de l’effet d’un médicament. Avec certaines molécules, comme les anticorps, la courbe dose-réponse n’est pas de forme sigmoïdale et les valeurs de CI₅₀ sont difficiles à interpréter. Dans une telle situation, les valeurs de l’AUC peuvent fournir plus d’informations en tant que mesure pour comparer les différences entre les lignées d’organoïdes.
   5. Par ailleurs, si les mesures CTG sont prises au jour 2 (étapes facultatives 4.4.5 et section 7), calculez les mesures RG. Analysez les paramètres de la RG à l’aide d’un calculateur de RG^{en ligne 14}, en tenant compte des différences de taux de prolifération entre les modèles d’organoïdes tout au long d’un dépistage de drogues afin d’assurer des mesures plus reproductibles et plus sensibles.

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Résultats

Le but de cette expérience était d’examiner la sensibilité des organoïdes HNSCC à la chimiothérapie et à la radiothérapie en tant qu’agents uniques. Nous avons également testé la reproductibilité des résultats en exécutant l’expérience plusieurs fois à une semaine d’intervalle, ce qui a donné lieu à plusieurs réplicats biologiques (expériences 1-3) (Figure 2). Conformément au protocole, le jour 0, les AOP HNSCC ont été récolté...

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Discussion

Cet article et cette vidéo décrivent comment effectuer un dépistage de drogues à moyen débit à l’aide d’AOP. Ce protocole peut, avec optimisation, être adopté pour cribler des organoïdes dérivés de différents types de tissus que ceux décrits ici. Il est important de déterminer le délai de passage idéal avant l’écran, car il varie d’une culture d’organoïdes à l’autre et dépend du type de tissu. La densité et la taille des organoïdes ensemencés par puits ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel