Minimiser les saignements de veines portes post-perfusion pendant la transplantation intrahépatique d’îlots chez la souris

Résumé

Nous présentons ici des procédures chirurgicales raffinées sur la réalisation réussie d’une transplantation intraportaire d’îlots, une procédure chirurgicale cliniquement pertinente mais techniquement difficile, chez la souris.

Résumé

Bien que le foie soit actuellement accepté comme site de transplantation primaire pour les îlots humains en milieu clinique, les îlots sont transplantés sous la capsule rénale dans la plupart des études précliniques de transplantation d’îlots de rongeurs. Ce modèle est couramment utilisé parce que la transplantation d’îlots intrahépatiques murins est techniquement difficile et qu’un pourcentage élevé de souris pourraient mourir de complications chirurgicales, en particulier de saignements du site d’injection après la transplantation. Dans cette étude, deux procédures qui peuvent minimiser l’incidence des saignements de la veine porte post-perfusion sont démontrées. La première méthode applique une éponge de gélatine hémostatique résorbable au site d’injection, et la deuxième méthode consiste à pénétrer l’aiguille d’injection d’îlots à travers le tissu adipeux d’abord, puis dans la veine porte en utilisant le tissu adipeux comme barrière physique pour arrêter le saignement. Les deux méthodes pourraient prévenir efficacement la mort de souris induite par les saignements. La section hépatique entière montrant la distribution des îlots et les signes de thrombose des îlots après la transplantation, une caractéristique typique de la transplantation intrahépatique des îlots, a été présentée. Ces protocoles améliorés affinent les procédures de transplantation intrahépatique d’îlots et peuvent aider les laboratoires à mettre en place la procédure pour étudier la survie et la fonction des îlots dans des contextes précliniques.

Introduction

La transplantation intraportaire d’îlots (IIT) via la veine porte est la méthode la plus couramment utilisée pour la transplantation d’îlots humains en milieu clinique. Le modèle IIT de souris offre une excellente occasion d’étudier la transplantation d’îlots et de tester des approches interventionnelles prometteuses qui peuvent améliorer l’efficacité de la transplantation ^d’îlots1. L’IIT a été décrit pour la première fois dans les années 1970 et utilisé par plusieurs groupes1,2,3,4,5. Il a regagné en popularité après la percée dans la transplantation d’îlots humains en 20006,7. Cependant, la plupart des études de transplantation d’îlots ont utilisé la capsule rénale comme site privilégié pour la transplantation expérimentale d’îlots en raison de son succès facile. Au contraire, l’IIT est plus difficile techniquement et moins fréquemment utilisé pour les études de transplantation d’îlots8,9. Contrairement à l’IIT, cependant, les îlots transplantés sous la capsule rénale ne souffrent pas de la réaction inflammatoire immédiate à médiation sanguine caractérisée par une thrombose, une inflammation et une ischémie du tissu hépatique, et ont donc une meilleure fonction que les îlots transplantés dans le foie. Le modèle de capsule rénale peut donc ne pas imiter complètement les contraintes rencontrées par les îlots lors de la transplantation d’îlots humains10,11,12.

L’une des principales complications de l’IIT chez la souris est le saignement du site d’injection après la transplantation, ce qui pourrait causer 10 à 30% de la mortalité chez différentes souches ^{de souris12}. Dans cet article, deux approches affinées ont été développées pour arrêter les saignements plus rapidement et en toute sécurité et pour réduire la mortalité des souris après une IIT. La démonstration visuelle de ces détails raffinés aidera les chercheurs à identifier les étapes clés de cette procédure techniquement difficile. En outre, l’emplacement des greffes d’îlots dans le foie du receveur a été déterminé par un examen histologique du tissu hépatique coloré à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) (section entière) portant des îlots transplantés.

Protocole

Toutes les procédures ont été menées avec l’approbation des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud et du Ralph H Johnson Medical Center à Charleston.

1. Induction du diabète à l’aide de la streptozotocine (STZ)

1. Préparation des souris receveuses:
   1. Pesez toutes les souris individuellement.
   2. Vérifiez la glycémie à partir d’un échantillon de sang de la veine caudale à l’aide d’un glucomètre.
2. Détermination de la dose de STZ pour trois scénarios différents :
   1. Pour les souris atteintes de stéatose hépatique, injecter une dose de STZ [40 mg/kg/jour, injection intrapéritonéale (i.p.)] pendant 5 jours consécutifs.
   2. Pour les souris NOD-SCID, injecter 125 mg / kg de STZ, injection unique, i.p. après jeûne de nuit.
   3. Pour les souris C57BL/6, injecter 225 mg/kg de STZ, injection unique, i.p.
3. Calculs pour STZ (13,5 mg/mL) :
   REMARQUE: Ce calcul est pour cinq souris C57BL / 6 avec un poids corporel de 30 g:
   1. Poids corporel total : 5 souris x 30 g/souris = 150g
   2. STZ nécessaire : 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg
4. Préparation STZ:
   1. Peser le STZ après la dose précalculée.
   2. Transférer la poudre STZ pesée dans un bécher de 10 ml sur de la glace.
   3. Ajouter 3 mL de solution de citrate de sodium dans le bécher pour dissoudre le STZ.
   4. Bien mélanger, filtrer stériliser à travers un pore de 0,22 μm et utiliser la solution STZ dans les 10 minutes suivant la préparation.
5. Injection de STZ :
   1. Chargez la quantité souhaitée de solution STZ (suffisante pour une souris) dans une seringue de 1 mL.
   2. Effectuer une injection intrapéritonéale dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen de la souris.
   3. Observez les souris pendant 5 minutes après l’injection et vérifiez tout signe d’inconfort pendant cette période avant de les remettre dans les cages.
   4. Surveiller le taux de glucose sanguin à partir d’un échantillon de sang de la veine caudale à l’aide d’un glucomètre tous les jours après l’injection de STZ.
      REMARQUE: Dans cette expérience, les souris sont considérées comme diabétiques lorsque la glycémie non à jeun est > 350 mg / dL pendant deux jours consécutifs.

2. Préparation des îlots

REMARQUE : Les îlots humains ont été cultivés dans des milieux CMRL-1066 complétés par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) à une densité de 10 000 équivalents îlots (QEI) par boîte de culture cellulaire de 100 ^mm9. Des îlots de souris ont été cultivés en DMEM avec 10 % de FBS et 1 % de P/S avec la même ^densité13. Des souris mâles NOD-SCID et C57BL/7 âgées de 6 à 10 semaines ont été obtenues à partir de sources commerciales.

1. Détacher les îlots cultivés de la boîte de culture cellulaire en les grattant doucement.
2. Choisissez à la main le nombre souhaité d’îlots (p. ex., 300 à 350 îlots) à l’aide d’une seringue de 1 cc et placez-les dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL sur de la glace.
3. Faites tourner le tube pendant 10 secondes à l’aide de la microcentrifugeuse.
4. Retirez le surnageant, en laissant un peu de liquide pour éviter de perdre la pastille.
5. Remettre en suspension la pastille dans 200 μL de HBSS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA).
6. Aspirer les îlots remis en suspension dans une seringue à insuline de 0,5 mL.
7. Placez la seringue en position verticale. Laissez les îlots couler pendant 1 min.
8. Poussez la seringue pour enlever toutes les bulles, laissant environ 100-150 μL d’îlots contenant du liquide.
9. Placez la tête de la seringue vers le bas et tapotez doucement le côté de la seringue pour laisser les îlots se répartir également dans tout le liquide. Les îlots sont maintenant prêts à être injectés.

3. Transplantation d’îlots

1. Induire et maintenir la souris sous anesthésie générale avec 2% d’isoflurane. Vérifiez l’absence de réflexes de pédale pour assurer une bonne anesthésie de l’animal.
2. Rasez et retirez la fourrure dans la région de l’abdomen de la souris.
3. Administrer une dose préopératoire unique de buprénorphine (0,1 mg/kg d’AP).
4. Désinfectez la zone chirurgicale avec trois lingettes alternées de 2% d’iode et 75% d’alcool.
5. Effectuez une laparotomie avec des micro-ciseaux pour générer une incision de 1 à 1,5 cm.
6. Ouvrez la cavité péritonéale avec un rétracteur. Suivez avec la méthode A ou la méthode B comme détaillé ci-dessous.

4. Méthode A: (arrêter le saignement avec de la mousse de gel, Figure 1A)14,15,16

1. Préparation de la souris
   1. Placez une gaze stérile autour de l’incision.
   2. Retirez doucement l’intestin à l’aide d’une pince et maintenez-le sur la gaze.
   3. Identifiez la veine porte par son emplacement et exposez-la bien.
   4. Couvrez l’intestin avec une gaze chaude saline humide pendant toute la chirurgie.
2. Insérez l’aiguille de la seringue à insuline préchargée par îlot dans la veine porte près du duodénum (Figure 1B). Pour ce faire, tenez l’aiguille avec le trou (biseau) vers le bas et positionnez l’angle de la surface d’ouverture parallèlement à la paroi de la veine porte avant de pénétrer à travers le mur.
   1. Tirez sur le piston pour prélever du sang (20-50 μL) dans la seringue pour mélanger les îlots en premier.
   2. Infuser lentement les îlots dans la veine porte tout en tirant et en poussant le plongeon à plusieurs reprises.
   3. Placez un morceau de mousse de gel (environ 0,5 cm x 0,5 cm) pour couvrir le site d’injection.
   4. Appuyez sur la mousse de gel avec une pointe en coton tout en retirant l’aiguille de la veine porte.
   5. Continuez à appuyer sur le gel pendant environ 2 minutes pour confirmer qu’il n’y a pas de saignement actif.
   6. Retournez la bascule en coton sur et éloignez-vous de la mousse de gel pour vous assurer que la mousse de gel recouvre bien la veine porte.

5. Méthode B: (arrêter le saignement avec un coussinet adipeux, Figure 1C)¹⁷

1. Exposez soigneusement la veine porte.
   1. Utilisez deux embouts en coton pour maintenir la veine porte exposée des côtés gauche et droit.
   2. Identifiez le coussinet de tissu adipeux entre le duodénum et la veine porte.
   3. Pénètrez à travers le coussinet adipeux avant d’insérer l’aiguille dans la veine porte (Figure 1D).
   4. Infuser les îlots, en suivant la procédure similaire décrite ci-dessus dans les parties 4.2.1 et 4.2.2 de la méthode A.
   5. Retirez l’aiguille tout en appuyant sur la graisse avec une pointe en coton.
   6. Continuez à appuyer sur le tampon adipeux pendant 1 min après avoir retiré l’aiguille.
2. Après avoir confirmé qu’il n’y a pas de saignement de la veine porte, ramenez doucement l’intestin dans la cavité péritonéale dans sa position d’origine.
3. Laisser 0,5 mL de solution saline chaude (36-37 °C) dans la cavité abdominale avant la fermeture.
   REMARQUE: La solution saline chaude facilite le mouvement et la récupération de l’intestin après la chirurgie et prévient la nécrose intestinale.
4. Fermez la couche musculaire avec une suture 5-0.
5. Fermez la couche de peau avec une suture 4-0.
6. Placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement remise de l’anesthésie.
7. Continuer à fournir un analgésique (p. ex., buprénorphine 0,1 mg/kg p.i.) toutes les 12 h et de la chaleur supplémentaire pendant 48 h après la chirurgie.
   REMARQUE: La procédure de transplantation d’îlots prend environ 15-20 minutes à compléter.

6. Coloration H &E et photographie de la section entière du foie

1. Perfusion hépatique
   1. Mettez la souris sous anesthésie comme décrit ci-dessus dans la partie 3.1.
   2. Exposez soigneusement la veine porte et coupez la veine cave inférieure.
   3. Perfuser manuellement le foie à l’aide de 20 mL de paraformaldéhyde à 10% via la veine porte pendant environ 5 minutes, à l’aide d’une seringue de 20 mL avec aiguille ^25G18.
      REMARQUE: La perfusion hépatique peut éliminer le sang du tissu hépatique et améliorer la fixation du foie sans perturber les greffes d’îlots.
   4. Disséquez le foie entier perfusé d’autres organes.
   5. Fixer le tissu hépatique perfusé dans 10% de paraformaldéhyde pendant 24 h.
   6. Incorporer le tissu dans la paraffine.
   7. Coupez des sections de tissu de 5 μm d’épaisseur chacune et placez-les sur une lame de verre pour la coloration.
   8. Effectuer une coloration H&E, insuline, fibrine et neutrophile polymorphonucléaire (PMN) à l’aide de méthodes ^{standard15,16}.
   9. Scannez toute la section du foie au microscope.

Résultats

Nous avons effectué des transplantations d’îlots syngéniques et xénogéniques via la veine porte. La fonction de greffe d’îlot a été observée de manière dose-dépendante dans les deux modèles de transplantation d’îlots. Dans le modèle de transplantation d’îlots syngéniques utilisant des souris C57BL/6, la transplantation de 250 îlots a conduit à une normoglycémie transitoire avant que les souris ne reviennent à l’hyperglycémie. Les souris recevant 500 îlots ont atteint et maintenu la normogl...

Discussion

Dans cette étude, deux procédures améliorées qui peuvent prévenir les saignements et réduire la mortalité des souris pendant l’IIT de la souris ont été démontrées. Cette étude permet aux chercheurs de visualiser le modèle de transplantation d’îlots qui est unique dans l’étude de la réponse inflammatoire médiée par le sang instantané après la transplantation. Le modèle IIT est un modèle distinctif pour l’étude de la survie des cellules des îlots et des lésions ischémiques hépatiques en r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
1 mL Syringe with needle	AHS	AH01T
20 mL Syringe	BD	301031
25G x 5/8" hypodermic needles	BD	305122
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35011CV
FreeStyle  Glucose meter	Abbott	Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips	Abbott	Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle	BD	879588
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)	HyClone	SV30010
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Streptozocin (STZ)	Sigma	S0130
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416