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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’imagerie in vivo à haute résolution du pancréas a été facilitée par la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique.

Résumé

L’imagerie directe in vivo à résolution cellulaire du pancréas dans un modèle vivant de petit animal a été techniquement difficile. Une étude récente d’imagerie intravitale, avec une fenêtre d’imagerie abdominale, a permis de visualiser la dynamique cellulaire dans les organes abdominaux in vivo. Cependant, en raison de l’architecture molle en forme de feuille du pancréas de la souris qui peut être facilement influencée par le mouvement physiologique (par exemple, le péristaltisme et la respiration), il était difficile d’effectuer une imagerie longitudinale in vivo stabilisée sur plusieurs semaines au niveau cellulaire pour identifier, suivre et quantifier les îlots ou les cellules cancéreuses dans le pancréas de la souris. Nous décrivons ici une méthode d’implantation d’une nouvelle base de support, une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée, qui peut séparer spatialement le pancréas de l’intestin pour l’imagerie intravitale longitudinale time-lapse de la microstructure du pancréas. L’imagerie longitudinale in vivo avec la fenêtre d’imagerie permet une visualisation stable, permettant le suivi des îlots sur une période de 3 semaines et l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution de la microstructure, comme en témoigne ici un modèle orthotopique de cancer du pancréas. Avec notre méthode, d’autres études d’imagerie intravitale peuvent élucider la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas au niveau cellulaire.

Introduction

Le pancréas est un organe abdominal avec une fonction exocrine dans le tube digestif et une fonction endocrinienne de sécrétion d’hormones dans la circulation sanguine. L’imagerie cellulaire à haute résolution du pancréas pourrait révéler la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas, y compris la pancréatite, le cancer du pancréas et le diabète sucré1. Les outils d’imagerie diagnostique conventionnels tels que la tomodensitométrie, l’imagerie à résolution magnétique et l’échographie sont largement disponibles dans le domaine clinique1,2. Cependant, ces modalités d’imagerie se limitent à visualiser uniquement les changements structurels ou anatomiques, tandis que les altérations au niveau cellulaire ou moléculaire ne peuvent pas être déterminées. Étant donné que les changements moléculaires dans le diabète sucré ou le cancer du pancréas chez l’homme peuvent commencer plus de 10 ans avant le diagnostic3,4, la détection des maladies du pancréas à partir de leur transition moléculaire pendant la période de latence a le potentiel de fournir un diagnostic précoce et une intervention rapide. Ainsi, l’imagerie qui surmontera les limites de la résolution et fournira des informations précieuses sur la fonction attirera remarquablement l’attention en fournissant un diagnostic précoce du cancer du pancréas ou une identification avancée de l’altération des îlots au cours de la progression du diabète sucré5.

En particulier avec les îlots, l’imagerie nucléaire, l’imagerie par bioluminescence et la tomographie par cohérence optique ont été suggérées comme techniques d’imagerie non invasive des îlots6. Cependant, la résolution de ces méthodes est considérablement faible, avec des valeurs typiques allant de plusieurs dizaines à des centaines de micromètres, offrant une capacité limitée à détecter les changements au niveau cellulaire dans les îlots. D’autre part, des études antérieures à haute résolution sur les îlots ont été réalisées dans des conditions ex vivo7,8 (par exemple, tranchage ou digestion du pancréas), non physiologiques9 (par exemple, extériorisation du pancréas) et hétérotopiques10,11,12 (par exemple, implantation sous la capsule rénale, à l’intérieur du foie et dans la chambre antérieure de l’œil), ce qui limite leur interprétation et leurs implications cliniques. Si un modèle in vivo,physiologique et orthotopique d’imagerie à haute résolution peut être établi, ce sera une plate-forme critique pour l’étude des îlots pancréatiques.

L’imagerie intravitale, qui révèle la physiopathologie à un niveau de résolution microscopique chez un animal vivant, a récemment fait l’objet d’une grande attention13. Parmi les méthodes d’imagerie in vivo, le développement d’une fenêtre d’imagerie abdominale14,qui implante une fenêtre dans l’abdomen d’une souris, a permis de découvrir de nouvelles découvertes (c’est-à-dire un stade pré-micrométastase de la métastase hépatique précoce15 et un mécanisme de maintien des cellules souches dans l’épithélium intestinal16). Bien que la fenêtre d’imagerie abdominale fournisse des résultats précieux, les applications de cette fenêtre pour le pancréas et la recherche d’imagerie intravitale qui en résulte basée sur les maladies impliquant le pancréas n’ont pas été étudiées de manière approfondie.

Contrairement aux caractéristiques bien définies des organes solides du pancréas humain, le pancréas d’une souris est une structure semblable à des tissus mous distribués de manière diffuse17. Par conséquent, il est sans cesse affecté par les mouvements physiologiques, y compris le péristaltisme et la respiration. Une étude antérieure sur l’application d’une fenêtre d’imagerie abdominale pour le pancréas a démontré que l’errance se produisait en raison d’artefacts de mouvement induits par les selles18. Un flou sévère a été observé dans l’image moyenne résultante, ce qui a entravé la visualisation et l’identification des structures à l’échelle microscopique.

Ici, nous décrivons l’utilisation d’une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de soutien combinée à la microscopie intravitale19,20 pour étudier les événements au niveau cellulaire longitudinal dans les maladies impliquant le pancréas. En plus d’une description détaillée de la méthodologie de l’étude précédente18, l’application étendue de la fenêtre d’imagerie pancréatique pour diverses maladies impliquant le pancréas sera abordée dans cet article. Dans ce protocole, un système de microscopie confocale à balayage laser à débit vidéo sur mesure a été utilisé comme système de microscopie intravitale. Quatre modules laser (longueurs d’onde à 405, 488, 561 et 640 nm) ont été utilisés comme source d’excitation, et quatre canaux de signaux d’émission ont été détectés par des tubes photomultiplicateurs (PMT) à travers des filtres passe-bande (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Le balayage laser se composait d’un miroir polygonal rotatif (axe X) et d’un miroir à balayage galvanométrique (axe Y) qui permettait le balayage à débit vidéo (30 images par seconde). Des informations détaillées sur la microscopie intravitale ont été décrites dans les études précédentes10,18,19,20,21,22,23.

Dans notre étude précédente sur les îlots18,nous avons imagé avec succès et de manière stable les îlots chez des souris vivantes à l’aide d’un modèle murin transgénique (MIP-GFP)24 dans lequel les îlots ont été marqués avec GFP. La méthode a permis une visualisation haute résolution des changements dans les îlots sur une période de 1 semaine. Il a également facilité l’imagerie des mêmes îlots jusqu’à 3 semaines, ce qui suggère la faisabilité d’études à long terme des îlots pancréatiques pour le suivi fonctionnel ou la surveillance pendant la pathogenèse du diabète sucré18. De plus, nous avons développé un modèle de cancer du pancréas orthotopique dans lequel des cellules fluorescentes cancéreuses du pancréas (PANC-1 NucLight Red)25 ont été directement implantées dans le pancréas de la souris. Avec l’application de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique, ce modèle pourrait être utilisé comme plate-forme pour étudier la physiopathologie cellulaire et moléculaire dans le microenvironnement tumoral du cancer du pancréas et pour la surveillance thérapeutique de nouveaux candidats médicaments.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans le présent document ont été menées conformément à la 8e édition du Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (2011)26 et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut avancé coréen des sciences et de la technologie (KAIST) et de l’Hôpital Bundang de l’Université nationale de Séoul (SNUBH).

1. Préparation de la fenêtre et d’autres matériaux

  1. Conception personnalisée de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique pour isoler le pancréas de l’intestin dans la cavité abdominale18 (Figure 1A, B). Un plan détaillé de la fenêtre est décrit dans une figure supplémentaire d’une étude précédente18.
  2. Utilisez des souris C57BL/6N, des mâles âgés de 8 à 12 semaines, pour l’imagerie pancréatique intravitale. Injecter un anticorps anti-CD31 conjugué avec un fluorophore Alexa 647, 2 h avant l’imagerie, aux fins du marquage des vaisseaux18.
  3. Pour l’étude des îlots, préparez un modèle murin transgénique dans lequel les îlots sont marqués avec une protéine rapporteure fluorescente. Ici, nous avons utilisé MIP-GFP, où la protéine fluorescente verte a été exprimée sous le contrôle du promoteur du gène de l’insuline 1 de la souris, qui est active dans les cellules bêta de tous les îlots de la souris24.
  4. Pour l’étude sur le cancer du pancréas, préparez des cellules cancéreuses transgéniques marquées avec une protéine rapporteur fluorescente et des souris nues BALB / C. Dans cette étude, les globules rouges PANC-1 NucLight ont été utilisés. Les cellules cancéreuses PANC-125 ont été étiquetées avec la sonde fluorescente NucLight Red.
  5. Stérilisez tous les outils chirurgicaux, couvrez le verre (avec du PEG ou non) et imagez les fenêtres à l’aide d’un autoclave.
  6. Appliquez un revêtement PEG sur le verre de couverture pour prévenir la réponse inflammatoire et augmenter la biocompatibilité, ce qui convient à l’imagerie à long terme.

2. Chirurgie

  1. Préparez une plate-forme chirurgicale stérile et stérilisez les surfaces avec 70% d’éthanol.
    REMARQUE: Pour les séances d’imagerie longitudinale, la technique aseptique est essentielle.
  2. Anesthésier les souris avec un mélange de tiletamine/zolazépam (30 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
    REMARQUE: L’utilisation de tiletamine / zolazépam est recommandée au lieu de la kétamine en raison de son effet indésirable de l’hyperglycémie. L’anesthésie optimale doit être choisie pour les besoins de l’expérience9,27.
  3. Surveillez la température corporelle à l’aide d’une sonde rectale avec un coussin chauffant à commande homéotherme.
  4. Rasez le flanc gauche de la souris et appliquez trois cycles de gommage alterné à base d’alcool et d’iode.
    REMARQUE: Si une crème dépilatoire est utilisée, ne laissez pas plus de 1 minute pour éviter les brûlures chimiques.
  5. Faites une incision de 1,5 cm sur le flanc gauche de la souris et disséquez la peau et les muscles.
  6. Effectuez une suture de cordon de bourse avec une suture noire ou en nylon 4-0 dans la marge d’incision.
  7. Utilisez un micro-rétracteur sur l’incision et exposez doucement la rate.
  8. Remettez soigneusement la rate en commun avec une pince annulaire et identifiez le pancréas.
  9. Placez la fenêtre sur le flanc de la souris et passez la rate et le pancréas à travers l’espace ouvert de la fenêtre. La manipulation du pancréas doit être très gentille car elle peut provoquer des saignements ou une pancréatite
  10. Placez doucement le pancréas sur la plaque de la fenêtre d’imagerie; la rate sera placée sur l’espace ouvert de la fenêtre.
  11. Pour l’étude des cellules cancéreuses, injectez PANC-1 NucLight Red (1,0 x 106 cellules) directement dans le pancréas.
    REMARQUE: Pour l’imagerie des xénogreffes orthotopiques du cancer du pancréas humain, l’implantation directe de cellules cancéreuses telles que PANC-1 ou d’autres cellules cancéreuses du pancréas humain pourrait être facilitée28. Pour visualiser avec la microscopie à fluorescence intravitale, les cellules PANC-1 ont été transduies avec une protéine fluorescente rouge à l’aide du réactif lentiviral NucLight Red qui marque le noyau29. Bien que le volume maximal d’injection soit incertain, diminuez le volume autant que possible pour éviter l’effet de pression dans le pancréas.
  12. Appliquez des gouttes de colle cyanoacrylate de N-butyle sur la marge de la fenêtre d’imagerie.
    1. Pour minimiser la quantité de colle appliquée, utilisez une aiguille de cathéter de 31 G pour l’application. Si la quantité de goutte est importante, le tissu adhérera involontairement à la fenêtre ou au verre de couverture.
  13. Appliquez doucement un verre de couverture rond de 12 mm sur la marge de la fenêtre d’imagerie.
  14. Tirez sur la boucle de suture pour l’insérer dans la rainure latérale de la fenêtre et attachez-la trois fois.
  15. Coupez le site proximal maximal du nœud pour éviter l’interruption des points de suture serrés lorsque ces souris sont éveillées.
  16. Laissez les souris récupérer de l’anesthésie (2-3 heures) et injecter du kétoprofène (5 mg / kg, sous-cutané dans la peau lâche à la base du cou ou de la hanche de l’animal) pour soulager la douleur. Réévaluer les signes de douleur toutes les 12 heures et le kétoprofène doit être envisagé toutes les 24 heures pendant 1 à 3 jours.
    REMARQUE: L’analgésie influence la sécrétion d’insuline en réponse au glucose9. Le choix et le moment de l’analgésie doivent être individualisés à des fins expérimentales.
  17. Accommodez la souris dans la cage avec une literie suffisante pour éviter le contact de la fenêtre avec la cage. Évitez de loger la maison avec les souris sans la chirurgie de la fenêtre.

3. Imagerie intravitale

  1. Allumez le microscope intravital, y compris la puissance laser.
  2. Allumez le coussin chauffant et réglez la régulation homéotherme à 37 °C.
    REMARQUE: Alternativement, utilisez un coussin chauffant passif ou une lampe avec un contrôle fréquent s’il n’y a pas de régulation homéotherme.
  3. Effectuer une anesthésie intramusculaire avec un mélange de tiletamine/zolazépam (30 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
    REMARQUE: L’utilisation de tiletamine / zolazépam est recommandée au lieu de la kétamine en raison de son effet indésirable de l’hyperglycémie. L’anesthésie optimale doit être choisie pour les besoins des expériences9,27.
  4. Insérez un cathéter vasculaire pour l’injection.
    1. Appliquez une pression sur le côté proximal de la queue avec l’index et le troisième doigt comme alternative à une application de garrot. Chauffez la queue avec une lampe si nécessaire.
    2. Stériliser la veine de la queue avec un spray à 70% d’éthanol.
    3. Insérez un cathéter de 30 G dans la veine latérale de la queue. La régurgitation du sang sera visualisée dans le tube PE10.
    4. Appliquez un ruban de soie sur le cathéter pour le stabiliser.
    5. Injecter du dextran FITC/TMR ou d’autres sondes fluorescentes (25 μg d’anti-CD31 conjugué avec Alexa 647), selon le cas, selon la combinaison de sondes fluorescentes18.
      REMARQUE: Pour les sondes d’anticorps conjugués fluorescents, injecter 2 h avant la séance d’imagerie.
  5. Transférez la souris de la plate-forme chirurgicale à l’étape d’imagerie.
  6. Insérez une sonde rectale pour contrôler automatiquement la température corporelle avec le système de coussin chauffant homéotherme.
  7. Insérez la fenêtre d’imagerie pancréatique dans le support de fenêtre préparé lors de la configuration de la microscopie intravitale (Figure 2). Pour un microscope inversé, un support de fenêtre peut ne pas être nécessaire.
  8. Effectuer une imagerie intravitale.
    1. Pour l’imagerie du pancréas, commencez par une lentille d’objectif à faible grossissement (par exemple, 4x) pour scanner toute la vue du pancréas dans la fenêtre d’imagerie pancréatique (champ de vision recommandé: 2500 x 2500 μm).
    2. Après avoir déterminé la région d’intérêt, passez à un objectif à grossissement plus élevé (20x ou 40x) pour effectuer l’imagerie au niveau cellulaire (champ de vision recommandé: 500 x 500 μm ou 250 x 250 μm). Dans cette expérience, la résolution latérale et axiale était d’environ 0,5 μm et 3 μm, respectivement.
    3. Effectuez une imagerie z-stack ou time-lapse pour observer la structure 3D ou la dynamique au niveau cellulaire, telle que la migration cellulaire.
      REMARQUE: Pour l’imagerie des cellules exprimant les protéines fluorescentes d’animaux transgéniques (MIP-GFP), 30 s d’exposition intermittente au laser de 488 nm avec une puissance allant jusqu’à 0,43 mW étaient tolérables sans photobleachage notable ou lésions tissulaires. Pour l’imagerie des protéines fluorescentes étiquetées avec Alexa 647, la puissance laser de 640 nm jusqu’à 0,17 mW était tolérable sans photoblage notable ou lésion tissulaire. Une exposition prolongée au laser d’excitation avec une puissance supérieure à ce réglage peut entraîner un photobleaching ou des lésions tissulaires par phototoxicité. Ajustez le gain et la puissance adéquats pour imager correctement la région d’intérêt. Le réglage détaillé des paramètres en microscopie intravitale doit être individualisé pour chaque microscopie intravitale préparée dans l’institut.

Résultats

La microscopie intravitale combinée à la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de support permet une imagerie longitudinale au niveau cellulaire du pancréas chez une souris. Ce protocole avec la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique assure une stabilité tissulaire à long terme qui permet l’acquisition d’une imagerie à haute résolution pour suivre les îlots individuels jusqu’à 3 semaines. En conséquence, l’imagerie en mosaïque pour un champ de vision étendu, la...

Discussion

Le protocole décrit ici consiste en une imagerie intravitale du pancréas à l’aide d’une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de support modifiée à partir d’une fenêtre d’imagerie abdominale. Parmi les protocoles décrits ci-dessus, la première étape critique est l’implantation de la fenêtre d’imagerie pancréatique intravitale chez la souris. Pour l’application de la colle dans la fenêtre, il est important d’appliquer la colle entre la marge de la fenêt...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la subvention n ° 14-2020-002 du Fonds de recherche SNUBH et par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)InvitrogenA20006Fluorescent probe for conjugate with antibody
BALB/C NudeOrientBioBALB/C NudeBALB/C Nude
BD Intramedic polyethylene tubingBD Biosciences427401PE10 catheter for connection with needle
C57BL/6NOrientBioC57BL/6NC57BL/6N
Cover glasses circularMarienfeld0111520Cover glass for pancreatic imaging window
FITC Dextran 2MDaMerck (Former Sigma Aldrich)FD200SFor vessel identification
IMARIS 8.1BitplaneIMARISImage processing
Intravital MicroscopyIVIM techIVM-CIntravital Microscopy
IRIS ScissorJEUNGDO BIO & PLANT CO, LTDS-1107-10This product can be replaced with the product from other company
Loctite 401Henkel401N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holderJEUNGDO BIO & PLANT CO, LTDH-1126-10This product can be replaced with the product from other company
Micro rectractorJEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD17004-03This product can be replaced with the product from other company
MicroforcepsJEUNGDO BIO & PLANT CO, LTDF-1034This product can be replaced with the product from other company
MIP-GFPThe Jackson Laboratory006864B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0AILEENB434Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30GB BRAUNFT9172220SFor Vascular Catheter, Use only Needle part
PANC-1 NucLightRedCustom-madeCustom-madeMade in laboratory
Pancreatic imaging windowGeumto EngineeringCustom orderPancreatic imaging window - custom order
PhysiosuiteKent ScientificPS-02Homeothermic temperature controller
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences553708Antibody for in vivo vessel labeling
Ring ForcepsJEUNGDO BIO & PLANT CO, LTDF-1090-3This product can be replaced with the product from other company
RompunBayerRompunAnesthetic agent
TMR Dextran 65-85kDaMerck (Former Sigma Aldrich)T1162For vessel identification
Window holderGeumto EngineeringCustom orderWindow holder - custom order
ZoletilVirbacZoletil 100Anesthetic agent

Références

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