Évaluation de la résection finale globale de l’ADN double brin à l’aide du marquage BrdU-ADN couplé à l’imagerie de discrimination du cycle cellulaire

Résumé

Dans le présent protocole, nous montrons comment visualiser la résection de l’extrémité double brin de l’ADN pendant la phase S/G2 du cycle cellulaire à l’aide d’une méthode basée sur l’immunofluorescence.

Résumé

L’étude de la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) est un domaine complexe et essentiel, qui n’a fait que devenir plus important en raison de l’utilisation de médicaments ciblant le DDR pour le traitement du cancer. Ces cibles sont les poly(ADP-ribose) polymérases (PARP), qui initient diverses formes de réparation de l’ADN. L’inhibition de ces enzymes à l’aide d’inhibiteurs de PARP (PARPi) permet d’obtenir une létalité synthétique en conférant une vulnérabilité thérapeutique dans les cellules déficientes en recombinaison homologue (HR) en raison de mutations dans le cancer du sein de type 1 (BRCA1), BRCA2, ou partenaire et localisateur de BRCA2 (PALB2).

Les cellules traitées avec PARPi accumulent des cassures double brin d’ADN (DSB). Ces cassures sont traitées par la machinerie de résection de l’extrémité de l’ADN, ce qui conduit à la formation d’ADN simple brin (ss) et à la réparation ultérieure de l’ADN. Dans un contexte déficient en BRCA1, la revitalisation de la résection de l’ADN par des mutations dans les inhibiteurs de la résection de l’ADN, tels que 53BP1 et DYNLL1, provoque une résistance AU PARPi. Par conséquent, être capable de surveiller la résection de l’ADN dans le cellulo est essentiel pour une compréhension plus claire des voies de réparation de l’ADN et le développement de nouvelles stratégies pour surmonter la résistance PARPi. Les techniques basées sur l’immunofluorescence (FI) permettent de surveiller la résection globale de l’ADN après des dommages à l’ADN. Cette stratégie nécessite un marquage génomique de l’ADN à longue impulsion avec de la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU). Après des dommages à l’ADN et une résection finale de l’ADN, l’ADN simple brin résultant est spécifiquement détecté par un anticorps anti-BrdU dans des conditions natives. De plus, la résection de l’ADN peut également être étudiée à l’aide de marqueurs du cycle cellulaire pour différencier les différentes phases du cycle cellulaire. Les cellules de la phase S/G2 permettent l’étude de la résection finale au sein de hr, tandis que les cellules G1 peuvent être utilisées pour étudier l’assemblage final non homologue (NHEJ). Un protocole détaillé pour cette méthode IF couplée à la discrimination du cycle cellulaire est décrit dans ce document.

Introduction

La modulation des facteurs de réparation de l’ADN est une méthode en constante évolution pour le traitement du cancer, en particulier dans les environnements tumoraux déficients en réparation de l’ADN DSB. L’inhibition de facteurs de réparation spécifiques est l’une des stratégies ingénieuses utilisées pour sensibiliser les cellules cancéreuses aux agents endommageant l’ADN. Des décennies de recherche ont conduit à l’identification de diverses mutations de gènes de réparation de l’ADN en tant que biomarqueurs pour les choix de stratégie ^{thérapeutique1}. Par conséquent, le domaine de la réparation de l’ADN est devenu une plaque tournante pour le développement de médicaments afin d’assurer une large gamme de traitements, renforçant ainsi le concept de médecine personnalisée.

Les DSB sont réparés par deux voies principales : NHEJ et ^HR2. La voie NHEJ est sujette aux erreurs, ligaturant rapidement les deux extrémités de l’ADN avec peu ou pas de traitement final de l’ADN et impliquant la protéine kinase (DNA-PKcs), le complexe Ku70/80, 53BP1 et les protéines RIF13. En revanche, les RH sont un mécanisme fidèle initié par ^BRCA14. Une étape essentielle de la réparation HR est le processus de résection de l’extrémité de l’ADN, qui est la dégradation des extrémités cassées conduisant à l’ADN simple brin (ss) avec des extrémités 3'-OH. BRCA1 facilite le recrutement des protéines en aval qui forment le résectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, qui sont impliquées dans la résection de l’ADN 5' à ^3'5.

La résection finale initiale est réalisée grâce à l’activité endonucléase de MRE11, ce qui permet un traitement ultérieur par les nucléases DNA2 et EXO1. Les porte-à-faux d’ADNSS générés sont rapidement recouverts par la protéine de réplication A (RPA) pour les protéger d’un traitement ultérieur. Par la suite, BRCA2, PALB2 et BRCA1 s’engagent à arbitrer le déplacement de la RPA et l’assemblage du nucléofilament RAD51 requis pour le mécanisme de réparation dirigé par homologie. Un équilibre délicat entre l’utilisation de NHEJ et HR est nécessaire pour le maintien optimal de l’intégrité génomique. Le choix de la voie dépend de la phase du cycle cellulaire. HR est utilisé de préférence pendant les phases S à G2 où la résection de l’ADN est au plus haut niveau, et les chromatides sœurs sont disponibles pour assurer une réparation appropriée.

La poly (ADP-ribose) polymérase 1 (PARP-1) est l’une des premières protéines recrutées dans le DSB. Il régule à la fois l’activité de résection et l’assemblage des effecteurs en aval impliqués dans le ^NHEJ5,6. PARP-1 est également nécessaire pour la réparation de la rupture simple brin de l’ADN pendant la ^{réplication7,8}. En raison de son rôle important dans la réparation de l’ADN, les inhibiteurs de PARP (PARPi) sont utilisés comme thérapies contre le cancer. Dans plusieurs cancers déficients en HR, le traitement par ParPi conduit à une réponse létale synthétique en raison de l’incapacité des cellules déficientes en HR à réparer les dommages accumulés par une voie ^{alternative9,10}. Il existe actuellement quatre PARPi approuvés par la FDA : Olaparib, Rucaparib, Niriparib et Talazoparib (également appelé BMN 673), qui sont utilisés pour divers traitements du cancer du sein et de ^l’ovaire11. Cependant, la résistance par parpi est courante, et une cause potentielle découle de la réacquisition de la compétence ^RH12. La perte ou l’inhibition de PARP-1 en présence d’irradiation dérégule la machinerie des résectosomes, conduisant à l’accumulation de tractus d’ADNSs plus ^longs13. Par conséquent, une étude approfondie de la résection de l’ADN in vivo est essentielle pour une meilleure compréhension des voies de réparation de l’ADN et le développement ultérieur de nouvelles stratégies pour traiter le cancer et surmonter la résistance parPi.

Plusieurs méthodes ont été utilisées pour détecter les événements de résection de l’ADN5. L’une de ces méthodes est la technique classique basée sur la FI permettant la coloration indirecte et la visualisation de l’ADN réséqué après DSB induit par le stress en utilisant un anticorps anti-RPA. Le marquage de l’ADN génomique avec de la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU) et la détection de l’ADNSS est une mesure directe des événements de résection de l’ADN. Il contourne la surveillance de la RPA, qui est impliquée dans de multiples processus cellulaires tels que la réplication de l’ADN. Dans la méthode décrite ici, les cellules incubées avec BrdU pour un seul cycle cellulaire permettent à BrdU d’être incorporé dans un brin de l’ADN cellulaire répliquant. Après résection, la coloration IF est réalisée dans des conditions permettant la détection de BrdU uniquement sous forme d’ADNSS, avec l’utilisation d’un anticorps anti-BrdU. Cet anticorps ne peut accéder qu’aux nucléotides BrdU exposés et ne détectera pas ceux intégrés dans l’ADN double brin. En utilisant la microscopie à fluorescence, l’ADN réséqué peut être visualisé sous la forme de foyers BrdU/ssDNA ponctués. L’intensité nucléaire de ces foyers peut être utilisée comme lecture pour quantifier la résection après des dommages à l’ADN. Cet article décrit étape par étape les processus de cette méthode, qui peut être appliquée à la plupart des lignées cellulaires de mammifères. Cette méthode devrait être d’une grande utilité en tant que moyen simple de surveiller la résection finale de l’ADN dans le cellulo, en tant que preuve de concept.

Protocole

1. Culture cellulaire, traitements et préparation du couvercle

REMARQUE: Tous les placages cellulaires, les transfections et les traitements, à l’exception de l’irradiation, doivent avoir lieu sous une hotte de culture cellulaire stérile.

1. Jour 1
   1. Dans une plaque à 6 puits, placez un seul couvercle dans chaque puits pour autant de conditions que nécessaire. Plaque ~ 150 000 cellules HeLa pour la transfection ou le traitement médicamenteux, selon les souhaits.
      REMARQUE: En cas de transfectation, il est recommandé de faire une transfection inverse au moment du placage, ou il est possible de faire une transfection vers l’avant plusieurs heures après le placage pour permettre l’adhérence. Une transfection inverse est réalisée en ajoutant le mélange de transfection à la bascule avant que les cellules ne soient ajoutées; ainsi, la transfection commence avant que les cellules ne commencent à adhérer. Une transfection vers l’avant, en revanche, est l’ajout du mélange de transfection post-adhérence à la surface généralement le lendemain. Cependant, il est possible de le faire le même jour, à condition de donner suffisamment de temps pour que les cellules adhèrent.
   2. Pour cette méthode, utilisez 4 puits: Puits 1: contrôle de l’ARNS (appelé siCTRL); Puits 2: siRNA contre PARP-1 (siPARP-1); Puits 3 : non traité; Puits 4 : Cellules à traiter avec 5 μM BMN673 1 h avant l’irradiation.
      NOTE: Dans ce protocole, tous les tests ont été effectués dans des conditions irradiées (voir rubrique 1.3).
   3. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de _CO2 pendant la nuit, bien que le protocole de transfection permette jusqu’à 3 jours d’incubation. Le temps d’incubation avant le traitement par BrdU dépendra de l’efficacité de la transfection de l’ARNsi. S’il n’y a pas de transfection, l’incubation pendant 16 h est suffisante pour permettre l’adhérence à la couche de couverture et une certaine croissance cellulaire.
      REMARQUE: Les conditions de l’incubateur peuvent être modifiées en fonction de la lignée cellulaire utilisée.
2. Jour 2
   1. Ajouter BrdU à une concentration finale de 10 μM dans le milieu de culture approprié et incuber pendant 16 h (un cycle cellulaire).
      REMARQUE: La solution de BrdU est préparée dans du diméthylsulfoxyde; la solution mère utilisée est de 10 mM et est stockée dans des aliquotes à -20 °C.
3. Jour 3
   1. Irradier les plaques avec une dose totale de 5 Gy d’irradiation aux rayons X (faire varier la dose d’irradiation en fonction du type d’irradiateur, par exemple, les irradiateurs de petits animaux par rapport aux irradiateurs de paillasse). Voir le Tableau des matériaux pour la marque et le modèle d’irradiateur utilisé.
   2. Retournez les plaques dans l’incubateur et libérez les cellules pendant 3 h.
   3. Pendant la période d’incubation de 3 heures, préparez les deux tampons, A et B, et 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      REMARQUE: Les tampons A et B et le saccharose doivent être préparés frais le jour de la fixation, en utilisant une solution de saccharose frais pour éviter toute contamination.
      1. Préparer le tampon A (tampon de pré-extraction), selon l’ordre (30 mL) décrit dans le tableau 1.
         REMARQUE: Le saccharose 1M doit être préparé le jour de l’utilisation pour éviter toute contamination.
      2. Préparer le tampon B (Cytoskeleton Stripping Buffer) selon l’ordre décrit dans le tableau 1 (30 mL).
         NOTE: Le tampon B doit être préparé dans l’ordre indiqué pour éviter la précipitation de la solution de Tween-20 et de désoxycholate de sodium.
      3. Préparer 4 % de PFA, 2 mL par condition (10 mL), sous une hotte chimique (tableau 1).

2. Pré-extraction et fixation

REMARQUE: Toute la pré-extraction et la fixation sont effectuées avec les couvercles restant dans la plaque de culture tissulaire sur de la glace ou à 4 ° C; le couvercle n’est soulevé que lors de la dernière étape du montage (voir discussion).

1. Pré-extraction
   1. Aspirez le milieu, lavez soigneusement les cellules deux fois avec 1x PBS et retirez le PBS. Ajouter 2 mL de tampon de pré-extraction A et incuber immédiatement à 4 °C pendant 10 min.
      REMARQUE : Il est important que le temps d’incubation dans le tampon A ne soit pas prolongé. Une incubation prolongée dans les tampons de pré-extraction entraînera une augmentation du nombre de cellules détachées du couvercle. Alternativement, au lieu d’une incubation à 4 ° C, l’incubation peut se faire sur de la glace.
   2. Retirez le tampon A par aspiration.
      REMARQUE: Ne lavez pas les couvercles après avoir retiré le tampon A. Passez à l’étape suivante.
   3. Ajouter 2 mL de tampon de décapage du cytosquelette B et incuber immédiatement à 4 °C pendant 10 min. Aspirez soigneusement le tampon B et lavez soigneusement les cellules une fois avec 1x PBS. Aspirez soigneusement le 1x PBS.
2. Fixation
   1. Fixez les cellules en ajoutant 2 mL de PFA à 4% sous le capot chimique.
      REMARQUE: Pfa est toxique et doit être manipulé sous une hotte chimique.
   2. Incuber les cellules à température ambiante pendant 20 min. Lavez les couvercles deux fois avec 1x PBS et aspirez l’excès.
   3. Couvrir les couvercles avec du méthanol 100% froid et incuber les couvercles à -20 °C pendant 5 min. Laver deux fois avec 1x PBS.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les couvercles peuvent être stockés à 4 °C dans 1x PBS et la plaque enveloppée dans du papier d’aluminium si nécessaire. Les cellules ne doivent pas être conservées plus de 5 jours avant la poursuite du protocole IF.

3. Perméabilisation

1. Incuber les cellules avec 2 mL de 1x PBS contenant 0,5% de Triton X-100 à température ambiante pendant 15 min. Lavez les couvercles trois fois avec 2 mL de 1x PBS.

4. Immunocoloration

1. Étape de blocage
   1. Préparez suffisamment de tampon de blocage frais (3 % de BSA dans 1x PBS) pour utiliser 2 mL par couvercle.
      REMARQUE: Préparez un tampon de blocage supplémentaire de 5 mL pour fabriquer les solutions d’anticorps.
   2. Ajouter 2 mL de tampon bloquant à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h.
2. Incubation d’anticorps primaires
   1. Préparer la solution d’anticorps primaire dans un tampon bloquant frais : BrdU RPN202 1:1000 et antigène nucléaire cellulaire proliférant (APN) 1:500, 100 μL par couvercle.
      REMARQUE: Pour préserver l’anticorps, un volume plus petit peut être utilisé, 75-100 μL pour un couvercle de 22 x 22 mm, 50-75 μL pour un couvercle de 18 x 18 mm.
   2. Sur chaque couvercle, ajouter 100 μL de solution d’anticorps primaires. Couvrez les couvercles avec un carré de parafilm à l’aide d’une pince à épiler et positionnez soigneusement le parafilm pour ne pas créer de bulles.
   3. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
   4. Retirez les carrés de parafilm et lavez les couvercles trois fois avec 2 mL de PBS stérile 1x.
3. Incubation d’anticorps secondaires
   1. Préparer suffisamment de solution d’anticorps secondaires dans un tampon bloquant frais : dilution secondaire A11011 fluorescente anti-souris 488 (pour BrdU) 1:800 et dilution secondaire A11011 fluorescente anti-lapin 568 (pour PCNA) 1:800.
      REMARQUE: Les couleurs utilisées peuvent être modifiées pour répondre aux besoins expérimentaux. La marque spécifique utilisée se trouve dans le tableau des matériaux.
   2. Ajouter sur chaque coverlip 100 μL de solution d’anticorps secondaires, recouvrir les coverslips d’un carré de parafilm à l’aide d’une pince à épiler et positionner soigneusement le parafilm sans bulles.
   3. Incuber l’anticorps secondaire à température ambiante pendant 1 h avec la plaque recouverte de papier d’aluminium.
   4. Lavez les couvercles trois fois avec 2 mL de 1x PBS.
4. Coloration nucléaire
   1. Préparer un volume de 2 mL par couvercle de 1x PBS contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une concentration finale de 1 μg/mL (1:1000).
   2. Ajoutez à chaque couvercle 2 mL de la solution DAPI. Incuber les couvercles à température ambiante pendant 10 min avec la plaque recouverte de papier d’aluminium. Lavez les couvercles deux fois avec 1x PBS.
   3. Couvrez les couvercles avec 1x PBS et utilisez une aiguille ou une pince à épiler fine pour soulever le couvercle du fond du puits. Épongez soigneusement l’excès de liquide en tapotant doucement un bord sur une serviette en papier.
      REMARQUE: Veillez à ne pas laisser tomber la diapositive ou à laisser la surface plane avec les cellules adhérentes toucher le papier.
   4. Montez les couvercles sur des glissières à l’aide de 10 à 20 μL de supports de montage spécifiques à la FI.

5. Acquisition et analyse d’images

REMARQUE: L’acquisition d’images peut être effectuée sur plusieurs types de microscopes fluorescents. Un microscope à épifluorescence avec un objectif d’huile 63x a été utilisé; voir le tableau des matériaux pour la marque et le modèle. Les piles Z ne sont pas nécessaires, bien qu’elles puissent être utiles en fonction de la lignée cellulaire et du niveau de coloration mitochondriale.

1. Analyse d’images
   1. Pour chaque image, créez plusieurs fichiers tiff ; fusionner tous les plans, mais garder les couches de couleur séparées. Importez ces fichiers dans Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) et analysez-les à l’aide du pipeline Speckle Counting (vidéo supplémentaire 1).
   2. Téléchargez les images (figure supplémentaire S1A).
      1. Pour commencer à créer le projet, chargez le pipeline de comptage de mouchetures dans le programme et les images à analyser dans la zone fournie.
      2. Utilisez le module NamesAndTypes pour attribuer un nom significatif à chaque image par lequel les autres modules feront référence à it-C01: Representing BrdU Channel; C02 : Représentation du canal PCNA; C03 : Représentation du canal DAPI.
         REMARQUE: Ces identificateurs dépendront du microscope; il doit y avoir un identificateur dans le nom du fichier pour distinguer les canaux.
   3. Identifiez le fichier qui sera utilisé pour identifier les noyaux et nommez-le (changez ce nom au besoin) (voir la figure supplémentaire S1B et la figure supplémentaire S1C).
      1. Sélectionnez le diamètre de l’objet entre 50 et 300 unités de pixels, qui est la plage de taille acceptable pour les noyaux, mais modifiez la valeur pour l’adapter aux noyaux de l’image.
         REMARQUE: Il se peut que 50 soit une valeur trop grande et empêche l’identification de noyaux plus petits; de même, 300 peut permettre de compter de grands groupes de noyaux comme 1.
      2. Jetez les objets en dehors de la plage de diamètre pour vous assurer que seuls ceux qui correspondent aux critères seront comptés.
      3. Supprimez les objets qui touchent les bordures pour supprimer les cellules qui ne se trouvent que partiellement dans le champ.
      4. Appliquez le seuil pour l’adapter aux images spécifiques. Notez les paramètres suivants à titre d’exemple. Modifiez le facteur de correction du seuil en fonction de la rigueur de la stratégie de seuil. D’autres paramètres incluent la stratégie de seuil: Global; méthode de seuil: Otsu; seuil de deux ou trois classes : deux classes; échelle de lissage du seuil: 1; facteur de lissage du seuil: 1; limites inférieure et supérieure du seuil : 0,0 et 1,0; méthode pour distinguer les objets agglomérés: Forme; et méthode pour tracer des lignes de division entre des objets agglomérés : Propagate.
         REMARQUE: Pour chaque paramètre, le profileur de cellule fournit des définitions complémentaires et une possibilité disponible pour le réglage de la variable.
   4. Identifiez l’objet principal pour identifier les foyers (figure supplémentaire S2A).
      1. Utilisez les paramètres suivants : sélectionnez l’image d’entrée : Maskedgreen ; nommé l’objet principal à identifier : BrdUFoci ; diamètre typique de l’objet: 1-15; jeter l’objet en dehors de la plage de diamètre: Oui; jeter l’objet touchant la bordure de l’image : Non ; stratégie de seuil : Adaptative; méthode de seuil: Otsu; seuil de deux ou trois classes : Trois classes; échelle de lissage du seuil: 1; facteur de lissage du seuil: 3; et taille du filtre de lissage: 4.
   5. Mesurer l’intensité (figure supplémentaire S2B).
      1. Sélectionnez l’image à mesurer : OrigGreen.
      2. Cliquez sur Ajouter une autre image. Sélectionnez l’image à mesurer : PCNA. Sélectionnez les objets à mesurer : Noyaux.
         REMARQUE: Cela sera utilisé pour mesurer l’intensité brdU et PCNA - les données finales qui seront représentées graphiquement.

Résultats

Dans ce protocole, le test à base de bromodéoxyuridine (BrdU) a été utilisé pour mesurer quantitativement la réponse de résection des cellules HeLa aux dommages induits par l’irradiation. Les traces d’ADNSs générées sont visualisées comme des foyers distincts après coloration par immunofluorescence (Figure 1A). Les foyers identifiés ont ensuite été quantifiés et exprimés comme l’intensité totale intégrée de la coloration BrdU dans les noyaux (Fi...

Discussion

Cet article décrit une méthode qui utilise la coloration IF pour mesurer les variations de la résection de l’ADN dans le cellulo. La norme actuelle pour observer un effet sur la résection de l’ADN est la coloration RPA; cependant, il s’agit d’une méthode indirecte qui peut être influencée par la réplication de l’ADN. Auparavant, une autre technique DE RÉSECTION DE L’ADN basée sur l’incorporation de BrdU a été décrite pour classer les intensités résultantes dans les cellules BrdU posi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 568 goat anti-rabbit	Molecular probes	A11011	1:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Molecular probes	A11001	1:800
Anti PARP1 (F1-23)	Homemade		1:2500
Anti PCNA (SY12-07)	Novus	NBP2-67390	1:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)	Abcam	Ab7291	1:100000
anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1:1000
Benchtop X-ray Irradiator	Cell Rad
BMN673	MedChem Express	HY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)	Sigma	B5002
BSA	Sigma	A7906
Cell profiler	Broad Institute	V 3.19	https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft	Fisher scientific	13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen Life Technology	D1306
DMEM high glucose	Fisher scientific	10063542
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fetal Bovine serum	Gibco	12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22	Fisher scientific	12 541B
Fluorescent microscope	Leica	DMI6000B	63x immersion objective
HeLa	ATCC	CCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V	VWR	51030408	37% CO2
MgCl2	BioShop Canada	MAG520.500
NaCl	BioShop Canada	SOD002.10
Needle
PBS 1x	Wisent Bio Products	311-010-CS
PFA 16%	Cedarlane Labs	15710-S(EM)
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757-100G
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen Life Technology	P-36930
RNAiMAX	Invitrogen	13778-075
siPARPi	Dharmacon		AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA control	Dharmacon		UUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium Deoxycholcate	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sucrose	BioShop Canada	SUC507.5
Tris-base	BioShop Canada	TRS001.5
Trition X-100	Millipore Sigma	T8787-250ML
Tween20	Fisher scientific	BP337500
Tweezers