PCR numérique par gouttelettes pour détecter les mutations indels dans les populations de moustiques anophélines génétiquement modifiés

Résumé

Ce protocole fournit les étapes de l’extraction de l’ADN à la mise en place expérimentale de la PCR numérique des gouttelettes (ddPCR), y compris l’analyse pour l’identification et la quantification des événements de jonction terminale non homologues (NHEJ) sur les sites cibles après le clivage Cas9 induit par l’ARNg et la réparation de l’ADN. D’autres utilisations de cette méthode comprennent des applications telles que la détection de polymorphisme et la vérification des variantes d’édition de gènes.

Résumé

Les progrès récents de la génomique des moustiques et des technologies de génie génétique ont favorisé le besoin de méthodes rapides et efficaces pour détecter les variations ciblées de la séquence d’ADN à grande échelle. Plus précisément, la détection des insertions et des délétions (indels) aux sites génétiquement modifiés générés par l’ARN guide CRISPR (aRNg) / jonction terminale non homologue (NHEJ) médiée par Cas9 est importante pour évaluer la fidélité de la mutagénèse et la fréquence des changements involontaires. Nous décrivons ici un protocole pour la PCR par gouttelettes numériques (ddPCR) qui est bien adapté à l’analyse NHEJ à haut débit. Bien que cette méthode ne produise pas de données permettant d’identifier la variation de séquence individuelle, elle fournit une estimation quantitative de la variation de séquence au sein d’une population. De plus, avec des ressources appropriées, ce protocole peut être mis en œuvre dans un laboratoire sur le terrain plus facilement que le séquençage de nouvelle génération ou de Sanger. La ddPCR a également un délai d’exécution des résultats plus rapide que l’une ou l’autre de ces méthodes, ce qui permet une analyse plus rapide et plus complète de la variation génétique des populations sauvages lors d’essais sur le terrain d’organismes génétiquement modifiés.

Introduction

Les forçages génétiques ont un immense potentiel pour contrôler les populations d’insectes d’intérêt médical et agricole^1,2,^3,4,5. Par exemple, les systèmes de forçage génétique basés sur les nucléases CRISPR Cas et les ARN guides (ARNg) peuvent être utilisés pour modifier les populations de moustiques vecteurs en introduisant des caractères qui confèrent une réfractaireté aux parasites du paludisme conduisant à une transmission réduite et à moins de maladies^1,4,5. Le système de forçage génétique se copie lui-même et le trait associé d’un chromosome homologue à un autre dans les cellules germinales pré-méiotiques, ce qui garantit que la majorité de la progéniture hérite de la pulsion et crée le potentiel de modification durable et durable de la population sur le terrain. Cependant, l’un des inconvénients des méthodes basées sur cas/aRNg est la possibilité de générer des mutations d’insertion et de délétion (indel) par réparation de l’ADN à jonction terminale non homologue (NHEJ), entraînant la génération d’allèles résistants à l’entraînement, qui, lorsqu’ils sont accumulés à une fréquence suffisamment élevée dans la population, peuvent empêcher le système d’entraînement de se propager^1,2,3,4 . Ce protocole détaille une méthode fiable et à haut débit qui peut déterminer la prévalence et la quantité relative de mutations indel, à la fois au niveau de la population et de l’individu, au cours du forçage génétique basé sur Cas / ARNg.

Les méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) offrent une résolution de séquençage inégalée. Cependant, le coût et les exigences techniques associés au NGS interdisent les essais de routine et limitent son utilisation comme méthode à haut débit pour évaluer les indels^6,7,8. Les méthodes traditionnelles de quantification par PCR sont utilisées depuis longtemps comme procédure d’évaluation standard pour les indels du génome; cependant, ces méthodes nécessitent beaucoup de main-d’œuvre, prennent beaucoup de temps pour obtenir des données et présentent un degré élevé de variabilité. La PCR par gouttelettes numériques (ddPCR) s’est avérée plus sensible à la détection des mutations que le séquençage de Sanger dans certaines applications et a une limite de détection inférieure à celle du NGS dans d’autres^6,7,8,9. De plus, le coût d’évaluation d’un ensemble d’échantillons et le délai d’exécution pour obtenir des résultats sont moins coûteux et plus rapides, respectivement, pour la ddPCR que le séquençage de Sanger ou le séquençage NGS^9. À l’aide d’un système à double sonde, le test Drop-Off identifie les allèles NHEJ en fonction de l’absence de séquence de type sauvage (WT) au site de coupe Cas9 cible dirigé par l’ARNg. Dans ce test, un amplicon court comprenant le site de coupe prédit du système Cas/aRNg est amplifié avec une paire d’amorces spécifique. Une sonde fluorescente est conçue pour se lier à une région conservée de l’amplicon et une autre sonde fluorescente reconnaît la séquence WT du site de coupe. En présence d’un allèle NHEJ, ce dernier ne se liera pas à l’amplicon.

L’utilisation de la ddPCR permet de concevoir des amorces pour cibler les délétions, les différences de paires de bases uniques et les insertions, ce qui permettra le profilage NHEJ dans les analyses de population de moustiques⁹. Compte tenu de ces caractéristiques attrayantes, nous avons créé un protocole pour la ddPCR pour la détection à haut débit des indels générés par un système de forçage génétique basé sur Cas / aRNg chez les moustiques.

Protocole

1. Extraction de l’ADN

1. Préparer le tampon de lyse EDTA/Nuclei (EDTA/NLS) avec un rapport de 500 μL de NLS et de 120 μL d’EDTA par échantillon. Mise à l’échelle pour plusieurs échantillons. Refroidir le mélange sur de la glace.
   REMARQUE: La solution deviendra trouble en 2-5 min lorsqu’elle est refroidie en fonction du volume.
2. Homogénéiser l’échantillon de moustiques à l’aide d’un homogénéisateur mécanique pendant 10 à 15 s dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL rempli de 600 μL d’EDTA/NLS réfrigéré; Mélanger.
3. Ajouter 17,5 μL de 20 mg/mL de protéinase K dans le tube et bien mélanger.
4. Incuber toute la nuit à 55 °C. Alternativement, incuber l’échantillon à 55 °C pendant 3 h en agitant et en tourbillonnant l’échantillon toutes les 1 h.
5. Ajouter 200 μL de solution de précipitation protéique à l’échantillon à température ambiante et vortexer vigoureusement pendant 20 s.
6. Refroidir l’échantillon pendant 5 min sur de la glace.
7. Centrifuger l’échantillon en protéines granulées à 15 890 FCR pendant 4 min.
8. Aspirer soigneusement le surnageant qui contient l’ADN et le transférer dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 mL contenant 600 μL d’isopropanol.
9. Mélangez doucement la solution en inversant le tube 5 à 10 fois. Centrifugeuse pendant 1 min à 15 890 RCF. Décantez soigneusement le surnageant tout en préservant la pastille d’ADN.
10. Ajouter 600 μL d’éthanol à température ambiante à 70 %. Lavez l’ADN granulé en inversant doucement le tube.
11. Centrifugeuse pendant 1 min à 15 890 RCF. Retirez soigneusement le surnageant par aspiration à l’aide d’une pointe de pipette en verre.
12. Inverser le tube sur du papier absorbant propre et sécher la pastille à l’air libre pendant 10 à 15 min.
13. Resuspendez l’ADN avec de l’eau de qualité PCR. Utilisez 20 μL par échantillon de moustique individuel ou 100 μL pour 10 moustiques regroupés.
    REMARQUE: Les méthodes d’extraction de l’ADN pour les échantillons de moustiques à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux)sont adaptées du protocole isolation de l’ADN génomique des cellules de culture tissulaire et des tissus animaux du fabricant.

2. Réactions ddPCR et préparation de la génération de gouttelettes

1. Quantifier l’ADN à l’aide d’un fluoromètre.
   REMARQUE: Pour le test de dépôt, il est recommandé d’utiliser une plage de 3 000 à 30 000 copies du génome haploïde par réaction, conçue pour détecter les événements NHEJ avec une sonde de marquage HEX qui se lie à une séquence WT du site de coupe ciblé et ne recuit pas (chute) en cas de délétion ou d’insertion sur le site cible, indiquant la présence d’une variante NHEJ.
2. Calculez le nombre de copies en utilisant le poids du génome haploïde et la concentration d’ADN dans l’extrait. Cela se fait en multipliant la concentration de l’ADN extrait par le volume utilisé pour obtenir la masse totale d’ADN, puis en la divisant par le poids du génome haploïde. Assurez-vous que le volume ajouté est compris entre 1 et 10 μL. Diluer au besoin pour être dans la plage de copie du génome haploïde recommandée.
   REMARQUE: Un génome haploïde d’Anopheles gambiae est estimé à 0,27 pg par moustique adulte¹⁰.
3. Concevoir des amorces et des sondes. Concevoir des amorces d’oligonucléotides avant et arrière avec une température de fusion de l’amorce (Tm) comprise entre 55 et 60 °C qui flanquent les extrémités 5' et 3' du site cible de l’ARNg produisant un amplicon de 150-400 bp.
   1. Sonde marquée HEX (Hexachloro-fluorescéine) pour la détection NHEJ : Concevoir un oligonucléotide d’environ 15-20 bp de longueur complémentaire au site cible et ajouter la sonde HEX à l’extrémité 5' et BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) à l’extrémité 3'. La Tm de la sonde d’hydrolyse doit être supérieure de 3 à 10 °C à la Tm des amorces.
   2. Sonde marquée FAM (6-carboxyfluorescéine) pour référence WT: Concevoir un oligonucléotide ~15-20 bp de longueur complémentaire à un site du génome conservé éloigné (environ 25 bp) du site cible et ajouter la sonde FAM à l’extrémité 5' et BHQ1 à l’extrémité 3'. La Tm de la sonde d’hydrolyse doit être supérieure de 3 à 10 °C à la Tm des amorces.

3. Préparation de la réaction PCR

1. Préparer 25 μL du mélange d’échantillons ddPCR avec les composants suivants : supermélange ddPCR pour sondes (pas d’UTP) : 12,5 μL, amorces avant et arrière (10 μM) : 1 μL chacune, sondes HEX/FAM (10 μM) : 0,625 μL chacune, ADN : 1-5 μL (3 750-37 500 copies du génome haploïde) et eau : jusqu’à 25 μL.
2. Bien mélanger les réactions par vortex ou pipetage par reflux (haut et bas) (20x).
   REMARQUE: Si les réactions sont dans une plaque de 96 puits, pipettez tout le volume vers le haut et vers le bas 20 fois plutôt que de vortexer pour éviter la formation de bulles.
3. Centrifugez brièvement les échantillons pour déposer le mélange au fond du tube ou du puits.
   REMARQUE: Assurez-vous que les réactions sont à température ambiante pour la génération de gouttelettes. Préparez 1x de mélange ddPCR pour les puits supplémentaires / inutilisés dans chaque cartouche (chaque cartouche a 8 puits).

4. Génération de gouttelettes

1. À l’aide d’une pipette multicanal de 50 μL, chargez 20 μL du mélange d’échantillon ddPCR dans la rangée centrale de la cartouche(Figure 1A,en haut).
2. Chargez 70 μL d’huile dans la rangée du bas. Chargez 20 μL de 1x supermélange ddPCR dans des puits inutilisés.
   REMARQUE: N’introduisez pas de bulles.
3. Placez le joint en touchant uniquement les bords, en évitant la zone concavée centrale (Figure 1B).
4. Placez la plaque solidement dans le générateur de gouttelettes et fermez le couvercle pour commencer la course.
5. À l’aide de la pipette multicanal, transférer 40 μL du mélange d’émersion de la rangée supérieure de la cartouche(Figure 1A,en bas) dans la plaque de 96 puits.
   1. Prélever un échantillon liquide pendant 3-5 s à un angle de 45-30°. Expulsez le mélange lentement pendant plus de 3 s à un angle de 45° sur le côté du puits, ce qui lui permet de s’égoutter sur le côté. Il est acceptable d’aller au deuxième arrêt (expulsion complète) de la pipette pour expulser tout le liquide.
6. À l’aide de joints thermiques en aluminium, sceller les plaques pendant 5 s à 180 °C.

5. PCR

1. Placez la plaque scellée dans le thermocycleur(Figure 1C)et réglez les conditions de PCR recommandées si vous suivez les directives de dépôt NHEJ comme suit:
   1. Dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min.
   2. Réglez 40 cycles de 94 °C pendant 30 s pour dénaturer, 55 °C pendant 1 min pour recuit et 60 °C pendant 2 min pour prolonger.
   3. Maintenir à 98 °C pendant 10 min.
   4. Maintenir à 4 °C.
      REMARQUE: La température de recuit pour des amorces et des ensembles de sondes spécifiques peut être optimisée à l’aide d’un gradient thermique. Utilisez un taux de rampe de 2 °C/s pour toutes les étapes. Les conditions de PCR doivent être ajustées en fonction de chaque conception expérimentale et de chaque configuration.

6. Lecture des gouttelettes

1. Placez la plaque solidement dans le lecteur de gouttelettes avec le puits A-1 en haut à gauche (coin lissé, les trois autres sont bordés) (Figure 1D).
2. Configurer la plaque dans le programme : Désignation de FAM comme canal de référence connu et HEX comme canal inconnu(Figure 2A).
3. Exécutez l’expérience de lecture Droplet en tant que quantification directe. Une fois l’exécution terminée, remplacez le type d’expérience par Drop-Off (DOF) pour l’analyse (Figure 2A).

7. Analyse

1. Désignez les paramètres expérimentaux corrects(Figure 2A): Informations sur l’échantillon, SuperMix, Nom de la cible (WT ou NHEJ), Type de cible (Ref ou Inconnu), Signal Ch1 (HEX ou FAM), Signal Ch2 (HEX ou FAM), et définissez manuellement le seuil de nombre de gouttelettes (recommander au-dessus de 10 000 pour des résultats fiables). Le logiciel effectuera la majeure partie de l’analyse avec le paramètre désigné.
2. Vérifiez le nombre de gouttelettes dans l’onglet Gouttelettes; s’assurer que tous sont au-dessus de 10 000(figure 2B).
3. Vérifiez l’amplitude 1 D pour une séparation efficace du signal des négatifs.
4. Dans l’éditeur de plaques, mettez en surbrillance la plaque entière et définissez le Type d’expérience sur Déposer.
5. Définissez la cible WT comme référence,en désignant le canal un pour FAM et le canal deux pour HEX.
6. Définissez la cible NHEJ comme inconnue, en désignant le canal un pour FAM et le canal deux comme aucun.
7. Dans l’onglet Amplitude 2D, définissez les seuils de cluster avec les outils graphiques pour chaque échantillon. Considérons la queue associée à l’amas WT; ceci est normal pour les tests NHEJ (Figure 3A).
   REMARQUE: Sous l’onglet Ratio, cliquez sur l’icône d’engrenage en haut à droite du graphique. Sélectionnez l’abondance fractionnaire. Le graphique va maintenant tracer un point correspondant au pourcentage d’événements NHEJ (Figure 3B).

Résultats

Une application de cette procédure apparaît dans Carballar-Lejarazú et al.⁹. Le test ddPCR Drop-off utilise deux sondes fluorescentes pour discerner les séquences WT et indel : une sonde FAM se lie à une séquence conservée dans l’amplicon, tandis que la sonde HEX cible la séquence WT du site ciblé(Figure 4A). En présence d’un indel, la sonde HEX ne se lie pas. Des résultats représentatifs peuvent être trouvés dans la figure 2, le tableau 1 et le tableau 2 de Carballar-Lejarazú et al.⁹. En utilisant ce protocole, il a été prouvé que la ddPCR détecte une grande variété d’événements NHEJ induits par CRISPR-Cas9 et quantifie la fréquence NHEJ dans un échantillon individuel ou groupé. Quinze échantillons regroupés différents de 10 moustiques contenaient chacun divers allèles NHEJ (tableau 2 de Carballar-Lejarazú et al.⁹). Ceux-ci ont été analysés avec ddPCR en utilisant le protocole et les paramètres présentés ici. Les résultats du tableau 1⁹ montrent que les 15 échantillons portaient tous des allèles indel à 100 % identifiés par le test Drop-off (Figure 4B). Dans une autre expérience, 11 échantillons groupés de moustiques WT et de moustiques NHEJ avec différents pourcentages NHEJ (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% et 100%) ont été examinés avec ce protocole ddPCR, et les résultats (Figure 2; Carballar- Lejarazú et al.⁹) ont montré que le pourcentage identifié est proche de la technique comparée de détection d’indel par analyse amplicon(figure 4C).

Figure 1: Installation et procédure expérimentales. (A) Préparation de la cartouche pour la génération de gouttelettes. (Haut) Les échantillons sont remplis dans la rangée du milieu de la cartouche, tandis que l’huile est remplie dans la rangée du bas. (En bas) Rangée supérieure remplie de gouttelettes émulsionnées après la génération de gouttelettes. (B) Générateur de gouttelettes avec une cartouche remplie d’échantillon et recouverte d’un joint en place. (C) Plaque de 96 puits recouverte d’un joint d’étanchéité dans un Thermo-Cycler. (D) Lecteur de gouttelettes avec plaque de 96 puits en place avec un couvercle métallique verrouillé sur la plaque pour la fixer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Lecture des gouttelettes. (A) Interface logicielle pour la lecture de gouttelettes. Les boîtes orange montrent des puits avec des échantillons. Les boîtes grises sont des puits vides. Les paramètres expérimentaux sont définis dans le panneau Outils d’édition (à droite). Chaque échantillon peut être modifié en cliquant sur la case d’échantillonnage correspondante. Sélectionnez Drop Off (DOF) pour Type expérimental. Dans les informations de l’exemple, renseignez les informations appropriées pour le nom et le typede l’échantillon , ainsi que SuperMix. Choisissez le dépôt de base pour les informations de test. Pour l’échantillon WT, choisissez WT pour le nom dela cible , Ref pour le type de cible, et FAM et HEX pour signal Ch1 et Ch2, respectivement. Pour les échantillons NHEJ, renseignez le nom approprié pour le nom dela cible , choisissez Inconnu pour le type de cible, puis choisissez FAM pour Signal Ch1. Laissez signal Ch2 à Aucun. ( B )Résultatsde la numération des gouttelettes pour plusieurs échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Analyse du test drop-off. (A) Diagramme 2D en grappe pour le nombre de gouttelettes des allèles WT et NHEJ. Dans l’onglet Amplitude 2D, toutes les gouttelettes ne sont pas classées par défaut. Dans cette figure, les couleurs sont attribuées manuellement pour la distinction. Les amas de points orange sont des nombres d’allèles WT obtenus par liaison des sondes FAM et HEX à la séquence de référence et à la séquence du site cible, respectivement. Les points bleus représentent des dizaines de gouttelettes qui ont une liaison FAM à la séquence de référence, mais pas de liaison HEX à la séquence du site cible (d’où la chute de HEX). Les points gris sont des gouttelettes vides qui n’ont pas de liaison FAM ou HEX. (B) Graphiques de ratio/abondance des événements NHEJ. Sous l’onglet Ratio, sélectionnez Abondance fractionnaire pour un graphique avec le pourcentage correspondant d’événements NHEJ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Application du test Drop-Off avec ddPCR pour l’identification et la quantification non homologues de l’assemblage final dans la lignée transgénique Anopheles stephensi, AsMCRkh1. (A) Présentation schématique du test ddPCR Drop-Off pour détecter les mutations sur un site d’ADN ciblé avec un système à double sonde. Un amplicon de 150-400 bp est amplifié avec les amorces avant et arrière. Une sonde marquée FAM est conçue pour se lier à une séquence conservée de l’amplicon, tandis qu’une sonde marquée HEX est conçue pour se lier au site ciblé de l’ARNg WT. (B) Détection de différents types d’indels avec ddPCR. Quinze pools de 10 moustiques AsMCRkh1 contenant chacun différents types d’indel, y compris l’insertion, la délétion et la substitution, ont été analysés avec le test ddPCR Drop-Off. Les détails des mutations et des séquences peuvent être trouvés dans le tableau 2 et le tableau S3 de Carballar et al. ⁹. (C) Quantification du NHEJ dans des échantillons mixtes de moustiques AsMCRkh1 et WT avec différents rapports (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 et 0:10) à l’aide de la ddPCR et d’une technique comparée de détection d’indel par analyse amplicon⁹. Images adaptées de Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Amorce/Sonde	Séquence (5' » 3')
ddPCR Introduction directe	ATGATCAAATGTCGACCG
ddPCR Reverse Primer	ACCGTACTGGTTGAACA
Sonde HEX ddPCR (BHQ1)	[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]
Sonde ddPCR FAM (BHQ1)	[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]
HEX: Hexachloro-fluorescéine, FAM: 6-carboxyfluorescéine, BHQ: Black Hole Quencher

Tableau 1 : Séquences d’amorces et de sondes.

Discussion

La PCR par gouttelettes numériques est une méthode efficace pour déterminer la présence d’allèles indel résultant d’événements NHEJ dans un système de forçage génétique basé sur Cas/ARNg et permet de quantifier la fréquence de ces allèles chez les individus ou les populations. Certaines étapes du protocole doivent être suivies avec un soin particulier pour obtenir des résultats fiables. Tout d’abord, l’extraction de l’ADN génomique doit être effectuée avec soin pour assurer une qualité élevée et une quantité suffisante. Une bonne extraction permettra de déterminer avec précision les copies du génome haploïde par réaction. D’après notre expérience, un kit disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux)a fourni des extractions d’ADN de haute qualité constantes. Cependant, les extractions de moustiques individuels peuvent s’avérer particulièrement difficiles car la pastille d’ADN devient difficile à visualiser et peut facilement être aspirée avec le surnageant si elle n’est pas prudente. Deuxièmement, les apprêts et les sondes doivent être conçus avec soin. Avant de terminer l’expérience ddPCR, assurez-vous que les amorces conçues aboutissent à un seul produit PCR en effectuant d’abord une PCR traditionnelle et en visualisant un seul produit par électrophorèse sur gel. La sonde FAM de référence doit également être conçue de manière à être complémentaire à une séquence hautement conservée. Cela garantira des détections précises des allèles WT dans une population diversifiée. Les combinaisons amorce/sonde pour chaque expérience unique auront des conditions de thermocyclerie différentes, et il est recommandé d’optimiser ces conditions à l’aide d’un gradient thermique.

Il existe d’autres méthodes d’identification des indels, telles que le séquençage de Sanger ou le NGS. Le séquençage de Sanger est limité car il a une limite de détection inférieure et un faible pouvoir de découverte pour identifier de nouvelles variantes. Le séquençage sanger est également exigeant en main-d’œuvre et n’est pas à haut débit. Par rapport au séquençage Sanger, NGS n’a pas les mêmes limitations de faible sensibilité, de puissance de découverte et de débit. Un autre avantage du NGS est sa capacité à détecter une variété de mutations allant du polymorphisme mononucléotidique (SNP) aux réarrangements. Cependant, le NGS est une méthode plus coûteuse et plus longue dans l’application de la détermination des indels associés à Cas9 / ARNg, car il n’y a qu’une seule région cible d’intérêt et elle convient mieux aux analyses à plus grande échelle du génome. Par rapport aux méthodes susmentionnées, ddPCR est à haut débit et a un temps d’exécution rapide. Si les matériaux et instruments ddPCR sont disponibles en interne, 96 échantillons peuvent être traités en 1 à 2 jours, ce qui le rend bien adapté à l’analyse rapide d’essais à grande échelle d’organismes modifiés par Cas9 / ARNg.

Bien que de nombreux avantages existent pour la ddPCR, il existe également des limites. Tout d’abord, l’équipement ddPCR n’est pas fréquemment disponible dans un environnement de laboratoire indépendant. L’équipement ddPCR peut être disponible en commun dans les grands établissements de recherche, mais cela ne facilite pas la génération et l’analyse des données à l’extérieur de l’établissement. Deuxièmement, contrairement aux alternatives, la ddPCR ne fournit pas les séquences uniques individuelles de mutations indel identifiées. La PCR par gouttelettes numériques fournira la fréquence des mutations indel au sein d’une population, mais sans la séquence, on ne peut pas déterminer si les indels présents sont plus susceptibles de conserver ou d’inhiber la fonction du gène d’intérêt. La méthode ddPCR est peut-être mieux adaptée pour analyser les populations sauvages après un essai de libération sur le terrain d’un organisme d’entraînement à base de Cas9 / ARNg, car elle peut déterminer efficacement la fréquence d’introduction du transgène dans la population indigène et la génération d’indels au sein de la population en temps quasi réel. En raison du délai d’exécution rapide de la ddPCR, il serait possible d’effectuer un échantillonnage et d’analyser la population dans une région d’essai sur le terrain chaque semaine si les matériaux étaient disponibles localement. Les coûts de démarrage pour acheter, importer et mettre en place l’équipement ddPCR seraient élevés dans les laboratoires éloignés, mais les avantages de pouvoir évaluer rigoureusement une population sauvage alors qu’elle subit des modifications à partir d’un système d’entraînement justifieraient les coûts.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863024
DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit)	Promega	A1120
EDTA (pH 8.0)	Invitrogen	AM9260G
Ethanol, 200 Proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
Isopropanol (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	A416-500
Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit)	Promega	A1120
PCR-grade Water			Any certified PCR-grade water can be used
Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit)	Promega	A1120
Proteinase K 20 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	AM2546
Materials
ddPCR 96-Well Plate	Bio-Rad	12001925
Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets	Bio-Rad	1864007
Droplet Generation Oil for probes	Bio-Rad	1863005
Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes)	Sigma-Aldrich	N/A	Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.
Forward and Reverse oligonucleotide primers	Sigma-Aldrich	N/A	Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available.
Equipment
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1851148	Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well