Caractérisation unicellulaire de l’afflux de calcium et de l’infection par le VIH-1 à l’aide d’une plateforme optofluidique multiparamètres

Résumé

Ici, nous présentons un protocole dans lequel les cellules individuelles sont surveillées pour les événements aigus et l’infection productive par le VIH-1 sur un dispositif nanofluidique. Les données d’imagerie définissent les interactions virus-récepteur hôte et la dynamique de la voie de signalisation. Il s’agit de la première méthode de culture et d’imagerie unicellulaires longitudinales nanofluidiques à haut débit pour étudier la cinétique de signalisation et les interactions moléculaires.

Résumé

Le VIH-1 provoque une infection chronique qui touche plus de 37 millions de personnes dans le monde. Les personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) éprouvent une comorbidité liée à l’inflammation chronique malgré le traitement antirétroviral. Cependant, ces signalisations inflammatoires n’ont pas été entièrement caractérisées. Le rôle des événements d’entrée précoce sur l’activation des événements de signalisation cellulaire et l’expression des gènes en aval n’a pas été capturé au niveau unicellulaire. Ici, les auteurs décrivent une méthode qui applique les principes de la microscopie à fluorescence à cellules vivantes à une plate-forme unicellulaire automatisée qui cultures et images des cellules sur des cours de temps personnalisés par l’utilisateur, permettant une analyse à haut débit des processus cellulaires dynamiques. Ce test permet de suivre la microscopie à fluorescence vivante unicellulaire des événements précoces qui suivent immédiatement l’infection par le VIH-1, notamment l’afflux de calcium qui accompagne l’exposition au virus et le développement d’une infection productive à l’aide d’un virus rapporteur fluorescent. Les cellules MT-4 sont chargées d’un colorant sensible au calcium et cultivées dans des enclos isolés sur un dispositif nanofluidique. Les cellules cultivées sont infectées par un virus rapporteur du VIH-1 (NLCI VIH-1). Un microscope à fluorescence placé au-dessus du dispositif nanofluidique mesure l’afflux de calcium sur une trajectoire de temps de 8 minutes après une exposition aiguë au VIH-1. L’infection productive par le VIH-1 est mesurée dans ces mêmes cellules sur une période de 4 jours. Les données d’imagerie de ces cours de temps sont analysées pour définir les interactions virus-récepteur hôte et la dynamique de la voie de signalisation. Les auteurs présentent une alternative intégrée et évolutive aux méthodes d’imagerie traditionnelles à l’aide d’une nouvelle plate-forme optofluidique capable de trier, de culture, d’imagerie et d’automatisation logicielle unicellulaires. Ce test peut mesurer la cinétique des événements dans diverses conditions, y compris le type de cellule, l’agoniste ou l’effet antagoniste, tout en mesurant un éventail de paramètres. Il s’agit de la première méthode établie pour la culture et l’imagerie unicellulaires longitudinales nanofluidiques à haut débit : cette technique peut être largement adaptée pour étudier la cinétique de signalisation cellulaire et les interactions moléculaires dynamiques.

Introduction

L’inflammation chronique est l’une des principales causes de morbidité précoce et de mortalité associées au VIH^1,2,3. Il existe de multiples mécanismes par lesquels le VIH peut activer la signalisation inflammatoire, et des preuves récentes suggèrent un rôle pour les récepteurs P2X dans l’entrée du VIH qui sont des récepteurs d’adénosine triphosphate (ATP)^{3,4,5,6,7,8,9,10.} Le sous-type P2X des récepteurs purinergiques (P2XR) peut être des facilitateurs importants de cette inflammation. Cependant, les mécanismes moléculaires des interactions VIH-P2XR sont largement inconnus et peuvent avoir une incidence sur les étapes précoces et tardives du cycle de vie viral du VIH-1. Il est essentiel de définir les voies et la cinétique à l’origine de l’inflammation chronique associée au VIH pour faire progresser les options de traitement pour les personnes vivant avec le VIH.

Pour évaluer si le VIH-1 angoisse directement les récepteurs P2X, l’activation du P2XR et l’infection par le VIH-1 doivent être mesurées en parallèle. Des tests d’activité P2XR et d’infection par le VIH-1 ont été établis indépendamment : l’afflux cellulaire de calcium est un indicateur de l’activation du P2XR, et l’infection productive par le VIH-1 peut être quantifiée par l’abondance de l’ARN. La détection de fluorescence de l’afflux de calcium est possible avec le colorant sensible au calcium Fluo-4, et l’infection par le VIH-1 peut être visualisée avec le virus rapporteur fluorescent mCherry HIV-NLCI^{11,12,13,14,15.}

Étant donné que ces indicateurs d’activation du P2X (afflux cellulaire aigu de calcium) et d’infection par le VIH-1 (synthèse de l’ARN du VIH-1) se produisent sur différentes échelles de temps (minutes par rapport aux jours), il manque une méthode à haut débit qui permet une analyse appariée de l’activation du P2XR et de l’infection par le VIH-1. Les techniques expérimentales standard à haut débit, telles que la cytométrie en flux, permettent l’analyse de la population, mais ne peuvent pas évaluer la relation entre les événements aigus et longitudinaux dans les cellules individuelles. Alternativement, l’imagerie unicellulaire avec microscopie à fluorescence standard est à faible débit. Ces limites expérimentales présentent un besoin de nouvelles techniques à haut débit pour mesurer directement les associations entre les événements cellulaires aigus et longitudinaux.

Un système optofluidique décrit est une nouvelle plate-forme capable de tri et d’isolation unicellulaires, de culture, d’imagerie et d’automatisation logicielle^16,17,18,19. Ce système présente une alternative intégrée et à haut débit aux limites des méthodes d’imagerie traditionnelles. La plate-forme Beacon se compose d’un incubateur de dioxyde de carbone (CO₂₎et à température contrôlée qui prend en charge les cellules contenues dans une puce. La puce possède des transistors photosensibles qui génèrent un gradient électrique en réponse à la lumière ciblée. Cette force dielectrophorétique résultante est utilisée pour déplacer des cellules individuelles à travers la puce nanofluidique vers les régions souhaitées. Les cellules sont triées dans des stylos sur la puce, qui constituent une barrière pour isoler physiquement les cellules individuelles. Le flux laminaire continu des milieux de croissance à travers la puce empêche la migration cellulaire des stylos tout en permettant la diffusion de petites particules de nutriments et de réactifs spécifiques à l’expérience. Un microscope à fluorescence se trouve au-dessus de la puce. L’automatisation logicielle est utilisée pour capturer des images de la puce au point de temps spécifié par l’utilisateur.

Toute la caractérisation de cellules a été exécutée utilisant un système optofluidic pour la sélection et la manipulation de simple-cellule. Ce système se compose de composants mécaniques, microfluidiques et optiques intégrés qui permettent la manipulation, le dosage, la culture et l’imagerie unicellulaires. Les cellules sont chargées et cultivées sur le dispositif nanofluidique jetable composé de 3 500 chambres individuelles (stylos), chacune capable de contenir un volume sub-nanolittre. Les cellules peuvent être positionnées dans des enclos à l’aide de « cages » dielectrophorétiques induites par la lumière et cultivées dans des conditions contrôlées par la température et le CO_2. La microfluidique permet la perfusion de milieux ou de tampons sur la puce pour la culture cellulaire ou le traitement médicamenteux. Une aiguille actionnée permet l’importation et l’exportation de cellules à partir de plaques de puits incubées et obturées. La zone de la puce peut être iluminée à un grossissement 4x ou 10x dans des canaux lumineux et fluorescents (y compris DAPI, FITC, TRed ou Cy5) pour caractériser les phénotypes cellulaires ou l’analyse fonctionnelle. L’ensemble du système est automatisé à l’aide d’un logiciel qui peut être utilisé pour des flux de travail prédéfinis ou des expériences personnalisées.

Des relations entre l’infection par le VIH-1 et le P2XR ont été étudiées, mais aucune procédure à haut débit n’a été signalée pour caractériser directement ces interactions en parallèle. Ici, les auteurs décrivent une méthodologie pour étudier les interactions VIH-P2XR en suivant l’afflux aigu de calcium et l’infection productive subséquente au VIH-1 au niveau unicellulaire. Il s’agit notamment d’un nouvel outil qui permet une mesure longitudinale directe et à haut débit de plusieurs cibles dans des cellules individuelles.

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Protocole

1. Préparation des cellules pour l’imagerie

1. Préparer une solution fraîche de chargement fluo-4 AM : Ajouter 25 μL de solvant détergent concentré 100x, puis ajouter 2,5 μL de Fluo-4 AM 1000x à un tube de 1,5 mL. Vortex à mélanger.
2. Pipeter 2,5 mL de milieu de culture dans la solution de chargement et inverser pour mélanger. Protéger de la lumière.
3. Centrifuger 2 x 10⁶ cellules MT-4 à 500 x g pendant 3 min.
4. Retirer le milieu et ressusciter la pastille dans 2 mL de la solution de chargement fluo-4 AM préparée. Protéger de la lumière.
5. Pipette remettait les cellules dans une boîte de Pétri de 35 mm. Incuber à 37 °C pendant 15-30 min, puis incuber pendant 15-30 min supplémentaires à température ambiante.
6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 3 min et éliminer le surnageant constitué par la solution de chargement.
7. Ressusciter le culot cellulaire par pipetage dans 1 mL du milieu de culture et centrifuger à 500 x g pendant 3 min pour laver.
8. Ressusciter le culot cellulaire par pipetage dans le milieu de culture à une concentration de 2 x 10⁶ cellules/mL (minimum 50 μL). Protéger de la lumière.

2. Préparation du système optofluidique, chargement des cellules et penning des cellules

1. Préparez une puce avec la solution mouillante, ce qui facilite l’enclos des cellules.
   1. Pour ce faire, chargez des tubes centrifuges contenant 2 mL de solution mouillante et 50 mL d’eau DI sur l’instrument avec une nouvelle puce optofluidique et exécutez la fonction Wet Chip. Cette fonction va automatiquement inonder la puce avec la solution mouillante à travers la fluidique du système, incuber la puce à 50, °C et rincer la puce avec de l’eau 3 fois.
   2. Une fois le rinçage à l’eau terminé, rincez la puce avec 3 cycles de 250 μL de milieu de culture.
2. Compléter la suspension cellulaire de l’étape 1.8 avec un soluté détergent F-127 1:100 avant le chargement pour réduire la probabilité que les cellules collent aux canaux de la puce.
3. Utilisez l’aiguille d’exportation de l’instrument pour importer des cellules à partir d’un tube de centrifugation de 1,5 mL à l’aide de l’opération de charge et de l’importation à petit volume pour un volume d’emballage de cellules de 5 μL.
4. Cellules de stylo utilisant une tension de positionnement optoélectronique (OEP) optimisée de 4,3 V et une vitesse de cage de 5 μm/s. Penning se produit à l’aide de OEP. Accomplissez la penning à l’aide de la fonction Autopen, qui détectera automatiquement les cellules individuelles, les entourera d’une cage OEP et les déplacera dans un stylet à proximité. Si les cellules d’intérêt restent après la saisie automatique, utilisez la fonction Stylet manuel pour sélectionner les cellules cibles (avec un clic de souris) et un stylet de destination (avec un clic de souris ultérieur).
5. Une fois la penning terminée (soit lorsque la fonction Autopen est terminée, soit lorsque le nombre souhaité de cellules pennées a été atteint), videz la puce avec 3 cycles de 250 μL de milieu de culture pour éliminer toute cellule nonpenned restante de la puce.

3. Infection unicellulaire et imagerie fonctionnelle

1. Après avoir penning des cellules, obtenir des images fluorescentes des cellules dans fitc, Texas Red, et DAPI canaux pour mesurer la ligne de base Fluo-4, mCherry, et autofluorescence.
2. Infuser le VIH-1 dans la micropuce à une concentration de 13 ng de VIH-1 NL-CI par 2 x 10⁶ cellules en canalisant lentement la suspension dans la puce à travers l’aiguille d’exportation.
3. Immédiatement après l’ajout du VIH-1, obtenez à plusieurs reprises des images dans les canaux FITC et DAPI sur une durée de 10 minutes.
4. Obtenez des images dans les canaux Texas Red et DAPI à 1, 2, 3 et 4 jours après l’infection (DPI).

4. Analyse des données d’imagerie fonctionnelle unicellulaire avec le logiciel FIJI

1. À chaque point temporel de chaque canal d’imagerie d’intérêt, utilisez l’outil FIJI Point Selection et la fonction Measure pour mesurer les signaux Fluo-4, mCherry et autofluorescence de chaque cellule. Mesurer simultanément la fluorescence de fond en calculant l’intensité de fluorescence moyenne (IFM) du stylo et de la puce contenant chaque cellule.
2. Contrôlez la fluorescence et l’autofluorescence de fond à l’aide de la fonction Measure pour rechercher l’IMF dans une sélection de région et en soustrayant cette valeur de la valeur de fluorescence cellulaire.
3. Normaliser la fluorescence de fond de chaque image de puce: Mesurer l’IMF de la puce dans chaque champ. Ensuite, soustrayez l’IFM de la puce avec la fluorescence de fond la plus faible de toutes les autres mesures de l’IFM de la puce.
4. Normaliser la fluorescence de fond de chaque stylo contenant des cellules : mesurez l’IFM du stylo de chaque cellule dans chaque champ de vision. Soustrayez ensuite cette valeur de l’IFM brute de la cellule pour chaque champ.
5. Contrôle de l’autofluorescence cellulaire: Soustrayez le jour 0 et le jour 4 DAPI MFI de chaque cellule du jour 0 et du jour 4 mCherry MFIs.

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Résultats

La figure 1 illustre le format de la puce et des données d’imagerie brutes acquises par le microscope à fluorescence. L’identification et le regroupement des cellules non infectées et infectées par mesure mCherry sont illustrés à la figure 2. Ces grappes sont analysées pour la cinétique d’afflux de calcium dans la figure 3, qui démontre l’afflux précoce de calcium dans les cellules infectées par le VIH.

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Discussion

La méthodologie décrite pour étudier la relation entre l’afflux de calcium et l’infection productive par le VIH-1 dans les cellules individuelles peut être adaptée pour étudier la cinétique du calcium intracellulaire en réponse à d’autres agonistes ou antagonistes d’intérêt. La préparation des cellules pour l’imagerie est simple, peu chronophage, et les réactifs sont disponibles dans des kits pratiques de fabricants largement utilisés. La mesure du calcium à base de fluo-4 est bien décrite dans ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beacon Optofluidic System	Berkeley Lights
Fetal Bovine Serum	Gibco
FIJI	Open-source software	PMID: 22743772, 22930834
Fluo-4 Calcium Imaging Kit	Thermo Fisher	F10489
HIV-1 NLCINL4-3	Laboratory of Benjamin Chen	PMID: 28148796
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010
MT-4 cells	NIH AIDS Reagent		ARP-120
OptoSelect 3500 chip	Berkeley Lights
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS
Prism 9.0.0	GraphPad
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E
Tissue Culture Hood	Various models
T75 flasks	Corning	3073