Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3

Résumé

Nous décrivons ici l’établissement et l’application d’une ligne de rapporteur de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (appelée αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous) pour l’évaluation de la reprogrammation cardiaque. Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) isolés de la souche de souris sont convertis en cardiomyocytes induits (iMC), ce qui permet une évaluation pratique et efficace de l’efficacité de la reprogrammation et de la maturation fonctionnelle des iMC via un flux de calcium (^Ca2+).

Résumé

La reprogrammation cardiaque est devenue une thérapie potentiellement prometteuse pour réparer un cœur endommagé. En introduisant plusieurs facteurs de transcription, y compris Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), les fibroblastes peuvent être reprogrammés en cardiomyocytes induits (iCM). Ces iMC, lorsqu’ils sont générés in situ dans un cœur infarctus, s’intègrent électriquement et mécaniquement au myocarde environnant, entraînant une réduction de la taille des cicatrices et une amélioration de la fonction cardiaque. En raison de l’efficacité, de la pureté et de la qualité relativement faibles de la reprogrammation des iMC, la caractérisation des iMC reste un défi. Les méthodes actuellement utilisées dans ce domaine, y compris la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et la qPCR, se concentrent principalement sur l’expression des gènes et des protéines spécifiques au cœur, mais pas sur la maturation fonctionnelle des iCM. Déclenchée par des potentiels d’action, l’ouverture de canaux calciques voltage-dépendants dans les cardiomyocytes entraîne un afflux rapide de calcium dans la cellule. Par conséquent, quantifier le taux d’afflux de calcium est une méthode prometteuse pour évaluer la fonction cardiomyocytaire. Ici, le protocole introduit une méthode pour évaluer la fonction iCM par flux de calcium (^Ca2+). Une souche de souris αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a été établie en croisant des souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (appelée Myh6-Cre ci-dessous) avec des souris Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (appelées Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous). Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) de souris néonatales P0-P2 ont été isolés et cultivés in vitro, et une construction polycistronique de MGT a été introduite dans les NCF, ce qui a conduit à leur reprogrammation en iCM. Étant donné que seuls les iCM reprogrammés avec succès exprimeront le rapporteur GCaMP3, la maturation fonctionnelle des iCM peut être évaluée visuellement par flux ^Ca2+ avec microscopie à fluorescence. Par rapport aux NCF non reprogrammés, les NCF-iCM ont montré un flux transitoire de calcium significatif et une contraction spontanée, similaires aux CM. Ce protocole décrit en détail l’établissement de la souche de souris, l’isolement et la sélection des cœurs de souris néonatales, l’isolement NCF, la production de rétrovirus pour la reprogrammation cardiaque, l’induction iCM, l’évaluation du flux iCM ^Ca2+ à l’aide de notre ligne de rapporteurs, ainsi que l’analyse statistique et la présentation des données connexes. On s’attend à ce que les méthodes décrites ici fournissent une plate-forme précieuse pour évaluer la maturation fonctionnelle des iCM pour les études de reprogrammation cardiaque.

Introduction

L’infarctus du myocarde (IM) est une maladie grave dans le monde entier. Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde et représentent environ 18,6 millions de décès en 20191,2. La mortalité totale des MCV a diminué au cours du dernier demi-siècle. Cependant, cette tendance a été ralentie, voire inversée, dans certains pays sous-développés1, ce qui nécessite des traitements plus efficaces des MCV. En tant que l’une des manifestations mortelles des MCV, l’IM représente environ la moitié de tous les décès attribués aux MCV aux États-Unis2. Au cours de l’ischémie, avec le blocage des artères coronaires et un apport limité en nutriments et en oxygène, le myocarde subit de graves changements métaboliques, altère la fonction systolique des cardiomyocytes (CM) et entraîne la mort de ^cm3. De nombreuses approches dans la recherche cardiovasculaire ont été explorées pour réparer les lésions cardiaques et restaurer la fonction du cœur ^blessé4. La reprogrammation cardiaque directe est apparue comme une stratégie prometteuse pour réparer le cœur endommagé et restaurer sa ^fonction5,6. En introduisant Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), les fibroblastes peuvent être reprogrammés en iCM in vitro et in vivo, et ces iCM peuvent réduire la zone cicatricielle et améliorer la fonction ^cardiaque7,8.

Bien que la reprogrammation cardiaque soit une stratégie prometteuse pour le traitement de l’IM, il reste un certain nombre de défis. Tout d’abord, l’efficacité, la pureté et la qualité de la reprogrammation ne sont pas toujours aussi élevées que prévu. L’incitation MGT ne peut atteindre que 8,4 % (cTnT+) ou 24,7 % (αMHC-GFP+) du total des FC à reprogrammer en iCM in vitro7, ou jusqu’à 35 % in ^vivo8, ce qui limite son application. Même avec plus de facteurs induits dans le système, tels que ^Hand29 ou Akt1 / ^PKB10, l’efficacité de la reprogrammation est encore à peine satisfaisante pour être utilisée en milieu clinique. Ainsi, d’autres études axées sur l’amélioration de l’efficacité de la reprogrammation sont nécessaires dans ce domaine. Deuxièmement, les caractéristiques d’intégrité électrique et de contraction des iCM sont importantes pour l’amélioration efficace de la fonction cardiaque, mais elles sont difficiles à évaluer. Actuellement, les méthodes d’évaluation largement utilisées dans le domaine, y compris la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et la qPCR de l’expression de certains gènes clés des MC, sont toutes axées sur la similitude des iCM et des MC, mais ne sont pas directement liées aux caractéristiques fonctionnelles des iCM. En outre, ces méthodes ont des procédures relativement compliquées et prennent beaucoup de temps. Alors que les études de reprogrammation impliquent généralement un dépistage des facteurs de reprogrammation potentiels qui favorisent la maturation des ^iCM11, la reprogrammation cardiaque nécessite une méthode rapide et pratique basée sur la fonction iCM.

Les CM ouvrent les canaux ioniques calcium voltage-dépendants sur la cytomembrane au cours de chaque cycle de contraction, ce qui conduit à un afflux transitoire d’ions calcium (^Ca2+) du liquide intercellulaire vers le cytoplasme pour participer à la contraction du myofilament. Un tel cycle d’afflux et d’outflux de ^Ca2+ est le trait fondamental de la contraction myocardique et constitue la fonction normale des ^CM12. Ainsi, une méthode qui détecte l’afflux de ^Ca2+ pourrait être un moyen potentiel de mesurer la fonction des CM et des cellules de type CM, y compris les iCM. De plus, pour les iCM, une telle méthode offre un autre moyen d’évaluer l’efficacité de la reprogrammation.

Des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI) ont été développés et largement utilisés pour indiquer les activités cellulaires, en particulier les potentiels d’action. Généralement, les GECI se composent d’un domaine de liaison ^Ca2+ tel que la calmoduline, et d’un domaine fluorescent tel que GFP, et GCaMP3 est un domaine avec une affinité et une intensité de fluorescence élevées. Le domaine de fluorescence de GCaMP3 sera activé lorsque la concentration locale de calcium est ^modifiée13. Dans cet article, une souche de souris qui exprime spécifiquement un rapporteur GCaMP3 dans les cellules Myh6+ est décrite. En introduisant le MGT dans les NCF isolés des nouveau-nés de cette souche, la reprogrammation peut être surveillée par fluorescence, que les iCM reprogrammés avec succès présenteront. Une telle souche de souris et une telle méthode fourniront une plate-forme précieuse pour étudier la reprogrammation cardiaque.

Protocole

Toutes les procédures et pratiques expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Toutes les procédures et pratiques expérimentales impliquant la culture cellulaire doivent être effectuées BSL2 Biological Safety Cabinet dans des conditions stériles. Pour les procédures et les pratiques impliquant des virus, la ligne directrice sur l’élimination appropriée des cellules transfectées, des embouts de pipette et des tubes afin d’éviter le risque de dangers pour l’environnement et la santé a été suivie.

1. Établissement d’une souche de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38^{(CAG-GCaMP3)Hze} /J (appelée Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) (Figure 1)

1. Préparez respectivement la souche de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (009074 de laboratoire Jackson, appelée Myh6-Cre) et Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Souche de souris Hze}/J (014538 de laboratoire Jackson, appelée Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3).
2. Reproduisez chaque souche jusqu’à 8 semaines pour obtenir des souris adultes Myh6-Cre et Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, respectivement.
3. Croisez les souris adultes Myh6-Cre et Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
   REMARQUE: Configurez Myh6-Cre mâle / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 femelle ou vice versa. Il n’y a pas de différence significative entre leurs descendants. En règle générale, les souris femelles donneront naissance à 8 à 10 petits 19 à 21 jours après le croisement.

2. Isolement et sélection des cœurs de souris néonatales Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.

1. Obtenez des chiots P0-P2. Assurez-vous que 8 à 10 petits sont présents pour isoler 10 millions de NCF avec ce protocole.
2. Anesthésie profonde des chiots par hypothermie. Placez les chiots dans un gant en latex et immergez-les jusqu’au cou dans de la glace pilée et de l’eau (2 °C - 3 °C).
3. Désinfectez brièvement les chiots avec de l’éthanol à 75%.
4. Sacrifiez les chiots par décapitation avec des ciseaux stériles.
5. Faites une incision horizontale près du cœur, pressez le cœur, puis isolez-le en le séparant à la racine de l’aorte avec des ciseaux.
6. Observez le cœur battre sous un microscope à fluorescence. Assurez-vous que les cœurs avec le génotype Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 montrent un flux de ^Ca2+ indiqué par GCaMP3 avec des battements cardiaques. Les autres génotypes ne montrent pas de fluorescence (Figure 2, Vidéo 1 et Vidéo 2).

3. Isolement des fibroblastes cardiaques néonatals (NCF)

REMARQUE: Pour cette partie, le protocole du ^Lab14 du Dr Li Qian a été adopté avec des optimisations mineures lorsqu’elles sont applicables à cette étude.

1. Après avoir isolé les cœurs αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, coupez-les en quatre morceaux qui sont faiblement connectés. Lavez-les dans du DPBS glacé dans une plaque de 6 cm à fond plusieurs fois pour limiter la pollution des cellules sanguines dans les cellules isolées.
2. Transférer les cœurs dans un tube conique de 15 mL.
3. Digérer les cœurs avec 8 mL de trypsine-EDTA chaude à 0,25 % à 37 °C pendant 10 min.
4. Jeter le surnageant de trypsine et ajouter 5 mL de collagénase chaude de type II (0,5 mg/mL) dans HBSS.
5. Bien tourbillonner le mélange et incuber à 37 °C pendant 5 min.
6. Après l’incubation, vortexez abondamment et laissez le tissu non digéré se déposer par gravité.
7. Recueillir le surnageant dans un tube conique de 15 mL avec un milieu de fibroblaste froid (FB) de 5 mL (IMDM avec 20% FBS et 1% de pénicilline / streptomycine).
8. Répétez les étapes 3.4-3.7 pour le tissu non digéré 4-5 fois.
9. Rassemblez tous les surnageants et filtrez-les avec une passoire de 40 μm.
10. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
11. Remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement (tampon MACS; 1x PBS avec 2 mM EDTA et 0,5% BSA).
12. Déterminez le nombre de cellules viables en colorant le bleu trypan.
    1. Prélever 10 μL de cellules de 10 mL de suspension cellulaire à l’étape 3.11.
    2. Mélanger avec 10 μL de solution de bleu de trypan à 0,4% et incuber pendant 5 min à température ambiante.
    3. Ajouter le mélange à un hémocytomètre et déterminer le nombre de cellules viables. Les cellules mortes sont colorées en bleu, tandis que les cellules viables ne sont pas colorées.
13. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le surnageant.
14. Remettre en suspension les cellules avec 10 μL de microbilles thy1,2 dans 90 μL de tampon MACS réfrigéré pour moins de 10 millions de cellules viables. Ajoutez plus de perles proportionnellement s’il y a plus de 10 millions de cellules viables. Bien pipeter le mélange et incuber à 4 °C pendant 30-60 min.
15. Ajouter 10 mL de tampon MACS et bien mélanger.
16. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min, jeter le surnageant.
17. Répétez les étapes 3.15 à 3.16 une fois.
18. Remettre en suspension les cellules et les billes avec 2 mL de tampon MACS.
19. Installez un séparateur MACS dans le capot. Insérez une colonne LS dans le séparateur et équilibrez la colonne avec 3 mL de tampon MACS.
20. Lorsque la colonne LS est équilibrée, passez les cellules à travers la colonne.
21. Lavez la colonne LS avec 2 mL de tampon MACS trois fois.
22. Retirez la colonne du séparateur, éluez-la avec 2 mL de tampon MACS trois fois, puis collectez l’élution dans un tube de 50 mL.
23. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
24. Remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu FB.
25. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
26. Diluer les cellules avec des milieux FB et ensemencer les cellules dans des plats ou des assiettes comme vous le souhaitez. Assurez-vous que la densité d’ensemencement cellulaire est d’environ 2-2,5 x ¹⁰⁴ cellules / ^cm2 (optimisez la densité en fonction d’expériences individuelles). Assurez-vous que les fibroblastes attachés ont une forme ovale à ronde le deuxième jour après l’ensemencement (Figure 3).

4. Production d’un vecteur MGT polycistronique codant pour rétrovirus pour la reprogrammation cardiaque

1. Maintenir Plat-E avec des milieux de culture Plat-E (DMEM complété par 10 % de FBS, 1 μg/mL de puromycine et 10 μg/mL de blasticidine) à 37 °C avec 5 % de _CO2.
2. Le jour 1, divisez Plat-E en une plaque de 6 puits à environ 4-5 x ¹⁰⁵ cellules / densité de puits.
3. Le jour 2, Plat-E atteint généralement 80% de confluence. Transfectez les cellules avec les procédures suivantes. Ajustez le volume et la quantité de chaque élément présent ici en fonction de chaque puits dans une plaque de 6 puits.
   1. Diluer 2 μg de vecteur plasmidique d’expression rétrovirique polycistronique pMX-puro-MGT (Addgene 111809) à 500 ng/μL avec un tampon TE.
   2. Préparer le mélange de transfection en mélangeant 10 μL de lipofectamine avec 150 μL de milieu sérique réduit. Pipeter soigneusement pour bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Veillez à éviter les bulles lors du pipetage.
   3. Pendant ce temps, préparez un mélange de plasmides en mélangeant le plasmide avec 150 μL de milieu sérique réduit. Pipeter soigneusement pour bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Veillez à éviter les bulles lors du pipetage.
   4. Mélanger soigneusement les deux mélanges et incuber à température ambiante pendant 5 min. La solution peut sembler trouble.
   5. Ajouter le mélange goutte à goutte aux cellules à transfecter.
   6. Incuber les cellules à 37 °C pendant la nuit.
4. Le jour 3, remplacez le milieu par un milieu de culture cellulaire complet frais dépourvu de puromycine et de blasticidine.
5. Le jour 4, 48 h après la transfection, prélever le surnageant qui contient le rétrovirus et le stocker à 4 °C.
6. Le jour 5, 72 h après la transfection, prélever le surnageant qui contient le rétrovirus.
7. Filtrer à la fois le surnageant de 48 h et de 72 h avec un filtre de 0,45 μm, précipiter pendant la nuit à 4 °C en ajoutant 1/5 volume de solution de poly (éthylène glycol) (PEG) à 40 % pour obtenir une concentration finale de 8 % de PEG.
8. Centrifuger à 4 000 x g pendant 30 min pour précipiter le virus.
   REMARQUE: Le virus PEG8000 forme de petites précipitations blanches.
9. Remettre le virus en suspension avec un milieu iCM contenant 8 μg/mL de polybrene comme vous le souhaitez. Utilisez le rétrovirus immédiatement.

5. Reprogrammation des NCF en iCM avec une infection à rétrovirus codant pour MGT

1. Cultiver ou passer des NCF avant l’infection virale.
   REMARQUE: Habituellement, NCF peut être passé deux fois.
2. Le jour 0, ensemencez le NCF à la densité d’environ 1-2 x ¹⁰⁴ cellules/^cm2 en milieu FB.
3. Le jour 1, remplacez le milieu de culture par un milieu contenant un virus pour chaque puits comme vous le souhaitez. Utilisez le virus d’un puits Plat-E dans une plaque de 6 puits pour infecter deux puits dans une plaque de 24 puits. Titrer le virus pour déterminer la concentration optimale du virus.
   REMARQUE: Des virus contenant d’autres facteurs de reprogrammation d’intérêt pourraient être introduits avec le rétrovirus MGT.
4. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
5. Le jour 2, 24 heures après l’infection virale, remplacez le milieu contenant le virus par un milieu iCM ordinaire.
6. Pour surveiller l’expression de GCaMP3, plaquez-la sous un microscope à fluorescence inversée. Sous 10x au canal GFP, observez la fluorescence basale légère GCaMP3 d’une partie des cellules dès le jour 5.
7. Remplacez le support tous les 2-3 jours pendant la reprogrammation. Si nécessaire, effectuer une sélection positive pour les cellules infectées par le rétrovirus MGT en ajoutant 2 μg/mL de puromycine au milieu de culture pendant 3 jours et en le maintenant à 1 μg/mL.
   REMARQUE : Introduire des produits chimiques d’intérêt (p. ex., IGF-1, MM589, A83-01 et PTC-209, appelés IMAP comme nous l’avons signalé ^{précédemment15}) ainsi qu’un changement moyen.
8. Après 14 jours d’infection, remplacez le milieu par un milieu B27 pour induire davantage la maturation de l’iCM.

6. Évaluation de l’efficacité de la maturation fonctionnelle et de la reprogrammation de l’iCM par flux ^Ca2+

REMARQUE: Ajouter 1 μM d’isoprotérénol aux cellules à évaluer avant l’évaluation, si nécessaire.

1. Évaluez le flux de ^Ca2+ avec un microscope à fluorescence inversée à température ambiante.
2. Dans le canal GFP, observez les cellules GCaMP3+ sous objectif 10x. Assurez-vous qu’il montre des battements de cellules spontanés dans le canal de champ lumineux.
3. Sélectionnez au hasard trois champs sous 20x et enregistrez le flux ^Ca2+ des iMC pendant 3 min pour chaque champ.
   REMARQUE: Ici, le flux ^Ca2+ a été synchronisé avec le battement spontané des cellules (Figure 4, Figure 5 et Vidéo 3, Vidéo 4, Vidéo 5, Vidéo 6, Vidéo 7, Vidéo 8).
4. Quantifiez manuellement les cellules avec un flux de ^Ca2 +.

7. Analyse statistique et présentation des données

1. Analysez les différences entre les groupes à sens unique de l’analyse de variance (ANOVA) et effectuez les tests de comparaison multiples de Student-Newman-Keuls.
   NOTE: Les résultats sont en moyenne ± S.E avec p < 0,05 considéré comme statistiquement significatif. Chaque expérience a été réalisée au moins trois fois.

Résultats

Le flux de travail expérimental pour générer la souche de souris Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 et la structure génique des souris transgéniques sont illustrés à la figure 1. Pendant que la souche de souris est établie, le cœur des chiots a été isolé et observé sous un microscope à fluorescence inverse pour confirmer le génotype. Les cœurs avec un génotype correct montrent un flux de ^Ca2+ synchronisé avec les battements, visualisé comme fluorescence GCaM...

Discussion

L’évaluation de la fonction iCM est nécessaire pour le domaine de la reprogrammation cardiaque. Dans ce manuscrit, le protocole décrit une souche de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J qui a été établie, comment utiliser les NCF isolés des souris néonatales dans cette souche pour la reprogrammation en iCM, et l’évaluation de la fonction iCM par flux ^Ca2+ . Il s’agit d’une méthode de novo pour évaluer la maturation fonctionnelle des iMC.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates	Alkali Scientific	TP9006
A83-01	Stemgent	04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X800E	Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Thermo Fisher Scientific	BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-049-101	Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2	Thermo Fisher Scientific	NC9693955
Counting Chamber	Thermo Fisher Scientific	02-671-51B	Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	11960069
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)	Thermo Fisher Scientific	04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	E478-500
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025092
IMDM media	Thermo Fisher Scientific	12440053
IX73 Inverted Microscope	Olympus	IX73P2F	Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11-668-019
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Medium 199, Earle's Salts	Thermo Fisher Scientific	11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore Sigma	SLHV033RB
MM589			Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31-985-070
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	Cell Biolabs	RV-101
pMx-puro-MGT	Addgene	111809
Poly(ethylene glycol)	Millipore Sigma	P5413-1KG	PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G
PTC-209	Sigma	SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803
Recombinant Human IGF-I	Peprotech	100-11
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
ST 16 Centrifuge Series	Thermo Fisher Scientific	75-004-381
Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22-363-547	40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes	Thermo Fisher Scientific	FB012921
TE Buffer	Thermo Fisher Scientific	12090015
Trypan Blue solution	Millipore Sigma	T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365