Une plateforme « maison » abordable et efficace pour l’étude comportementale de la drosophile , et un protocole d’accompagnement pour la respirométrie mitochondriale larvaire

Résumé

Nous fournissons des protocoles pour toute personne ayant un esprit de « culture maker » pour commencer à construire un flylab pour l’analyse quantitative d’une myriade de paramètres comportementaux chez Drosophila melanogaster, en imprimant en 3D de nombreuses pièces d’équipement nécessaires. Nous décrivons également un protocole de respirométrie à haute résolution utilisant des larves pour combiner les données comportementales et le métabolisme mitochondrial.

Résumé

L’utilité de la drosophile en tant qu’organisme modèle pour l’étude des maladies humaines, des comportements et de la biologie fondamentale est incontestable. Bien que pratique, la recherche sur la drosophile manque de popularité dans les pays en développement, peut-être en raison de l’idée erronée que la création d’un laboratoire et la réalisation d’expériences pertinentes avec des insectes aussi minuscules sont difficiles et nécessitent des appareils spécialisés et coûteux. Ici, nous décrivons comment construire un flylab abordable pour analyser quantitativement une myriade de paramètres comportementaux chez D. melanogaster, en imprimant en 3D de nombreuses pièces d’équipement nécessaires. Nous fournissons des protocoles pour construire des supports de flacons internes, des arènes de parade nuptiale, des appareils pour les tests locomoteurs, etc., à utiliser pour l’entretien général des mouches et pour effectuer des expériences comportementales en utilisant des mouches adultes et des larves. Nous fournissons également des protocoles sur la façon d’utiliser des systèmes plus sophistiqués, tels qu’un oxygraphe à haute résolution, pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondrial dans les échantillons de larves, et nous montrons son association avec les changements de comportement chez les larves lors de l’expression xénotopique de l’oxydase alternative mitochondriale (AOX). AOX augmente l’activité larvaire et la respiration des fuites mitochondriales, et accélère le développement à basse température, ce qui est compatible avec un rôle thermogénique de l’enzyme. Nous espérons que ces protocoles inciteront les chercheurs, en particulier des pays en développement, à utiliser la drosophile pour combiner facilement les données sur le comportement et le métabolisme mitochondrial, ce qui pourrait conduire à des informations sur les gènes et/ou les conditions environnementales qui pourraient également réguler la physiologie humaine et les états pathologiques.

Introduction

Drosophila melanogaster a été présentée à la communauté scientifique en tant qu’organisme modèle potentiellement puissant il y a plus de 100 ans. Ce potentiel a été fermement validé dans plusieurs domaines des sciences biologiques et biomédicales, tels que la génétique, l’évolution, la biologie du développement, la neurobiologie et la biologie moléculaire et cellulaire. En conséquence, six prix Nobel de médecine ou de physiologie ont été décernés à dix chercheurs sur la drosophile qui ont considérablement contribué à notre compréhension de l’hérédité, de la mutagénèse, de l’immunité innée, des rythmes circadiens, de l’olfaction et du développement¹. Peut-être plus important encore, D. melanogaster n’a cessé de nous fournir de nouveaux modèles de biologie humaine et de maladies, puisqu’une recherche rapide sur PubMed révèle près de 600 publications au cours des 5 dernières années, en utilisant le terme de recherche « modèle de drosophile » (², en février 2021). Aux États-Unis, où la drosophile est un organisme modèle largement répandu dans la communauté biomédicale, environ 2,2 % de toutes les bourses de recherche R01 accordées par le NIH en 2015 ont été attribuées à des chercheurs sur la drosophile ³. Au Brésil, en revanche, une recherche de projets actuellement financés sur le site web de la Fondation pour la recherche de São Paulo (FAPESP), l’agence de financement la plus importante pour la recherche dans tous les domaines scientifiques de l’État de São Paulo, n’a montré que 24 subventions et bourses avec la drosophile comme sujet principal d’étude⁴. Si l’on considère l’ensemble des 13205 projets actuellement financés par la FAPESP (⁵, en février 2021), ces 24 projets sur la drosophile représentent un ratio de moins de 0,2 % du total des projets, soit près de 12 fois inférieur à celui des NIH. Si l’on enlève les projets financés qui visent à étudier la drosophile d’un point de vue écologique et/ou évolutif, et que l’on suppose que les projets restants utilisent cet organisme comme modèle pour comprendre les processus biologiques humains en matière de santé et de maladie, ce ratio diminue à un ~0,1 %.

En fait, une enquête appropriée est nécessaire pour révéler les raisons pour lesquelles la recherche sur la drosophile au Brésil et à São Paulo ne semble pas être aussi importante en termes de nombre de projets financés. L’élevage de la drosophile n’est pas coûteux ^6,7,8 et est relativement simple, car contrairement aux vertébrés, aucune autorisation d’un comité de bioéthique n’est nécessaire pour l’expérimentation ^9,10. Une autorisation de travailler avec des lignées de mouches génétiquement modifiées est toutefois requise au Brésil¹¹, ce qui ajoute une couche de bureaucratie inhérente à tout travail impliquant des organismes génétiquement modifiés. Cependant, cela n’empêcherait probablement pas les chercheurs intéressés de lancer un flylab. Nous supposons que la désinformation sur la puissance du modèle et sur les coûts élevés attendus associés à la mise en place d’un flylab et à la réalisation d’expériences significatives sont des facteurs importants dans cette décision. Comme pour la plupart des équipements et des fournitures scientifiques, les appareils appropriés pour effectuer l’entretien général des mouches et les analyses comportementales doivent être importés au Brésil d’Amérique du Nord, d’Europe et/ou d’ailleurs, ce qui est un processus coûteux et extrêmement long^12,13.

Récemment, une alternative à l’importation d’appareils spécialisés a émergé alors que les imprimantes 3D sont devenues plus abordables et accessibles à tous, y compris aux chercheurs sur la drosophile dans les pays en développement. La technologie d’impression 3D a été largement utilisée au cours des 10 dernières années par les membres de la « culture maker », qui est basée sur l’idée d’autosuffisance plutôt que de dépendre exclusivement des produits fabriqués par l’entreprise¹⁴. Une telle idée a toujours été présente dans les laboratoires de recherche universitaires du monde entier, il n’est donc pas surprenant que les imprimantes 3D soient devenues des équipements de laboratoire standard dans de nombreux endroits^15,16. Depuis un certain nombre d’années, nous imprimons en 3D des supports de flacons de mouches, des arènes d’accouplement, des appareils d’escalade, entre autres appareils, pour une fraction du coût des équivalents de marque. La réduction des coûts d’impression et d’assemblage du matériel de laboratoire fait maison est classiquement représentée par le FlyPi, qui peut être construit pour moins de 100,00 € et sert de microscope à lumière et à fluorescence capable d’utiliser une stimulation opto- et thermogénétique sophistiquée du poisson-zèbre, de la drosophile et des nématodes génétiquement traitables¹⁵. Ici, nous fournissons une série de protocoles pour toute personne intéressée à devenir un chercheur sur la drosophile (ou à agrandir son propre flylab existant) pour imprimer en 3D de nombreux matériaux nécessaires. En investissant du temps et en développant un peu d’expertise, le lecteur pourra même optimiser les protocoles présentés ici pour imprimer des appareils mieux adaptés à ses propres besoins de recherche.

Cependant, un flylab n’est pas un lieu réservé au matériel « bon marché », surtout lorsque l’on entend associer des analyses comportementales à des phénomènes métaboliques sous-jacents. Nous nous sommes également intéressés aux rôles des mitochondries dans la modulation des modèles comportementaux de la drosophile, car ces organites sont responsables de la production massive d’ATP dans la plupart des tissus à travers plusieurs voies métaboliques dont les produits convergent vers la phosphorylation oxydative (OXPHOS). L’analyse de la consommation d’oxygène mitochondriale comme moyen de comprendre le métabolisme mitochondrial nécessite un oxygraphe, qui est un équipement plus sophistiqué qui ne peut malheureusement pas encore être imprimé en 3D. Parce qu’OXPHOS a un impact sur pratiquement tous les processus cellulaires puisqu’il dépend d’une série de réactions redox exergoniques qui se produisent dans la cellule^17,18, les taux de consommation d’oxygène basés sur le substrat oxydable fourni aux mitochondries peuvent aider à révéler si le fonctionnement de l’organite est la cause ou la conséquence d’un comportement particulier. Par conséquent, nous fournissons également ici un protocole pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondrial dans les échantillons de larves, car nous réalisons que la grande majorité des protocoles publiés sont axés sur l’analyse d’échantillons adultes. Nous montrons que les modifications de la respiration mitochondriale, induites par l’expression transgénique de la Ciona intestinalis alternative oxydase (AOX), entraînent une augmentation de la mobilité larvaire en cas de stress froid. Cela est probablement dû à la thermogenèse, car AOX est une oxydase terminale non pompeuse de protons qui peut contourner l’activité des complexes OXPHOS III ET IV (CIII et CIV), sans contribuer au potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm) et à la production d’ATP 19,20,21. Aucun insecte, y compris la drosophile, ou vertébré ne possède naturellement AOX 21,22,23, mais son expression dans une myriade de systèmes modèles 24,25,26,27,28,29 a réussi à montrer son potentiel thérapeutique pour les affections de stress respiratoire mitochondrial général, en particulier lorsqu’elles sont causées par CIII et/ou CIV surcharger. AOX confère une résistance aux niveaux toxiques d’antimycine A²⁴ et de cyanure^24,25, et atténue divers phénotypes liés au dysfonctionnement mitochondrial 24,25,30,31,32. Le fait que l’expression d’AOX modifie le comportement larvaire et la fonction mitochondriale justifie des études plus approfondies des rôles de cette enzyme dans le métabolisme et la physiologie des cellules et des tissus métazoaires^33,34.

Nous espérons qu’avec cet article, nous pourrons contribuer à sensibiliser la communauté scientifique des pays en développement tels que le Brésil sur le fait que l’utilisation de l’excellent ensemble d’outils génétiques que présente D. melanogaster , en combinaison avec des appareils faits maison efficaces et abordables pour les analyses comportementales, peut générer des données de recherche fondamentale relativement rapides sur des processus biologiques intéressants avec un impact translationnel significatif. soutenir les futures études thérapeutiques en recherche clinique. Le développement de tels idéaux communautaires profiterait grandement aux drosophes, aux chercheurs en médecine et aux sciences biologiques et biomédicales. Plus important encore, cela profiterait à la société en général, car le financement public pourrait être appliqué de manière plus translationnelle pour comprendre et traiter les maladies humaines.

Les protocoles que nous fournissons ici pour l’impression 3D des appareils d’un flylab ont été conçus pour être utilisés avec l’imprimante 3D RepRap, basée sur le modèle Prusa I3 DIY disponible à³⁵. Nous utilisons le filament d’acide polylactique blanc (PLA) de 1,75 mm (SUNLU) comme matière première pour l’impression, la plate-forme Tinkercad³⁶ pour la conception des modèles et le logiciel Repetier-Host³⁷ pour la conversion STL en G-Code, une étape nécessaire pour fournir les coordonnées à l’imprimante. Une optimisation supplémentaire des protocoles est nécessaire si le lecteur souhaite utiliser d’autres équipements, matériaux et logiciels.

Protocole

1. 3D conception du modèle

REMARQUE : Le flux de travail pour l’impression 3D comporte trois étapes de base : (1) la modélisation 3D ; (2) l’importation du modèle dans le logiciel de découpage ; et (3) la sélection du bon filament, la configuration de l’imprimante et, enfin, l’impression. Un protocole de base pour la modélisation d’un petit support/plateau de flacons de mouches est illustré ci-dessous ; Ce support doit être utilisé avec des flacons à mouches standard, qui ont environ 2,5 cm de diamètre et 9,8 cm de hauteur. Pour les nouvelles conceptions de modèles, les outils fournis par le logiciel Tinkercad permettent de manipuler facilement des structures tridimensionnelles, en créant des pièces de différentes formes, tailles et épaisseurs, selon ses propres besoins. Pour les drosophiles qui s’aventurent pour la première fois dans le domaine de l’impression 3D, suivre les protocoles ci-dessous, même avec tous leurs détails, peut encore être un défi, nous vous recommandons donc fortement de vous familiariser avec le logiciel pour de meilleurs résultats.

1. Connectez-vous à Tinkercad online³⁸ (Figure 1A). Une inscription préalable avec des informations personnelles est nécessaire pour accéder à la plateforme, gratuitement.
2. Cliquez sur Créer un nouveau projet pour commencer un nouveau design et renommez le projet en conséquence dans le coin supérieur droit de la fenêtre. Appuyez sur Entrée pour être dirigé vers le plan de travail du projet (Figure 1B).
3. Vérifiez si le plan de travail a les bonnes dimensions de 200 mm x 200 mm, en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur Modifier la grille dans le coin inférieur droit (carré rouge dans la Figure 1B). Dans la fenêtre contextuelle (Figure 1C), assurez-vous que les « Unités » sont des millimètres et que les « Préréglages » sont par défaut. Entrez 200.00 dans les champs « Largeur » et « Longueur », puis cliquez sur Mettre à jour la grille pour enregistrer les modifications.
4. Vérifiez si la grille d’accrochage est réglée sur 1,0 mm (carré rouge sur la Figure 1B). Si ce n’est pas le cas, cliquez sur le menu déroulant et sélectionnez 1,0 mm.
5. Dans le menu Formes de base à droite (carré bleu 2 dans la Figure 1B), sélectionnez une zone pleine et faites-la glisser vers le centre du plan de travail.
6. Cliquez n’importe où sur la boîte du plan de travail avec le bouton gauche de la souris pour voir ses arêtes et ses sommets. Cliquez sur n’importe quel sommet (qui deviendra alors rouge) pour afficher les dimensions de la boîte (carrés rouges sur la figure 1D). Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur chaque dimension et tapez 130 mm pour la longueur (L), 130 mm pour la largeur (L) et 40 mm pour la hauteur (H). Recentrez la boîte en la faisant glisser vers le milieu du plan de travail.
7. Cliquez sur l’outil Règle dans le coin supérieur droit de l’écran (carré rouge 1 sur la figure 1E). Cliquez immédiatement sur le sommet inférieur gauche de la boîte, comme indiqué dans la figure 1E (carré rouge 2), pour définir le point initial (x = 0, y = 0, z = 0) d’un système de coordonnées cartésiennes tridimensionnelles. Notez que la distance entre le sommet sélectionné et le point initial de la coordonnée sera maintenant affichée (carrés rouges sur la figure 1F), où « A », « B » et « C » représentent respectivement la distance aux axes x, y et z (qui devrait être nulle dans ce cas).
8. Ensuite, sélectionnez une zone vide (trou) dans le menu Formes de base à droite (carré bleu 2 dans la Figure 1B) et faites-la glisser vers le plan de travail. Définissez ses dimensions sur 30 (L) x 30 (L) x 40 (H) mm et élevez-le de 2 mm par rapport au plan de travail en tapant « 2.00 » dans la zone de texte à côté de la pointe de flèche verte dans le coin inférieur droit de la zone vide (carré rouge sur la Figure 1G). Placez la boîte vide à l’intérieur de la boîte pleine à 2 mm du point initial de la coordonnée x,y, en tapant « 2,00 » dans les zones de texte à côté des flèches vertes dans le coin inférieur gauche de la boîte (carrés rouges dans la figure 1H ; comparer avec la figure 1G).
9. Avec la case vide toujours sélectionnée, appuyez sur les touches CtrL+D du clavier pour déployer la commande « dupliquer » et créer une nouvelle boîte vide des mêmes dimensions. Placez la nouvelle zone vide à l’intérieur de la boîte pleine, à côté de la première zone vide, en tapant « 34,00 » dans la zone de texte à côté de la flèche verte le long de l’axe des y, et « 2,00 » dans les zones de texte à côté des deux flèches vertes restantes (carrés rouges sur la figure 1I).
10. Répétez cette étape, en ajustant les distances correctes à partir du point initial de coordonnées, jusqu’à ce que toute la boîte pleine soit remplie de cases vides espacées de 2 mm les unes des autres (Figure 1J).
11. Sélectionnez toutes les cases (pleines et vides) en cliquant avec le bouton gauche de la souris et en les faisant glisser sur toute la zone. Appuyez sur les touches CtrL+G du clavier pour déployer la commande « group » et créer une seule boîte avec 16 espaces vides pour les flacons de mouches (Figure 1K). Il s’agit de la conception finale du support de flacons.
12. Cliquez sur Exporter dans le coin supérieur droit de la fenêtre de Tinkercad. Dans la fenêtre qui s’affiche (Figure 1L), sélectionnez Tout dans le dessin en regard de Inclure, puis . STL sous Pour l’impression 3D comme type de fichier. Choisissez un nom approprié pour le fichier de conception et enregistrez-le à un endroit approprié sur l’ordinateur.

2. 3D impression

REMARQUE : Dans cette section, nous fournissons des instructions sur la façon d’utiliser le fichier STL créé à l’étape 1 et de le convertir en fichier G-Code contenant les instructions d’impression sur l’imprimante 3D. C’est le processus de découpage, pour lequel nous utilisons le logiciel Repetier-Host.

1. Téléchargez le fichier supplémentaire 1 et enregistrez-le à un endroit approprié de l’ordinateur. Il s’agit d’un fichier .rcp contenant les configurations d’imprimante à utiliser ci-dessous. Pour obtenir plus d’informations sur le type de fichier .rcp, veuillez consulter le^{site 39}.
2. Ouvrez le logiciel Repetier-Host, qui doit déjà être installé sur l’ordinateur, en suivant les instructions de³⁷. Appuyez sur les touches CtrL+O du clavier pour ouvrir le fichier STL sur l’ordinateur créé dans le protocole 1.
3. Une fois ouvert, cliquez sur le support de flacons prévu à cet effet et appuyez sur la touche R du clavier pour ouvrir le menu d’édition sur le côté droit de l’écran (carré rouge 1 sur la figure 2A). Centralisez l’objet sur la table d’impression en cliquant sur le bouton Centre de l’objet , indiqué par le carré rouge 2 sur la figure 2A, dans l’onglet Placement de l’objet.
4. Cliquez sur l’onglet Segment (carré rouge 1 dans la figure 2B) en regard de l’onglet Placement de l’objet , puis cliquez sur le bouton Configuration (carré rouge 2 dans la figure 2B) ci-dessous. Notez qu’une nouvelle fenêtre sur la gauche s’ouvrira où les paramètres de l’imprimante tels que la vitesse, l’épaisseur de la couche et les supports peuvent être définis (voir plus de détails dans la discussion ci-dessous).
5. Cliquez sur le bouton Importer (carré rouge 3 sur la Figure 2E), sélectionnez Fichier supplémentaire 1 dans les fichiers, puis appuyez sur Entrée. Notez que ce fichier .rcp (téléchargé à l’étape 2.1) fournit les paramètres pour la configuration automatique de l’imprimante que nous avons optimisée pour ce rack de flacons.
6. Pour terminer la configuration des paramètres d’impression, sélectionnez Aucun pour le type de support dans le menu de droite (carré rouge 4 sur la figure 2E), car l’impression de cette pièce ne nécessite pas de support pour éviter la flexion ou d’autres déformations. Dans Densité de remplissage (carré rouge 5 sur la figure 2E), choisissez 20 % pour créer une structure solide (voir plus de détails sur ces paramètres dans la discussion ci-dessous).
7. Cliquez sur Slice with CuraEngine dans le coin supérieur droit de l’écran pour exécuter le programme de découpage et générer le G-Code, qui contient les informations nécessaires à l’imprimante pour imprimer la pièce. Notez que sous l’onglet Aperçu avant impression du menu de droite (en regard de l’onglet Slicer ), des informations sur le temps et la quantité de matériau nécessaires à la réalisation du travail d’impression s’affichent (carré rouge 1 dans la figure 2F).
8. Cliquez sur Enregistrer pour l’impression SD pour enregistrer le fichier G-Code sur une carte SD (carré rouge 2 sur la Figure 2F). Notez que le G-Code contient les coordonnées 3D de la pièce conçue, découpées en couches, pour le bon fonctionnement de l’imprimante.
9. Insérez la carte SD dans l’imprimante 3D RepRap, puis suivez les informations affichées sur l’écran de l’imprimante pour sélectionner l’impression à partir de la carte SD.
10. Sélectionnez le fichier G-Code du support de flacons. Notez que l’imprimante se réchauffera automatiquement et commencera à imprimer la pièce conçue, ce qui devrait prendre plusieurs heures. Le rack (Figure 3A) doit être prêt à l’emploi immédiatement après la fin du travail d’impression.

3. Appareils d’analyse comportementale

REMARQUE : Les étapes décrites dans les protocoles 1 et 2 peuvent être répétées avec les ajustements appropriés pour imprimer plusieurs des pièces d’équipement de laboratoire nécessaires. Cependant, nous sommes conscients que la conception de nouvelles pièces peut être difficile et prendre du temps pour les utilisateurs débutants de Tinkercad, donc au lieu de fournir des protocoles étape par étape sur la façon de concevoir tous les modèles, nous mettons à disposition en téléchargement plusieurs modèles de conception que nous avons créés sous forme de fichiers STL (voir Fichiers supplémentaires 2-11).

1. Téléchargez le fichier supplémentaire 2 pour un modèle de petit entonnoir (figure 3B), couramment utilisé dans les laboratoires anti-mouches pour aider à transférer les mouches adultes vers de nouveaux flacons ou bouteilles en évitant que les mouches ne rampent le long des parois intérieures de ces contenants pour s’échapper.
2. Téléchargez le fichier supplémentaire 3 pour un support de tapis de tapotement (figure 3C), qui peut contenir une mousse d’éthylène-acétate de vinyle ou un tapis de coton épais sur lequel des flacons ou des bouteilles en verre peuvent être tapotés lorsque l’on renverse des mouches dans de nouveaux récipients contenant des aliments fraîchement préparés.
3. Téléchargez le fichier supplémentaire 4 et le fichier supplémentaire 5 pour le modèle de support de caméra que nous avons nommé Stalker (Figure 3D).
   REMARQUE : L’appareil permet de positionner n’importe quelle caméra (professionnelle, webcams, téléphones portables, etc.) au-dessus d’une base où une boîte de Pétri contenant des larves ou des mouches adultes peut être imagée ou enregistrée sur vidéo. Stalker permet l’imagerie du comportement animal qui se déroule horizontalement, toujours à la même distance de la boîte de Pétri, ce qui évite d’introduire de la variabilité dans les mesures expérimentales si les enregistrements doivent être effectués à des jours différents, par exemple, ou si la caméra doit être utilisée à d’autres fins entre les enregistrements. L’appareil est modulaire et peut être facilement assemblé après l’impression de la base et du dessus du fichier supplémentaire 4, et des côtés du fichier supplémentaire 5. Les carrés de^{1 cm 2} à la base, qui peuvent être mis en évidence à l’aide d’un marqueur permanent, aident à suivre la distance parcourue par chaque animal. Imprimez l’appareil (au moins la base) à l’aide d’un filament blanc, de sorte qu’il y ait suffisamment de contraste entre l’arrière-plan et les animaux pour que le logiciel de suivi puisse identifier chaque mouche.
4. Téléchargez le fichier supplémentaire 6 pour la conception imprimable du Fly Motel (figure 3E), qui comporte dix arènes de parade nuptiale et d’accouplement (pièces) organisées de manière à faciliter les enregistrements vidéo de dix couples d’accouplement individuels à la fois. Notez que le Fly Motel est basé sur l’appareil publié dans⁴⁰, où l’on trouve une explication détaillée de son utilisation dans des études comportementales. En plus des pièces imprimées en 3D, l’appareil nécessite 12 vis (3 x 8 mm) pour fixer la partie supérieure à la partie inférieure afin de stabiliser l’appareil assemblé, une plaque acrylique (60 x 60 x 3 mm) et une fermeture éclair. Parce que la structure du Fly Motel est plus complexe, nous fournissons également une vidéo d’instruction (fichier supplémentaire 7) sur la façon de l’assembler correctement, étant donné que toutes les pièces requises et un tournevis sont disponibles.
5. Téléchargez le fichier supplémentaire 8 pour le modèle d’un labyrinthe en T (Figure 3F), qui est utilisé pour les tests de mémoire utilisant des mouches adultes. Une explication détaillée de la façon dont le T-Maze est utilisé pour amener les mouches à associer des stimuli olfactifs répulsifs à leur comportement phototrope se trouve dans la publication originale⁴¹. L’appareil utilise également deux tubes coniques translucides de 15 ml, que l’on trouve couramment dans n’importe quel laboratoire et qui sont fixés aux ouvertures circulaires de 2 cm de large de chaque côté de la pièce centrale. Notez que l’impression du T-Maze nécessite un support (voir plus de détails dans la légende de la figure 2). Sélectionnez « Partout » pour le type de support (carré rouge 4 sur la Figure 2E) après avoir suivi les étapes 2.1 à 2.6 ci-dessus.
6. Téléchargez le fichier supplémentaire 9 et le fichier supplémentaire 10 pour la conception des parties imprimables de notre version de l’appareil pour les essais rapides de géotaxie négative itérative (RING) (Figure 3G), utilisé pour effectuer des essais grimpants avec des mouches adultes de plusieurs génotypes ou conditions environnementales simultanément, générant des résultats de manière plus standardisée et à plus haut débit⁴². L’appareil RING est également modulaire, et en plus des pièces imprimées en 3D, il nécessite d’autres pièces qui peuvent être facilement achetées en ligne ou dans une quincaillerie à faible coût : deux arbres rectifiés Φ8 x 300 mm, quatre roulements linéaires Φ8 mm, des élastiques (ou des morceaux de ficelle), un morceau de bois 240 x 60 x 20 mm pour la base, et huit vis à bois (8 mm) pour fixer les pièces imprimées à la base en bois. Téléchargez le fichier supplémentaire 11 pour obtenir des instructions sur la façon d’assembler l’appareil une fois que toutes les pièces sont imprimées ou achetées. Une explication détaillée de l’utilisation de l’appareil RING se trouve dans la publication originale⁴².

4. Essai de mobilité larvaire

REMARQUE : Nous avons optimisé ce protocole, basé à l’origine sur Nichols et ^al.42, pour étudier les effets de l’expression d’AOX sur le développement de la drosophile sous stress thermique. Les lignées 3xtubAOX²⁵ et w¹¹¹⁸, utilisées comme exemples de larves exprimant l’AOX et de larves témoins, respectivement, ont été cultivées avec un régime standard²⁴ à 12 °C, selon Saari et ^al.34. Nous recommandons ce protocole pour analyser la mobilité d’échantillons larvaires de toute condition génétique, cultivés dans n’importe quelle condition environnementale d’intérêt.

1. Préparez des plaques de gélose à 2 % en faisant bouillir la quantité équivalente de gélose dans de l’eau désionisée, en la versant dans des boîtes de Pétri Φ90 X 15 mm et en les laissant se solidifier à température ambiante. Pour les assiettes d’un volume final de 20 ml chacune, utiliser 0,4 g d’agar.
2. Prélever soigneusement les larves de L3 errantes sur le côté des flacons/flacons de culture à l’aide d’une paire de pinces à bout rond ou d’une brosse, et placer les individus dans une boîte de Pétri Φ90 x 15 mm avec de l’eau déminéralisée pendant moins de 10 secondes pour rincer les particules de nourriture attachées à leur corps.
3. Transférez les larves individuelles dans des plats avec de l’agarose et attendez 5 minutes que les animaux s’acclimatent.
4. Placez les plats contenant la larve individuelle sur un papier millimétré (grille de 0,2 cm² ) et comptez le nombre de lignes traversées par l’animal pendant 1 minute, pendant qu’il se déplace sur la gélose. Chaque ligne croisée représente une distance de 2 mm. Répétez la procédure avec le même individu 10 à 15 fois pour obtenir des répliques techniques.
5. Répéter l’étape 4.4 avec au moins 8 à 10 individus provenant de tubes/flacons différents, cultivés à des moments différents pour obtenir des réplicats biologiques de la même lignée.
6. Répétez les étapes 4.4 et 4.5 pour obtenir des données pour l’autre ligne de mouche (ou pour autant de lignes que l’on a l’intention d’analyser).
7. Les mêmes larves individuelles utilisées aux étapes 4.4 à 4.6 peuvent être utilisées pour obtenir des données supplémentaires sur les mouvements du corps en plaçant les boîtes de gélose avec une larve individuelle sous un stéréomicroscope et en comptant le nombre de contractions péristaltiques de la paroi corporelle pendant 1 minute. Obtenir des répétitions techniques et biologiques pour une estimation de la mobilité moyenne parmi les lignes de mouches analysées.
8. Appliquer le test statistique pour calculer la probabilité que les valeurs de ces paramètres de mobilité larvaire soient distinctes entre les lignes d’intérêt. Comme nous comparons ici les données de seulement deux lignes, un test t de Student peut être appliqué.

5. Respirométrie mitochondriale à l’aide d’homogénats larvaires

REMARQUE : Le protocole suivant a été optimisé pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondrial à partir d’homogénats larvaires de la lignée exprimant l’AOX3x tubAOX et du témoin w¹¹¹⁸, cultivés à 12°C, mais nous recommandons également de l’utiliser pour des échantillons larvaires de toutes conditions génétiques et environnementales. Nous sommes conscients que la réalisation de telles expériences ne devrait pas être incluse comme un objectif « abordable » pour un flylab « fait maison », contrairement à tous les autres protocoles que nous fournissons dans cet article, car un investissement initial considérable doit être fait pour qu’un laboratoire acquière un oxygraphe à haute résolution. Le protocole doit être utilisé avec l’Oxygraph-2k (O2k) et le logiciel DatLab d’Oroboros Instruments, de sorte qu’une optimisation supplémentaire est nécessaire si le lecteur souhaite utiliser un équipement alternatif.

1. Allumez l’O2k et démarrez le logiciel DatLab dans l’ordinateur connecté à l’oxygraphe. Les barres magnétiques à l’intérieur des chambres de dosage doivent commencer à s’agiter automatiquement. Retirez la solution de stockage d’éthanol des chambres.
2. Lavez les chambres au moins 3 fois avec de l’éthanol à 100 % et 3 fois avec de l’eau ultra-pure.
3. Dans DatLab, la fenêtre O2k Control s’ouvrira automatiquement. Dans Température du bloc [°C], entrez 12 °C (ou la température préférée dans la plage de 2 à 47 °C) et appuyez sur OK.
4. Une deuxième fenêtre, Modifier l’expérience, s’ouvrira alors automatiquement. Entrez les noms des échantillons dans les champs Échantillon , en fonction de ce qui sera ajouté dans les chambres A et B, et appuyez sur Enregistrer.
5. Ajouter 1800 μL du tampon de dosage (120 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 3 mM Hepes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 2 % BSA, pH 7,4) dans chaque chambre et les fermer partiellement, en permettant toujours l’échange d’oxygène avec l’air extérieur. Laissez les signaux de concentration d’oxygène et de flux d’oxygène se stabiliser, en montrant des fluctuations minimales pendant au moins 10 min. Cette étape permettra d’étalonner l’équipement avec l’air extérieur le jour de l’expérience (voir les étapes 6.3 et 6.4 ci-dessous pour plus de détails sur les étalonnages expérimentaux).
6. Au cours de l’étape de calibrage de l’air, amorcer la préparation des échantillons en prélevant soigneusement dans les tubes ou les flacons de culture 20 larves errantes du génotype approprié, à l’aide d’une paire de pinces ou d’un petit pinceau.
7. Rincez chaque larve rapidement mais abondamment avec de l’eau déminéralisée ou 1 PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na₂HPO₄ et 2 mM KH₂PO₄) et transférez-les dans un homogénéisateur en verre de 1 mL sur de la glace, contenant 500 μL de tampon d’isolement glacé (250 mM de saccharose, 5 mM de Tris HCl, 2 mM EGTA, pH 7,4)
8. Homogénéisez les larves entières en 5 coups et versez l’homogénat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL sur de la glace.
9. Ajoutez 300 μL de tampon d’isolement dans l’homogénéisateur en verre, faites macérer davantage les tissus larvaires restants en 3 passages et versez à nouveau l’homogénat dans le même tube de microcentrifugation sur de la glace.
10. Ajoutez 200 μL de tampon d’isolement dans l’homogénéisateur en verre, faites macérer davantage les tissus larvaires résiduels en 2 passages et versez à nouveau l’homogénat dans le même tube de microcentrifugation sur de la glace.
11. Mélangez l’homogénat final (~1 mL) en retournant doucement le tube deux fois et maintenez-le sur de la glace jusqu’à ce que le deuxième échantillon soit traité.
12. Répétez les étapes 5.6 à 5.11 pour obtenir l’homogénat larvaire de l’autre génotype.
13. Ouvrez les chambres d’oxygraphe A et B et transférez 200 μL de chaque homogénat dans le tampon de dosage de chaque chambre, qui doit être exactement à 12 °C à ce stade. Fermez complètement les chambres et laissez les signaux de concentration d’oxygène et de flux d’oxygène se stabiliser pendant environ 10 min.
14. Amorcer les mesures de la consommation d’oxygène en ajoutant dans chaque chambre 5 μL d’une solution de 2 M de pyruvate, 2 M de proline (concentration finale dans les chambres = 5 mM chacune) et 7,5 μL d’une solution de 0,4 M de malate (1,5 mM). Prévoyez au moins 5 minutes pour la stabilisation du signal. Notez qu’à ce stade, les mitochondries seront chargées de substrats oxydables pour initier les réactions du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA). Toute augmentation du signal de consommation d’oxygène peut être due aux fonctions des protéines de découplage (ou à d’autres phénomènes de découplage), et peut être utilisée pour calculer la respiration générale non couplée (également appelée respiration par fuite en l’absence d’adénylates, L_N- voir les résultats représentatifs pour plus de détails).
15. Ajouter dans chaque chambre 4 μL d’une solution de 0,5 M d’ADP (1 mM) et prévoir au moins 5 minutes pour la stabilisation du signal. Une augmentation significative du signal de consommation d’oxygène est généralement observée immédiatement, représentant la respiration phosphorylative oxydative (OXPHOS). La grande majorité de cette respiration d’OXPHOS est entraînée par le complexe I (CI).
16. Ajouter à chaque chambre 2 μL d’une solution d’antimycine A 0,05 M (0,05 mM) pour inhiber la CIII, et laisser au moins 5 minutes pour la stabilisation du signal. Une diminution du signal de consommation d’oxygène jusqu’aux niveaux basaux observés avant l’ajout de pyruvate, de proline et de malate doit être observée pour l’échantillon témoin w¹¹¹⁸ . La respiration mitochondriale des larves exprimant l’AOX sera partiellement résistante à l’antimycine-A, car les électrons peuvent maintenant être dirigés vers l’AOX. Environ 40 % de la respiration totale d’OXPHOS devrait rester après l’inhibition de CIII, qui devrait être entièrement soutenue par AOX.
17. Ajouter à chaque chambre 4 μL d’une solution de 0,1 M de propyl-gallate (0,2 mM) pour inhiber l’AOX, et laisser au moins 15 minutes pour la stabilisation du signal. Les niveaux de consommation d’oxygène dans les échantillons larvaires exprimant l’AOX devraient maintenant diminuer pour atteindre les niveaux basaux observés avant l’ajout de pyruvate, de proline et de malate. Cette diminution prouve que la respiration résistante à l’antimycine-A observée est due à la fonction AOX.
18. Ajouter à chaque chambre 1 μL de roténone 0,01 M (0,005 mM) pour inhiber l’IC, et laisser au moins 5 minutes pour la stabilisation du signal afin d’obtenir le signal de consommation d’oxygène de l’échantillon indépendamment de la respiration mitochondriale. Ce signal est généralement aussi faible que celui observé avant l’ajout de pyruvate, de proline et de malate.
19. Enregistrez l’expérience et fermez le logiciel DatLab.

6. Traitement des données de respirométrie mitochondriale

REMARQUE : Les valeurs de consommation d’oxygène sont obtenues en tant que moyenne des signaux de flux d’oxygène sur une période de temps déterminée et sont exprimées en pmol O₂ consommé par seconde par mg de protéines totales dans l’échantillon. Les valeurs sont d’abord comparées à la concentration maximale d’oxygène disponible dans le tampon d’essai le jour de l’expérience, sur la base de la température expérimentale (appelée saturation en air), et à la concentration minimale d’oxygène, qui est déterminée préalablement dans chaque chambre par l’ajout de Na₂S₂O₄ au tampon d’essai (voir ⁴³ pour les directives du fabricant pour obtenir un étalonnage d’oxygène zéro). Les valeurs sont également normalisées par la quantité de protéines totales dans les homogénats larvaires ajoutés au tampon de dosage de chaque chambre.

1. Déterminer la concentration totale en protéines de chaque échantillon à l’aide de la méthode de Bradford⁴⁴. Rouvrez l’expérience enregistrée sur le logiciel DatLab, appuyez sur Expérience dans le menu supérieur, puis sur Modifier. Dans la fenêtre ouverte, sélectionnez mg dans la section Unité et dans la section Quantité , entrez la quantité de protéines contenue dans les 200 μL de l’échantillon ajouté dans chaque chambre. La concentration sera calculée automatiquement par le logiciel, en tenant compte du volume total de la chambre de 2 mL. Appuyez sur le bouton Enregistrer .
2. Appuyez sur Graphique dans le menu supérieur, puis sur Sélectionner des tracés. Dans la fenêtre qui s’ouvre, sélectionnez Flux par masse pour les deux graphiques (1 et 2, qui se réfèrent respectivement aux chambres A et B). Appuyez sur OK. Le résultat expérimental est maintenant normalisé par la concentration en protéines des échantillons (pmol O₂/s/mg de protéines totales).
3. Dans le coin supérieur droit de chaque graphique (1 et 2) de la page principale des résultats expérimentaux, cliquez sur Concentration O₂. Le long de l’axe des x, identifiez une plage de temps avant l’ajout des échantillons dans les chambres, dans laquelle la concentration d’oxygène et les signaux de flux sont très stables.
   1. Appuyez sur la touche Maj du clavier de l’ordinateur et maintenez-la enfoncée, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’heure initiale sélectionnée, faites glisser le curseur le long de l’axe temporel pour sélectionner la région souhaitée et relâchez le bouton de la souris. Effectuez cette procédure pour chacun des graphiques individuellement.
   2. Double-cliquez sur les barres bleues des zones sélectionnées en bas des graphiques, et tapez « air » pour indiquer qu’il s’agit des régions sélectionnées utilisées pour calculer la saturation en oxygène de l’air.
4. Cliquez sur Étalonnage dans la barre de menu supérieure et sélectionnez A : Oxygène, O₂ pour calibrer la chambre A. Dans la fenêtre ouverte, vérifiez que O₂ Calib est sélectionné (couleur jaune).
   1. Pour l’étalonnage du zéro, cliquez sur Copier à partir du fichier et choisissez le fichier avec l’étalonnage de l’oxygène à zéro précédemment effectué (voir ⁴³ pour les directives du fabricant).
   2. Pour l’étalonnage de l’air, sélectionnez air dans la colonne Sélectionner une marque . Cliquez sur Calibrer et copier dans le presse-papiers.
5. Cliquez sur Étalonnage dans la barre de menu supérieure, sélectionnez B : Oxygène, O₂ et répétez l’étape 6.4 pour calibrer la chambre B.
6. Dans le coin supérieur droit de chaque graphique (1 et 2) de la page principale des résultats expérimentaux, cliquez sur O₂ flux par masse. Sélectionnez les régions stables souhaitées du signal de consommation d’oxygène en maintenant la touche Maj du clavier enfoncée, en cliquant avec le bouton gauche de la souris et en faisant glisser le curseur le long de l’axe temporel. Les régions stables sélectionnées entre les ajouts de pyruvate/proline/malate et d’ADP représentent le L_N ; entre l’ADP et l’antimycine A, OXPHOS ; entre l’antimycine A et le gallate de propyle (en cas d’inhibition de l’ICII), la respiration résistante à l’antimycine A ; entre le gallate de propyle et la roténone (en cas d’inhibition de l’ICII+AOX), respiration résiduelle ; après roténone (en cas d’inhibition de CI+CIII+AOX), respiration non mitochondriale résiduelle. Double-cliquez sur les barres rouges des zones sélectionnées au bas des graphiques et entrez les étiquettes appropriées.
7. Cliquez sur Marques dans la barre de menu supérieure, puis sur Statistiques. Dans l’onglet Afficher de la fenêtre ouverte, décochez toutes les options sauf O₂ flux par masse. Dans l’onglet Sélectionner de la même fenêtre, sélectionnez la chambre A pour obtenir les données de respiration du premier échantillon. Cliquez sur Copier dans le presse-papiers et collez les données dans une feuille de calcul. Répétez la procédure pour obtenir les données du deuxième échantillon dans la chambre B.
8. Dans une feuille de calcul, soustrayez toutes les valeurs de respiration par la respiration non mitochondriale résiduelle (les données après l’ajout de roténones). Calculez les moyennes à partir de plusieurs répétitions expérimentales et tracez les données selon vos préférences.

Résultats

En suivant les étapes des Protocoles 1 et 2, on devrait être capable de concevoir un simple support de flacons de mouches, et d’exécuter le fichier STL du modèle à travers le programme de découpage pour générer des coordonnées pour l’imprimante 3D. La figure 3A montre une unité imprimée du modèle à côté de son design. Nous espérons également que l’étape 1 pourra fournir les compétences de base nécessaires pour utiliser les formes de...

Discussion

Les protocoles d’impression 3D et les fichiers STL fournis ici sont destinés à faciliter la mise en place d’un nouveau flylab ou à augmenter le répertoire d’appareils dans une installation comportementale de drosophile existante, en utilisant du matériel « fait maison ». La stratégie d’impression 3D peut être particulièrement utile dans les pays en développement comme le Brésil, où la recherche utilisant la drosophile comme organisme modèle pour ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer RapRep			A popular 3D-printer based on the Prusa I3 DIY mode, instructions available in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line expressing the AOX gene from C. intestinalis under the control of the constitutive α-tubulin promoter. 5 and 6 copies of this construct are present in males and females in homo/hemizigosity, respectively, one in each of the chromosomes X, 2 and 3.
Acrylic plate			60 x 60 x 3 mm
ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 20398-34-9); ≥95%; molecular weight = 427.20 g/mol; solubility in water at 50 mg/ml
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight ~ 548.63 g/mol; solubility in 95% ethanol at 50 mg/mL
Agar	Kasv	K25-611001	For bacteriologal use; powder; solidifying agent (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free (CAS number 9048-46-8);pH 7; ≥98%; solubility in water 40g/ml
Deionized water
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 67-42-5); ≥97%; molecular weight = 380.35g/mol
Ethanol 99.5%
Ethylene-vinyl acetate foam			Can be replaced with thick pieces of cotton
Graph paper			0.2 cm2 grid
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9), BioPerformance Certified; ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight =238.30g/mol
Homogenizer	Sartorius		Hand glass homogenizer (S), 1 mL; composed of a cylinder made of borosilicate glass plus plunger S; often used for simple sample preparation, e.g. crushing of tissue samples.
KCl	Amresco	0395-2	Potassium chloride (CAS number 7447-40-7); ≥99,0%; molecular weight = 74.55g/mol
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Potassium phophate monobasic (CAS number 7778-77-0); ReagentPlus; molecular weight = 136.09g/mol
Linear bearings (LM8UU)			8 mm, any brand
Malate	Sigma-Aldrich	M1000	L-(-)-Malic acid (CAS number 97-67-6); ≥95-100%; molecular weight = 134.09 g/mol), solubility in water: 100 mg/mL. A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
MgCl2	Amresco	0288-1KG	Magnesium chloride, hexahydrate (CAS number 7791-18-6); 99%-102%; molecular weight = 203.3g/mol
Microcentrifuge tubes			1.5mL; Graduated every 100µL, autoclavable
Na2HPO4	Amresco	0348-1KG	Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (CAS number 7782-85-6); 98-102%; molecular weight = 268.07 g/mol
NaCl	Honeywell	31434-1KG	Sodium chloride (CAS number 7647-14-5); ≥99,5%; molecular weight 58,44g/mol. For laboratory use only.
Oxigraph-O2k	Oroboros	10000-02	Series D-G; O2k-Core: includes O2k-Main Unit with stainless steel housing, O2k-Assembly Kit, two OroboPOS (polarographic oxygen sensors) and OroboPOS-Service Kit, DatLab software, the ISS-Integrated Suction System and the O2k-Titration Set.
Permanent marker			Preferably black
Petri dishes			90 X 15 mm dishes; commonly used for bacteriological culture
PLA 3D Printing Filament	Quantum3D Printing	http://quantum3dprinting.com/	High quality polylatic acid filament (PLA), strongly recomended, (1.0 kg Roll), any brand
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Propyl gallate (CAS number 121-79-9); powder; ≥98%; molecular weight = 212.2 0g/mol; solubility in ethanol at 50 mg/ml
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol; solubility in water at 100 mg/mL
Rectified shafts			8 x 300 mm, any brand
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/mol
Rubber bands			Can be replaced with pieces of a string
Screwdriver			To assemble some of the 3D-printed apparatuses
Screews			M3 x 8 mm
SD Card			At least 32Mb in size; usually provided with 3D printers
Software Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG	https://www.repetier.com/	Excellent slicing software, available free of cost
Software Tinkercad	Autodesk	https://www.tinkercad.com	3D model design software, available free of cost
Stereomicroscope	Leica	M-80	Stereomicroscope, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led light source
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1);
Tris	Amersham Biosciences	17-1321-01	Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (CAS number 77-86-1); 99,8-100.1%; molecular weight 121.14 g/mol
Tweezer/forceps	Stark	ST08710	Histological tweezer, straight, round tip, 12 cm, AISI-410 stainless steel
w1118 fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line used as genetic background control for 3XtubAOX
Wood plate			240 x 60 x 20 mm
Zip tights			2 x 210 mm, any brand