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Résumé

Des protocoles détaillés étape par étape sont décrits ici pour étudier les signaux mécaniques in vitro à l’aide de cellules de crête neurale O9-1 multipotentes et d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable.

Résumé

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules embryonnaires multipotentes vertébrées qui peuvent migrer et se différencier en un large éventail de types de cellules qui donnent naissance à divers organes et tissus. La rigidité des tissus produit une force mécanique, un indice physique qui joue un rôle essentiel dans la différenciation des CNC; toutefois, le mécanisme reste flou. La méthode décrite ici fournit des informations détaillées pour la génération optimisée d’hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable, la mesure précise de cette rigidité et l’évaluation de l’impact des signaux mécaniques dans les cellules O9-1, une ligne NCC qui imite les CCN in vivo.

La rigidité de l’hydrogel a été mesurée à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM) et a indiqué différents niveaux de rigidité en conséquence. Les CCN O9-1 cultivés sur des hydrogels de rigidité variable ont montré une morphologie cellulaire et une expression génique différentes des fibres de stress, ce qui indiquait des effets biologiques variables causés par des changements de signal mécaniques. De plus, cela a établi que la variation de la rigidité de l’hydrogel a abouti à un système in vitro efficace pour manipuler la signalisation mécanique en modifiant la rigidité du gel et en analysant la régulation moléculaire et génétique dans les CCN. Les NCC O9-1 peuvent se différencier en un large éventail de types de cellules sous l’influence des milieux de différenciation correspondants, et il est pratique de manipuler les signaux chimiques in vitro. Par conséquent, ce système in vitro est un outil puissant pour étudier le rôle de la signalisation mécanique dans les CCN et son interaction avec les signaux chimiques, ce qui aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et génétiques du développement de la crête neurale et des maladies.

Introduction

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont un groupe de cellules souches au cours de l’embryogenèse des vertébrés avec une capacité remarquable à migrer et à contribuer au développement de divers organes et tissus. Les CCN peuvent se différencier en différents types de cellules, y compris les neurones sensoriels, le cartilage, les os, les mélanocytes et les cellules musculaires lisses, en fonction de l’emplacement de l’origine axiale et du guidage environnemental local du CNC1,2. Avec la capacité de se différencier en un large éventail de types cellulaires, les anomalies génétiques qui provoquent un dérèglement à n’importe quel stade du développement de la crête neurale (NC) peuvent conduire à de nombreuses maladies congénitales2. Par exemple, les perturbations au cours de la formation, de la migration et du développement des CCN entraînent des troubles du développement connus collectivement sous le nom de neurocristopathies1,3. Ces maladies vont des défauts craniofaciaux dus à l’échec de la formation des CNC, tels que le syndrome de Treacher Collins, au développement de divers cancers dus à la capacité migratoire métastatique des CNC, comme on le voit dans le mélanome3,4,5,6. Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont fait des découvertes remarquables sur les rôles et les mécanismes des CCN dans le développement et les maladies, la majorité des résultats étant axés sur les signaux chimiques7,8. Plus récemment, il a été indiqué que les signaux mécaniques jouaient un rôle critique mais mal compris dans le développement de laCCN 9,10.

Les signaux environnementaux des CCN jouent un rôle essentiel au cours de leur développement, y compris la régulation de la différenciation des CNC en différents types de cellules. Les indices environnementaux, par exemple les indices physiques, influencent les comportements pivots et les réponses cellulaires, telles que la diversification fonctionnelle. La mécanotransduction permet aux cellules de détecter et de répondre à ces signaux pour maintenir divers processus biologiques2. Les CCN sont entourés de cellules voisines et de différents substrats, tels que la matrice extracellulaire (ECM), qui peuvent donner lieu à des stimuli mécaniques pour maintenir l’homéostasie et s’adapter aux changements par la détermination du destin, la prolifération et l’apoptose11. La mécanotransduction commence au niveau de la membrane plasmique où se produit la composante sensorielle des stimuli extracellulaires mécaniques, entraînant la régulation intracellulaire de la cellule12. Les intégrines, les adhérences focales et les jonctions de la membrane plasmique relaient les signaux mécaniques, tels que les forces de cisaillement, les contraintes et la rigidité des substrats environnants, en signaux chimiques pour produire des réponses cellulaires12. Le relais des signaux chimiques de la membrane plasmique à la régulation cellulaire finale est effectué via différentes voies de signalisation pour finaliser les processus vitaux pour l’organisme, tels que la différenciation.

Plusieurs études ont suggéré que la signalisation mécanique de la rigidité du substrat joue un rôle dans la différenciation cellulaire13,14. Par exemple, des études antérieures ont montré que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur des substrats mous avec une rigidité similaire à celle du tissu cérébral (de l’ordre de 0,1 à 1,0 kPa) entraînaient une différenciation des cellules neuronales15,16. Cependant, plus de CSM se différencient en cellules de type myocytaire lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats de 8 à 17 kPa imitant la rigidité du muscle, tandis qu’une différenciation de type ostéoblaste a été observée lorsque les CSM ont été cultivés sur des substrats rigides (25-40 kPa)15,16. L’importance de la mécanotransduction est mise en évidence par les irrégularités et les anomalies dans la voie de signalisation mécanique qui conduisent potentiellement à de graves défauts de développement et des maladies, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires et l’ostéoporose17,18,19. Dans les cancers, le tissu mammaire normal est mou et le risque de cancer du sein augmente dans le tissu mammaire raide et dense, un environnement qui s’apparente davantage à des tumeurs mammaires15. Grâce à ces connaissances, les effets de la signalisation mécanique sur le développement de la CCN peuvent être étudiés par une simple manipulation de la rigidité du substrat à travers un système in vitro, offrant ainsi d’autres avantages et possibilités pour comprendre les principes fondamentaux de la progression et de l’étiologie de la maladie liée à la NC.

Pour étudier l’impact des signaux mécaniques dans les CCN, nous avons établi un système in vitro efficace pour les CCN basé sur l’optimisation des méthodes précédemment publiées et l’évaluation des réponses des CCN à différents signaux mécaniques20,21. Un protocole détaillé a été fourni pour la préparation de la rigidité variable de l’hydrogel et l’évaluation de l’impact de la signalisation mécanique dans les CCN. Pour ce faire, les CCN O9-1 sont utilisés comme modèle CN pour étudier les effets et les changements en réponse aux hydrogels rigides par rapport aux hydrogels mous. Les NCC O9-1 sont une lignée cellulaire NC stable isolée à partir d’embryons de souris (E) au jour 8,5. Les NCC O9-1 imitent les NCC in vivo parce qu’ils peuvent se différencier en différents types de cellules dérivées de NC dans des milieux de différenciation définis22. Pour étudier la signalisation mécanique des CCN, un substrat matriciel a été fabriqué avec une élasticité accordable à partir de concentrations variables de solutions d’acrylamide et de bis-acrylamide pour obtenir la rigidité souhaitée, en corrélation avec la rigidité biologique du substrat20,21,23. Afin d’optimiser les conditions du substrat matriciel pour les CCN, en particulier les cellules O9-1, des modifications ont été apportées à partir du protocole20précédemment publié. Un changement apporté à ce protocole a été d’incuber des hydrogels dans du collagène I, dilués dans de l’acide acétique à 0,2 % au lieu de 50 mM d’HEPES, à 37 °C pendant la nuit. Le faible pH de l’acide acétique conduit à une distribution homogène et à une incorporation plus élevée de collagène I, permettant ainsi une fixation plus uniforme de la protéine ECM24. En outre, une combinaison de sérum de cheval et de sérum fœtal bovin (FBS) a été utilisée à des concentrations de 10% et 5% dans une solution saline tampon phosphate (PBS), respectivement, avant de stocker les hydrogels dans l’incubateur. Le sérum de cheval a été utilisé comme supplément supplémentaire au FBS en raison de sa capacité à favoriser la prolifération et la différenciation cellulaires à la concentration de 10%25.

Avec cette méthode, un environnement biologique a été imité par le revêtement protéique ECM (par exemple, le collagène I) pour créer un environnement in vitro précis permettant aux CCN de croître et de survivre20,21. La rigidité des hydrogels préparés a été analysée quantitativement par microscopie à force atomique (AFM), une technique bien connue pour représenter le module élastique26. Pour étudier l’effet de différents niveaux de rigidité sur les CCN, des cellules O9-1 de type sauvage ont été cultivées et préparées sur des hydrogels pour la coloration par immunofluorescence (FI) contre l’actine filamenteuse (F-actine) afin de montrer les différences d’adhésion cellulaire et de morphologies en réponse aux changements de rigidité du substrat. En utilisant ce système in vitro, les chercheurs seront en mesure d’étudier les rôles de la signalisation mécanique dans les NCC et son interaction avec d’autres signaux chimiques afin de mieux comprendre la relation entre les NCC et la signalisation mécanique.

Protocole

1. Préparation de l’hydrogel

REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte de culture cellulaire qui a été désinfectée à l’éthanol et stérilisée aux ultraviolets (UV) avant utilisation pour maintenir la stérilité. Les outils, tels que les pinces à épiler et les pipettes, doivent être pulvérisés avec de l’éthanol. Les solutions tampons doivent également être filtrées stériles.

  1. Préparation de couvercles en verre revêtus d’aminosilane
    1. Placez le nombre souhaité de couvercles de verre sur un morceau de lingette de laboratoire.
      REMARQUE: Préparez 3-4 couvercles supplémentaires pour assurer des alimentations de sauvegarde suffisantes car elles se cassent facilement. Différents matériaux de couvercles en verre produiront une compatibilité différente de l’ensemencement et de la fixation des cellules. Il est préférable de déterminer quel type convient le mieux à l’expérience avant de commencer les expériences (voir le tableau des matériaux).
    2. Utilisez un brûleur à alcool ou un brûleur Bunsen pour stériliser chaque couvercle en le faisant passer d’avant en arrière à travers la flamme (30 s pour les expériences de dosage des protéines). Placez chaque couvercle en verre sur une lingette de laboratoire pour refroidir.
    3. Une fois les couvercles en verre refroidis, transférez-les sur une boîte de Petri recouverte de parafilm pour éviter tout glissement.
      REMARQUE: Si les couvercles ne sont pas assez froids, la chaleur résiduelle fera fondre le parafilm sur les glissières, les rendant inutilisables.
    4. Couvrir les couvercles avec environ 200 μL et 800 μL de NaOH de 0,1 M NaOH pour un couvercle de 12 mm et un couvercle de 25 mm, respectivement, et les laisser reposer pendant 5 min. Ensuite, aspirez le NaOH de 0,1 M et laissez les couvercles sécher à l’air libre pendant encore 5 minutes pour former un film uniforme.
    5. Une fois les couvercles séchés, pipettez environ 80 μL et 150 μL de triéthoxysilane de 3-aminopropyle (APTS) pour des couvercles de 12 mm et 25 mm, respectivement. Veillez à ne pas renverser la solution sur le parafilm. Laissez reposer la solution pendant 5 min.
    6. Aspirer autant d’APTS en excès que possible et laisser sécher les APTS résiduels pendant 5 min. Rincez bien les couvercles en les immergeant dans du H2O stérile et désionisé (DI) trois fois pendant 5 min à chaque fois.
      REMARQUE: Si les couvercles en verre ne sont pas bien rincés, l’APTS résiduel provoque des réactions indésirables avec le glutaraldéhyde, provoquant la formation d’un précipité blanc et entraînant des glissements de couverture inutilisables.
    7. Déplacez les couvercles vers une nouvelle boîte de Petri avec le côté réactif vers le haut. Ajouter suffisamment de glutaraldéhyde à 0,5% dans la boîte de Petri pour couvrir entièrement les couvercles et laisser reposer les couvercles pendant 30 minutes.
    8. Aspirer le glutaraldéhyde à 0,5% et rincer à nouveau les couvercles dans DI H2O une fois pendant 3 min. Placez les couvercles côté réactif sur une lingette de laboratoire ou une boîte de Petri propre pour qu’ils sèchent complètement à l’air libre avant de les utiliser.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici; Les couvercles doivent être placés dans du DI H2O stérile jusqu’à leur utilisation.
  2. Préparation de couvercles siliconés
    1. Placez le même nombre de couvercles que les couvercles recouverts d’aminosilane (étape 1.1.1) dans une boîte de Petri recouverte de parafilm.
    2. Pipette 40 μL ou 150 μL pour des couvercles de 12 mm et 25 mm, respectivement, de dichlorométhylsilane (DCMS) sur un côté du couvercle et laisser reposer la solution pendant 5 min.
    3. Aspirer toute solution restante de la glissière de couverture, laver dans le DI H2O stérile une fois pendant 1 min et placer les lèvres réactives face vers le haut sur une lingette de laboratoire pour sécher complètement à l’air avant de passer à l’étape suivante.
  3. Préparation d’hydrogels
    1. Mélanger l’acrylamide, le bis-acrylamide et le DIH2O dans un tube centrifuge de 1,5 mL pour préparer 500 μL de solutions avec des rigidités variables (voir tableau 1). Vortex la solution pendant 30 s pour bien mélanger.
    2. En travaillant rapidement, ajoutez la solution de persulfate d’ammonium (APS) à 10% et la tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans le tube et vortexez à nouveau les solutions pour mélanger les solutions.
      REMARQUE: Préparez un APS frais à 10% et laissez-le sur de la glace ou congelez-le dans des aliquotes à usage unique en raison de son cycle sensible de congélation / décongélation.
    3. Pipeter environ 33 μL ou 100 μL de la solution sur les couvercles séchés de 12 mm ou 25 mm recouverts d’aminosilane (section 1.1), respectivement.
    4. À l’aide d’une pince à épiler incurvée, placez immédiatement le couvercle traité par DCMS sur le dessus de la solution de gel avec le côté traité touchant la solution de gel, prenant ainsi en sandwich la solution de gel entre le couvercle traité par DCMS et le couvercle enduit d’aminosilane.
    5. Laisser la solution de gel polymériser pendant 5 à 15 minutes, tout en surveillant activement la polymérisation en gel de la solution restante dans le tube.
    6. Une fois le gel polymérisé, séparez le couvercle traité DCMS par une pince à épiler incurvée ou une lame de rasoir, en laissant le gel attaché au couvercle d’origine recouvert d’aminosilane.
    7. Placez immédiatement le couvercle avec l’hydrogel attaché dans une plaque prédéterminée de 4 puits/24 puits et 6 puits recouverte de 500 μL et 2 mL de PBS stérile ou de DI H2O pour des couvercles de 12 mm et 25 mm, respectivement, pour éviter que le gel ne se dessèche.
    8. Répétez les étapes 1.3.4 à 1.3.7 pour tous les couvercles.
    9. Immergez les hydrogels dans du PBS stérile ou du DIH2Opendant 30 min pour éliminer l’excès de solution d’acrylamide. Conserver les hydrogels dans du PBS stérile ou du DIH2Oà 4 °C pour un arrêt procédural ici.
    10. Dans une pièce sombre, préparer le mélange d’hexanoate de sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) (sulfo-SANPAH) en mélangeant 2,5 mL de 50 mM d’acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique (HEPES) (pH = 8,5) avec 25 μL de sulfo-SANPAH de 50 μg/mL dans un tube conique, enveloppé dans du papier d’aluminium pour protéger de la lumière. Utilisez une pipette pour bien mélanger la solution avant de l’utiliser.
      REMARQUE: Un volume de 2,5 mL de solution de sulfo-SANPAH est suffisant pour environ vingt-cinq hydrogels de 12 mm ou cinq hydrogels de 25 mm.
    11. Aspirer PBS ou DI H2O à partir de la plaque de puits. Ajouter environ 100 μL ou 500 μL pour des couvercles de 12 mm et 25 mm, respectivement, de solution de sulfo-SANPAH (étape 1.3.10) pour couvrir le gel. Assurez-vous que la solution recouvre entièrement le gel.
      REMARQUE: Ajustez la force d’aspiration sous vide pour empêcher la forte force de déchirer ou de perturber les hydrogels.
    12. Placez les gels avec la solution sous une lumière UV de 15 W, 365 nm pendant 10 min, à découvert pour minimiser toute interférence de la lumière UV réagissant avec le sulfo-SANPAH.
    13. Aspirer l’excès de sulfo-SANPAH en inclinant la plaque pour recueillir autant de solution que possible. Lavez le gel avec 50 mM HEPES deux à trois fois.
    14. Ajouter 500 μL et 2 mL pour les gels de 12 mm et 25 mm, respectivement, de collagène I de 50 mg/mL dilué dans de l’acide acétique à 0,2 % à chaque puits contenant l’hydrogel. Laisser les gels incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2.
      REMARQUE: Diluer le collagène I dans de l’acide acétique à 0,2% au lieu de 50 mM HEPES pour favoriser une distribution et une fixation homogènes du collagène I.
    15. Aspirer le collagène I et laver les gels avec du PBS stérile trois fois pour éliminer l’excès de collagène I pendant 5 min chaque lavage. Incuber les hydrogels dans du PBS avec 10% de sérum de cheval, 5% de FBS pendant 2 h dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO2.
      REMARQUE: L’ajout de 10% de sérum de cheval favorise une prolifération plus élevée par rapport à l’utilisation de FBS comme cela a été fait dans la publication précédente.
    16. Aspirer le milieu. Ajouter 500 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco filtré stérile avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) à chaque puits. Conservez les gels dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la culture cellulaire.
    17. Une fois prêt, déposer environ 1,5 × 10 cellules4 O9-1/cm2 en milieu basal dans les boîtes de culture. Incuber les cellules pendant 2 jours dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2. Vérifiez la confluence des cellules pour s’assurer que les cellules sont suffisamment attachées aux gels et que le nombre de cellules est suffisant avant de les collecter pour analyse.
      REMARQUE : Voir le protocole publié précédemment pour les étapes de récupération, de passage et de collecte des cellules O9-120.
    18. Passez aux sections 2, 3 ou 4 pour une analyse plus approfondie des hydrogels.

2. Analyse quantitative de la rigidité via AFM

  1. Démarrez l’ordinateur système AFM, suivi du contrôleur AFM (voir la table des matériaux).
  2. Montez le porte-à-faux AFM sur le porte-sonde AFM. Utilisez un porte-à-faux sphérique avec une bille de silice de 0,5 μm montée à l’extrémité du porte-à-faux (porte-à-faux avec perle sphérique).
    REMARQUE: Pour les hydrogels plus rigides, tels que 10 kPa, 20 kPa et 40 kPa, une sonde plus rigide a été utilisée avec la constante de ressort de 0,24 N / m. Une sonde plus douce a été utilisée pour les hydrogels plus mous, tels que 0,5 kPa et 1 kPa, avec une constante de ressort de 0,059 N/m.
  3. Réglez le logiciel AFM en mode contact.
  4. Montez la plaquette de silicium sur l’étage d’échantillonnage AFM pour collecter les courbes de force en cliquant sur Engager pour que le porte-à-faux touche le substrat de silicium, générant ainsi les courbes de force.
  5. Utilisez les courbes de force ci-dessus (2.4) pour l’étalonnage, cliquez sur Calibrer dans le logiciel de contrôle pour obtenir une constante de ressort moyenne du porte-à-faux dans des conditions de réglage thermique et enregistrez les valeurs étalonnées dans le logiciel de contrôle.
  6. Montez les échantillons en plaçant le couvercle avec l’hydrogel attaché dans une boîte de Petri de 60 mm sur l’étage de balayage AFM. Ajouter 3 mL de PBS dans le plat avant d’effectuer des mesures pour éviter que le gel ne se dessèche.
  7. Réglez l’AFM pour qu’il fonctionne en mode contact (fluide) pour démarrer la mesure. Engagez la perle sphérique pour toucher et soulever continuellement de l’échantillon de gel.
  8. Réglez le porte-à-faux de sorte que son seuil de déviation reste à 10 nm. Maintenez la taille de rampe de la sonde à 10 μm. Ensuite, enregistrez les courbes de force comme à l’étape 2.4.
  9. Acquérir au moins 20 courbes de force d’au moins 3 à 10 points différents sur la surface de l’hydrogel.
  10. Calculez le module de Young moyen d’environ 20 courbes de force pour chaque point avec un logiciel d’imagerie et d’analyse AFM. Utilisez des courbes de force de rampe d’extension et un modèle linéarisé (sphérique). Calculez la moyenne de tous les points pour chaque échantillon afin d’obtenir la rigidité finale.
    REMARQUE : Le module de Young et les données connexes(c.-à-d. les écarts-types) sont automatiquement enregistrés sous forme de feuille de calcul.
  11. Répétez les étapes 2.6 à 2.10 pour tous les échantillons.

3. Analyse moléculaire de la rigidité par coloration par immunofluorescence

  1. Utilisez une pince à épiler pour transporter le couvercle vers une nouvelle plaque afin de minimiser les faux signaux provenant de cellules cultivées directement sur la plaque. Lavez les cellules avec 500 μL de PBS stérile trois fois pour éliminer les cellules mortes et tout milieu de culture restant.
  2. Fixez les cellules à l’aide de 500 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 10 min à température ambiante, sans être dérangé. Ensuite, lavez à nouveau les cellules trois fois en utilisant 500 μL de PBS / puits pendant 2 minutes chacune.
    REMARQUE: Conserver à 4 °C pour un arrêt de procédure.
  3. Traiter les cellules avec 500 μL de Triton X-100 à 0,1 % pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 500 μL de PBS / puits.
  4. Bloquer les cellules avec 250 μL de sérum d’âne à 10% (dilué dans du PBS et 0,1% de Tween 20) par puits pendant 30 min à température ambiante.
  5. Incuber les cellules avec 250 μL d’anticorps primaires pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 500 μL de PBS / puits pendant 5 minutes chacune.
    REMARQUE: Anti-Vinculine (Vcl) (1:250) et anti-AP2 alpha (1:250) ont été utilisés dans cette expérience et ont été dilués dans 10% de sérum d’âne.
  6. Incuber les cellules avec les anticorps secondaires correspondants et/ou la phalloïdine utilisée pour la coloration de la F-actine à une dilution de 1:400 dans 250 μL de sérum d’âne à 10% pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec PBS pendant 5 minutes chacune.
    REMARQUE: La phalloïdine 568 nm peut être co-incubée avec des anticorps secondaires de 488 nm ou 647 nm ou seule.
  7. Incuber les cellules avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, dilution 1:1000) dans 250 μL de PBS pendant 10 min suivi d’un dernier lavage de PBS pendant 2 min.
  8. Ajouter 3-4 gouttes de support de montage à chaque puits. Conservez les échantillons à 4 °C pour les régler pendant au moins 2 h avant l’imagerie afin de vous assurer que le support de montage est correctement réglé.
  9. Capturez des images d’au moins 3 images aléatoires par échantillon d’hydrogel avec un microscope à fluorescence, en produisant des canaux individuels et fusionnés.

4. PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)

  1. Transférez les hydrogels avec les cellules adhérentes pour la collecte d’ARN dans une nouvelle plaque afin de minimiser l’ARN indésirable des cellules attachées à la plaque cellulaire. Lavez les cellules avec du PBS trois fois pour éliminer les cellules mortes et le milieu de culture.
  2. Extrayez l’ARNm total à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN. Effectuer la transcription inverse de l’ARN en ADNc à l’aide d’un supermélange de transcription inverse en suivant les instructions du fabricant.
  3. Effectuez la RT-qPCR avec des amorces pour Vcl comme marqueur de rigidité de choix et analysez à l’aide de la méthode2 -ΔΔCT.
    REMARQUE: Séquence d’amorce de Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; inverser 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Résultats

Préparation de l’hydrogel et évaluation de la rigidité par AFM et le modèle Hertz
Ici, un protocole détaillé est fourni pour générer des hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable en régulant le rapport entre l’acrylamide et le bis-acrylamide. Cependant, les hydrogels de polyacrylamide ne sont pas prêts pour l’adhésion des cellules en raison du manque de protéines ECM. Ainsi, le sulfo-SANPAH, agissant comme un liant, se lie de manière covalente aux hydrogels et réagit avec l...

Discussion

L’objectif de la présente étude est de fournir un système in vitro efficace et efficient pour mieux comprendre l’impact des signaux mécaniques dans les CCN. En plus de suivre le protocole étape par étape mentionné ci-dessus, les chercheurs doivent garder à l’esprit que la culture cellulaire des CCN O9-1 est affectée par le type de couvercles en verre utilisés pour préparer les hydrogels. Par exemple, il a été noté que les cellules ensemencées sur un type spécifique de couvercle en verre (vo...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions la Dre Ana-Maria Zaske, opératrice de l’installation Atomic Force Microscope-UT Core au Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas, pour l’expertise apportée en AFM dans ce projet. Nous remercions également J. Wang les sources de financement des National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 et R01HL142704).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Références

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
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