Imagerie optique mésoscopique du cœur entier de souris

Résumé

Nous rapportons une méthode de reconstruction mésoscopique de l’ensemble du cœur de souris en combinant de nouvelles avancées dans la transformation tissulaire et la coloration avec le développement d’un microscope à feuille de lumière à balayage axial.

Résumé

Les maladies cardiaques génétiques et non génétiques peuvent provoquer de graves processus de remodelage dans le cœur. Le remodelage structurel, tel que le dépôt de collagène (fibrose) et le désalignement cellulaire, peut affecter la conduction électrique, introduire des dysfonctionnements électromécaniques et, éventuellement, conduire à une arythmie. Les modèles prédictifs actuels de ces altérations fonctionnelles sont basés sur des informations structurelles non intégrées et à faible résolution. Il est difficile de placer ce cadre dans un ordre de grandeur différent en raison de l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution dans des tissus massifs. Dans ce travail, nous décrivons un cadre méthodologique qui permet l’imagerie de cœurs de souris entiers avec une résolution micrométrique. La réalisation de cet objectif a nécessité un effort technologique où les progrès de la transformation tissulaire et des méthodes d’imagerie ont été combinés. Tout d’abord, nous décrivons un protocole CLARITY optimisé capable de transformer un cœur intact en une forme nanoporeuse, hybride d’hydrogel, sans lipides qui permet une transparence élevée et une coloration profonde. Ensuite, un microscope à feuille de lumière à fluorescence capable d’acquérir rapidement des images d’un champ de vision mésoscopique (échelle mm) avec une résolution à l’échelle du micron est décrit. Suite au projet mesoSPIM, le microscope conçu permet la reconstruction de l’ensemble du cœur de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique. Nous pensons que ce cadre méthodologique permettra de clarifier l’implication du désarroi de la cytoarchitecture dans les dysfonctionnements électriques et d’ouvrir la voie à un modèle complet qui prend en compte à la fois les données fonctionnelles et structurelles, permettant ainsi une étude unifiée des causes structurelles qui conduisent à des altérations électriques et mécaniques après le remodelage tissulaire.

Introduction

Le remodelage structurel associé aux maladies cardiaques peut affecter la conduction électrique et introduire des dysfonctionnements électromécaniques de l’organe ^1,2. Les approches actuelles utilisées pour prédire les altérations fonctionnelles utilisent couramment l’IRM et l’IRM-DT pour obtenir une reconstruction globale du dépôt de fibrose, de l’arbre vasculaire et de la distribution des fibres du cœur, et elles sont utilisées pour modéliser les voies de propagation du potentiel d’action préférentielle (APP) à travers l’organe ^3,4. Ces stratégies peuvent fournir un bel aperçu de l’organisation du cœur. Cependant, leur résolution spatiale est insuffisante pour étudier l’impact du remodelage structurel sur la fonction cardiaque au niveau cellulaire.

Il est difficile de placer ce cadre à un ordre de grandeur différent, où des cellules individuelles peuvent jouer des rôles individuels dans la propagation du potentiel d’action. La principale limitation est l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution (résolution micrométrique) dans des tissus massifs (de la taille d’un centimètre). En fait, l’imagerie de tissus biologiques en 3D à haute résolution est très compliquée en raison de l’opacité des tissus. L’approche la plus courante pour effectuer des reconstructions 3D dans des organes entiers consiste à préparer des sections minces. Cependant, un sectionnement, un assemblage et une imagerie précis nécessitent beaucoup d’efforts et de temps. Une approche alternative qui ne nécessite pas de couper l’échantillon consiste à générer un tissu transparent. Au cours des dernières années, plusieurs méthodologies de clarification des tissus ont été proposées 5,6,7,8. Le défi de produire des tissus massifs, transparents et marqués par fluorescence a récemment été relevé en développant de véritables approches de transformation tissulaire (CLARITY⁹, SHIELD¹⁰). En particulier, la méthode CLARITY est basée sur la transformation d’un tissu intact en une forme nanoporeuse, hybride hydrogel, sans lipides qui permet de conférer une grande transparence par l’élimination sélective des bicouches lipidiques membranaires. Notamment, cette méthode s’est avérée efficace également dans la préparation cardiaque^11,12,13,14. Cependant, comme le cœur est trop fragile pour convenir à une clairière active, il doit être dégagé en utilisant l’approche passive, qui nécessite beaucoup de temps pour conférer une transparence complète.

En combinaison avec des techniques d’imagerie avancées telles que la microscopie à feuille de lumière, CLARITY a le potentiel d’imager en 3D des tissus cardiaques massifs à une résolution micrométrique. En microscopie à feuille de lumière, l’éclairage de l’échantillon est réalisé avec une fine feuille de lumière confinée dans le plan focal de l’objectif de détection. L’émission de fluorescence est recueillie le long d’un axe perpendiculaire au plan d’éclairage¹⁵. L’architecture de détection est similaire à la microscopie à grand champ, ce qui rend l’acquisition beaucoup plus rapide que les microscopes à balayage laser. Le déplacement de l’échantillon à travers la feuille lumineuse permet d’obtenir une tomographie complète de grands spécimens, jusqu’à des échantillons de la taille d’un centimètre. Cependant, en raison des propriétés intrinsèques du faisceau gaussien, il est possible d’obtenir une feuille de lumière très mince (de l’ordre de quelques microns) uniquement pour une extension spatiale limitée, limitant ainsi drastiquement le champ de vision (FoV). Récemment, un nouveau schéma d’excitation a été introduit pour surmonter cette limitation et appliqué à l’imagerie cérébrale, permettant des reconstructions 3D avec une résolution isotrope¹⁶.

Dans ce document, une approche de compensation passive est présentée, permettant une réduction significative du délai de compensation requis par le protocole Clarity. Le cadre méthodologique décrit ici permet de reconstruire un cœur entier de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique avec un temps d’acquisition de l’ordre de quelques minutes.

Protocole

Toutes les manipulations et procédures des animaux ont été effectuées conformément aux directives de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et conformes aux principes et règlements du ministère italien de la Santé. Le protocole expérimental a été approuvé par le ministère italien de la Santé (protocole numéro 647/2015-PR). Tous les animaux ont été fournis par ENVIGO, Italie. Pour ces expériences, 5 souris mâles C57BL/6J âgées de 6 mois ont été utilisées.

1. Préparation de la solution

1. Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,6) dans une hotte chimique. Conservez les aliquotes PFA à 4 % à -20 °C pendant plusieurs mois.
2. Préparer la solution d’hydrogel: Mélanger 4% d’acrylamide, 0,05% de bis-acrylamide, 0,25% d’initiatior AV-044 dans 0,01 M PBS dans une hotte chimique. Gardez les réactifs et la solution sur la glace pendant toute la préparation. Conservez les aliquotes d’hydrogel à -20 °C pendant plusieurs mois.
3. Préparer la solution de nettoyage: Mélanger 200 mM d’acide borique, 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l’eau désionisée; pH 8,6 dans une hotte chimique. Conserver la solution entre 21 et 37 °C pour éviter les précipitations de SDS.
4. Préparer une solution fraîche de Tyrode le jour de l’expérience: Ajouter 10 mM de glucose, 10 mM HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl₂ et 4,7 mM de KCl; titrer à pH 7,4 en utilisant 1 M NaOH.

2. Isolement cardiaque

1. Injecter 0,1 mL de 500 U.U. Héparine par voie sous-cutanée 30 minutes avant la procédure d’isolement cardiaque.
2. Remplissez une seringue de 30 ml et trois boîtes de Petri de 6 cm avec une solution de Tyrode fraîche. Faites une petite faille (3-4 mm de profondeur) sur le bord de l’une des boîtes de Petri et placez-la sous un microscope stéréoscopique.
3. Fixez une canule de 1 mm de diamètre à la seringue et insérez-la dans la faille de la boîte de Pétri. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue.
4. Remplissez une seringue de 20 ml avec du PFA à 4 % et conservez-la dans le capot chimique. Préparez une boîte de Petri vide sous le capot.
5. Anesthésier la souris avec 3% d’isoflurane/oxygène à un débit de 1,0 L/min et la sacrifier par luxation cervicale selon les règles de bien-être animal en vigueur.
6. Après le sacrifice, retirez la fourrure sur la poitrine et ouvrez la poitrine pour avoir un accès complet au cœur.
7. Isoler le cœur, l’immerger dans la boîte de Petri préalablement remplie de 50 ml de solution Tyrode. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper l’aorte immédiatement près de l’arc aortique afin d’exposer le cœur.
8. Transférer le cœur au microscope stéréoscopique et effectuer soigneusement la canulation. N’insérez pas la canule trop profondément dans l’aorte (pas plus de 2 mm) pour éviter des lésions tissulaires.
9. Utilisez une petite pince et une suture (taille 5/0) pour fixer le cœur à la canule.
10. Perfuser le cœur avec 30 mL de la solution Tyrode avec une pression constante de 10 mL/min pour éliminer le sang des vaisseaux.
11. Détachez la canule de la seringue et placez le cœur dans la boîte de Petri remplie de solution Tyrode. Veillez à ne pas avoir de bulles d’air dans la canule; Sinon, retirez les bulles d’air correctement.
12. Fixez la seringue de 20 ml remplie de PFA froid à 4% à la canule et perfuser le cœur à la même pression constante.
13. Incuber le cœur dans 10 mL de PFA à 4 % à 4 °C pendant une nuit (O/N). Pour éviter la dégradation des tissus, effectuez les étapes 2.6-2.13 dans les plus brefs délais.

3. Nettoyage du cœur

1. Le lendemain, laver le cœur dans 0,01 M PBS 3 fois à 4 °C pendant 15 min.
   REMARQUE: Après cette étape, le cœur peut être stocké dans PBS + 0,01% d’azoture de sodium (NaN3) à 4 ° C pendant plusieurs mois.
2. Incuber le cœur dans 30 mL de solution d’hydrogel en secouant (15 rpm) à 4 °C pendant 3 jours.
3. Dégazez l’échantillon à température ambiante à l’aide d’un sécheur, d’une pompe à vide et d’un système de tubes qui relie le sécheur à la pompe et à un pipeline d’azote.
   1. Placez l’échantillon dans le séchoir et ouvrez le flacon en gardant le capuchon dessus.
   2. Fermez le séchoir et retirez l’oxygène du tube en ouvrant la canalisation d’azote.
   3. Allumez la pompe à vide pour retirer l’oxygène de la sécheuse pendant 10 min.
   4. Éteignez la pompe et utilisez le bouton de la sécheuse pour ouvrir la canalisation d’azote. Une fois que la pression est égale à la pression atmosphérique, ouvrez soigneusement le séchoir et fermez rapidement le flacon.
4. Maintenir le cœur dans la solution d’hydrogel dégazée à 37 °C pendant 3 h au repos.
5. Lorsque l’hydrogel est correctement polymérisé et apparaît entièrement gélatineux, retirez-en soigneusement le cœur et placez-le dans le porte-échantillon.
6. Insérez le porte-échantillon avec le cœur dans l’une des chambres de nettoyage et fermez-le correctement pour éviter les fuites de la solution de nettoyage.
7. Allumez le bain-marie où le récipient de solution de nettoyage est placé et la pompe péristaltique pour démarrer la recirculation de la solution de nettoyage.
8. Changez la solution de dédouanement dans le conteneur une fois par semaine pour accélérer la procédure de clarification.

4. Coloration de la membrane cellulaire

1. Une fois que le cœur semble complètement clarifié, retirez-le du porte-échantillon et lavez-le dans 50 ml de PBS réchauffé pendant 24 heures. Laver à nouveau dans 50 ml de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) pendant 24 h.
2. Incuber l’échantillon dans 0,01 mg/mL d’agglutinine germée de blé (WGA) - Alexa Fluor 633 dans 3 mL de PBS-T 1x en agitation (50 rpm) à température ambiante pendant 7 jours.
3. Après l’incubation de 7 jours, laver l’échantillon dans 50 mL de PBS-T 1x à température ambiante en agitant pendant 24 h.
4. Incuber l’échantillon dans 4% PFA pendant 15 min, puis le laver 3 fois dans PBS pendant 5 min chacun.
   NOTE: Après cette étape, le cœur peut être stocké dans PBS + 0,01% NaN3 à 4 ° C pendant plusieurs mois.
5. Incuber le cœur à des concentrations croissantes de 2,2′-thiodiéthanol (TDE) dans 0,01 M PBS (20% et 47% TDE/PBS) pendant 8 h chacun, jusqu’à la concentration finale de 68% TDE dans 0,01 M PBS pour fournir l’indice de réfraction requis (RI = 1,46). Il s’agit du support de correspondance RI (RI-medium) pour acquérir des images¹⁶.

5. Montage et acquisition du cœur

REMARQUE: Tous les composants du système optique sont énumérés en détail dans le tableau des matériaux.

1. Remplir délicatement environ 80% de la cuvette externe (quartz, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) avec le milieu RI.
   REMARQUE: Ici, il est possible d’utiliser différentes solutions non volatiles qui garantissent un RI de 1,46.
2. Remplir délicatement la cuvette interne (quartz, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) avec le même milieu RI.
3. Immergez l’échantillon à l’intérieur de la cuvette interne. Les incubations de l’échantillon décrites ci-dessus permettent à l’échantillon de rester stable à l’intérieur du milieu IR sans être maintenu.
4. Déplacez doucement l’échantillon vers le bas de la cuvette à l’aide d’une fine pince à épiler et disposez le cœur avec son axe longitudinal parallèle à l’axe principal de la cuvette pour minimiser le trajet de la lumière d’excitation à travers le tissu pendant le balayage.
5. Fixez délicatement le bouchon sur mesure au-dessus de la cuvette interne à l’aide de deux vis.
6. Montez l’échantillon sur l’étage du microscope à l’aide des aimants.
7. Traduisez manuellement l’étage d’échantillonnage vertical pour immerger la cuvette interne dans la cuvette externe.
8. Allumez la source lumineuse d’excitation (longueur d’onde de 638 nm), en réglant une faible puissance (de l’ordre de 3 mW).
9. Déplacez l’échantillon à l’aide du traducteur motorisé pour éclairer un plan interne du tissu.
10. Allumez le logiciel d’imagerie (HCImageLive) et réglez le déclencheur de la caméra sur le mode externe (feuille de lumière) pour piloter le déclencheur d’acquisition de la caméra par le logiciel personnalisé contrôlant l’ensemble de la configuration.
11. Activez l’enregistrement automatique dans le panneau Paramètres de numérisation et définissez le dossier de sortie dans lequel les images doivent être enregistrées.
12. Ajustez manuellement la position de l’échantillon dans le plan XY avec les traducteurs linéaires pour déplacer l’échantillon vers le centre du FoV du capteur de caméra.
13. Déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à l’aide du traducteur motorisé linéaire pour identifier les bordures cardiaques pour la reconstruction tomographique.
14. Augmentez la puissance laser à ~20 mW, prêt pour la session d’imagerie.
15. Démarrez l’acquisition tomographique, cliquez sur le bouton Démarrer dans le panneau de séquence du logiciel d’imagerie, et en même temps déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à la vitesse constante de 6 μm/s à l’aide du traducteur motorisé.

Résultats

La configuration de nettoyage passif développée permet d’obtenir un cœur de souris adulte dégagé (avec une dimension de l’ordre de 10 mm x 6 mm x 6 mm) en environ 3 mois. Tous les composants de la configuration sont montés comme illustré à la Figure 1. Le gradient de température négligeable entre chaque chambre de dégagement (de l’ordre de 3°C) permet de maintenir la température dans une plage appropriée dans toutes les chambres.

Discussion

Dans ce travail, une approche réussie pour nettoyer, colorer et imager un cœur de souris entier à haute résolution a été introduite. Tout d’abord, un protocole de transformation tissulaire (CLARITY) a été optimisé et réalisé, légèrement modifié pour son application sur le tissu cardiaque. En effet, pour obtenir une reconstruction efficace en 3D de tout un cœur, il est indispensable de prévenir le phénomène de diffusion de la lumière. La méthodologie CLARITY nous permet d’obtenir un cœur intact tr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB