Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Résumé

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones.

Résumé

Le Ca²⁺ mitochondrial joue un rôle essentiel dans le contrôle de la mise en mémoire tampon cytosolique du Ca^2+, du métabolisme énergétique et de la transduction du signal cellulaire. La surcharge de Ca²⁺ mitochondrial contribue à diverses conditions pathologiques, y compris la neurodégénérescence et la mort cellulaire apoptotique dans les maladies neurologiques. Nous présentons ici une approche moléculaire spécifique au type cellulaire et ciblant les mitochondries pour l’imagerie mitochondriale Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Nous avons construit des plasmides d’ADN codant pour des indicateurs Ca²⁺ (GECI) génétiquement codés ciblant les mitochondries GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones gfaABC1D et CaMKII et une séquence de ciblage des mitochondries (mito-). Pour l’imagerie mitochondriale in vitro Ca^2+, les plasmides ont été transfectés dans des astrocytes et des neurones en culture pour exprimer GCaMP5G/6s. Pour l’imagerie mitochondriale in vivo Ca^2+, des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ont été préparés et injectés dans le cerveau des souris pour exprimer GCaMP5G/6s dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones. Notre approche fournit un moyen utile d’imager la dynamique mitochondriale du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones afin d’étudier la relation entre la signalisation cytosolique et mitochondriale du Ca^{2+, ainsi} que les interactions astrocyte-neurone.

Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires dynamiques et sont considérées comme les centrales cellulaires pour la production d’énergie. D’autre part, les mitochondries peuvent absorber le Ca²⁺ dans la matrice en réponse à des augmentations locales ou cytosoliques de Ca^2+. L’absorption mitochondriale de Ca²⁺ affecte la fonction mitochondriale, y compris les processus métaboliques tels que les réactions dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, et régule les protéines sensibles au Ca²⁺dans des conditions physiologiques^1,2,3,4. La surcharge mitochondriale de Ca²⁺ est également un déterminant de la mort cellulaire, y compris la nécrose et l’apoptose dans divers troubles cérébraux^5,6,7. Il provoque l’ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale (PTMP) et la libération de cofacteur caspase, qui déclenchent la mort cellulaire apoptotique. Par conséquent, il est important d’étudier la dynamique et la manipulation du Ca²⁺ mitochondrial dans les cellules vivantes pour mieux comprendre la physiologie et la pathologie cellulaires.

Les mitochondries maintiennent l’homéostasie de la matrice Ca²⁺ grâce à un équilibre entre l’absorption et l’efflux de Ca^2+. L’absorption mitochondriale de Ca²⁺ est principalement médiée par les uniporteurs mitochondriaux de Ca²⁺ (MCU), tandis que l’efflux mitochondrial de Ca²⁺ est médié par les échangeurs Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLX) et les échangeurs H⁺/ Ca^{2 +} (mHCX)⁸. L’équilibre peut être perturbé par la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)⁹. L’homéostasie mitochondriale Ca²⁺ est également affectée par la mise en mémoire tampon mitochondriale par la formation de complexes xCa²⁺-xPO₄x-xOH insolubles⁸.

Les changements intracellulaires et mitochondriaux de la concentration de Ca²⁺ ([Ca²⁺]) peuvent être évalués par des indicateurs de Ca²⁺ fluorescents ou luminescents. La liaison du Ca²⁺ aux indicateurs provoque des modifications spectrales, permettant l’enregistrement de cellules libres [Ca^2+]en temps réel dans des cellules vivantes. Deux types de sondes sont actuellement disponibles pour surveiller les changements de Ca²⁺ dans les cellules : les indicateurs chimiques organiques et les indicateurs ca²⁺ (GECI) codés génétiquement. Généralement, différentes variantes avec différentes affinités Ca²⁺ (basées sur K_d),des propriétés spectrales (longueurs d’onde d’excitation et d’émission), des plages dynamiques et des sensibilités différentes sont disponibles pour les questions biologiques étudiées. Bien que de nombreux indicateurs de Ca²⁺ organiques synthétiques aient été utilisés pour l’imagerie cytosolique du Ca^2+, seuls quelques-uns peuvent être chargés sélectivement dans la matrice mitochondriale pour l’imagerie mitochondriale ca^2+, Rhod-2 étant le plus largement utilisé (pour les revues, voir^10,11). Cependant, Rhod-2 présente un inconvénient majeur de fuite lors d’expériences à long terme; en outre, il est divisé entre les mitochondries, d’autres organites et le cytosol, ce qui rend difficiles les mesures absolues dans différents sous-compartiments. En revanche, en utilisant des promoteurs spécifiques au type cellulaire et des séquences de ciblage des compartiments subcellulaires, les GECI peuvent être exprimés dans différents types de cellules et compartiments subcellulaires pour l’imagerie Ca²⁺ spécifique aux cellules et aux compartiments in vitro ou in vivo. Les indicateurs GCaMP Ca²⁺ basés sur l’intensité de fluorescence à longueur d’onde unique sont récemment apparus comme des GECI majeurs^12,13, 14^,15,16. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour le ciblage des mitochondries et l’expression spécifique du type cellulaire de GCaMP5G et GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dans les astrocytes et les neurones, et l’imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca²⁺ dans ces types de cellules. En utilisant ce protocole, l’expression de GCaMP6G/6s dans les mitochondries individuelles peut être révélée, et l’absorption de Ca²⁺ en résolution mitochondriale unique peut être obtenue dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo.

Protocole

Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Missouri-Columbia.

1. Construction de plasmides d’ADN

REMARQUE: Pour l’imagerie in vitro et in vivo, des plasmides d’ADN codant GCaMP5G / 6s avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones et des séquences de ciblage mitochondrial sont construits.

1. Insérer la matrice mitochondriale (MM)-séquence de ciblage (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGGGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG¹⁷ dans les sites de clonage EcoRI et BamHI dans l’épine dorsale du plasmide du virus adéno-associé (AAV) pZac2.1 pour obtenir des plasmides contenant un promoteur astrocytaire gfaABC₁D ou un promoteur neuronal CaMKII^18,19,20.
2. Subclone GCaMP5G/6s dans les sites de clonage BamH I et Not 1 dans les plasmides ci-dessus pour obtenir de nouveaux plasmides pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s et pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s qui ciblent l’expression transgénique dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones^20,21 ( Figure1A).
3. Préparer les plasmides d’ADN pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G et pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s pour la transfection en vue d’une étude in vitro (section 2). Produire des vecteurs AAV avec le sérotype 5 pour les astrocytes et le sérotype 9 pour les neurones pour l’étude in vivo ¹⁸ (Section 3).

2. Imagerie mitochondriale in vitro ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones

1. Préparer les astrocytes primaires du cortex de souris néonatales P1 et les neurones primaires du cortex des embryons E15-16^18,22 ,^23,24, et les cultiver sur des couvertures de verre de 12 mm de diamètre dans des plaques de 24 puits en utilisant le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et le milieu neuronal basal (NBM) contenant 2% de B27, respectivement.
2. Transfecter les astrocytes et les neurones matures avec des plasmides pZac-gfaABC1D-GCaMP6s et pZac-CaMKII-GCaMP5G en utilisant un réactif de transfection à base de lipides pour exprimer GCaMP6s dans les mitochondries des astrocytes et GCaMP5G dans les mitochondries des neurones^18,20,21. Transfecter les cellules dans chaque puits avec 0,5 μg d’ADN, et changer le milieu 6 h plus tard.
   REMARQUE: Les astrocytes et les neurones sont prêts pour l’imagerie 1-2 jours après la transfection.
3. Effectuer une imagerie mitochondriale in vitro ca²⁺ 1-2 jours après la transfection.
   1. Transférer les couvercles de verre cultivés avec des astrocytes ou des neurones dans la chambre de perfusion PH-1 sous un microscope à épifluorescence ou à deux photons.
   2. Stimuler l’absorption astrocytaire mitochondriale de Ca²⁺ avec 100 μM d’ATP dans le LCF, ou stimuler les mitochondries neuronales avec 100 μM de glutamate/10 μM de glycine^20,25 (Figure 2 et Figure 3).
      REMARQUE: Les changements de solution de ACSF à ACSF contenant de l’ATP et du glutamate / glycine sont contrôlés par un système de perfusion ALA-VM8²¹. La vitesse du changement de solution est contrôlée à 1-2 mL/min en ajustant une vanne.

3. Imagerie mitochondriale in vivo Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones

1. Préparations AAV.
   1. Préparer les vecteurs du virus adéno-associé recombinant (rAAV) suivants à l’aide des plasmides d’ADN préparés à la rubrique 1 : vecteurs rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G et rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
      REMARQUE: Dans cette expérience, les vecteurs rAAV du sérotype 5 ont été préparés pour exprimer GCaMP5G dans les mitochondries dans les astrocytes et les vecteurs rAAV du sérotype 9 ont été préparés pour exprimer GCaMP6s dans les mitochondries dans les neurones.
2. Injection stéréotaxique d’AAV.
   1. Anesthésiez la souris avec 3% d’isoflurane.
      REMARQUE: Plus tard pendant la chirurgie, les niveaux d’isoflurane sont réduits à 2%.
   2. Une fois que la souris a atteint un niveau chirurgical d’anesthésie, déterminé par le pincement de la queue et des orteils, rasez les cheveux sur le site de la chirurgie, le cortex moteur ou somatosensoriel, avec une tondeuse à cheveux.
   3. Positionnez la souris sur le dispositif stéréotaxique de la souris et fixez la tête avec des barres d’oreille. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour les protéger pendant la chirurgie. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 °C tout au long de la chirurgie.
      REMARQUE: Effectuer une intervention chirurgicale en utilisant des procédures aseptiques. Tous les outils chirurgicaux doivent être stérilisés soit par autoclavage, soit par un stérilisateur de perles chaudes.
   4. Une fois la souris montée sur le dispositif stéréotaxique, stérilisez le cuir chevelu avec un gommage à base d’iode alterné et 70% d’éthanol trois fois. Faites une incision dans la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le site d’injection.
   5. Coupez la peau dans l’axe bregma-lamda et créez un trou de bavure d’environ 1 mm de diamètre avec une perceuse à grande vitesse à l’emplacement d’injection prévu du moteur ou du cortex somatosensoriel.
   6. Utilisez une seringue Hamilton de 33 G contenant le virus adéno-associé (vecteurs rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 10¹¹ GC] ou vecteurs rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 10¹¹ GC]) pour injecter jusqu’à 1 μL de virus dans la zone cible.
      REMARQUE: Par exemple, pour l’administration virale corticale, injecter la solution virale à deux profondeurs en plusieurs étapes. Tout d’abord, insérez l’aiguille à une profondeur de 1 mm de la dure-mère et laissez 5 min au cerveau pour récupérer. Ensuite, déplacez l’aiguille jusqu’à ~700 μm de profondeur et injectez 500 nL de la solution virale à une vitesse d’injection de 10 nL/s à l’aide d’une seringue hamilton contrôlée par un contrôleur de pompe à microsyringe. Une fois l’injection terminée, attendez 5 minutes pour permettre au virus de se diffuser dans le cerveau. Ensuite, déplacez l’aiguille jusqu’au deuxième emplacement d’injection à une profondeur de 300 μm. Ici, injectez 500 nL supplémentaires de la solution virale. Attendez 10 minutes pour permettre au virus de se diffuser dans le cerveau.
   7. Fermez le cuir chevelu et la peau à l’aide d’un adhésif tissulaire. Laissez les souris récupérer sur le coussin chauffant. Renvoyer les souris à l’animalerie après leur rétablissement.
3. Intstallation de la fenêtre crânienne et imagerie in vivo à deux photons (2-P) des signaux mitochondriaux Ca^2+.
   REMARQUE: L’implantation de la fenêtre crânienne se fait 3 semaines après l’injection d’AAV sur le cortex moteur ou somatosensoriel^26,27,28,29. Le carprofène (10 mg/kg) est injecté par voie sous-cutanée pour soulager la douleur potentielle avant la chirurgie. Les procédures chirurgicales de la fenêtre crânienne sont identiques aux procédures chirurgicales d’injection AAV et sont effectuées dans des conditions aseptiques.
   1. Anesthésiez la souris avec 3% d’isoflurane.
      REMARQUE: Il s’agit de la dose initiale et réduisez à 2% pour la chirurgie plus tard. Au cours de l’imagerie, une injection intrapéritonéale (IP) de 130 mg de kétamine/10 mg de xylazine/kg de poids corporel dissous dans le LCF est utilisée pour l’anesthésie.
   2. Positionnez la souris sur le dispositif stéréotaxique de la souris et fixez la tête avec des barres d’oreille. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 °C tout au long de la chirurgie.
      REMARQUE: Tous les outils chirurgicaux doivent être stérilisés.
   3. Faites une incision de 5 à 8 mm de long dans la ligne médiane du cuir chevelu et retirez un lambeau de peau à l’aide d’une paire de ciseaux.
   4. Une fois le crâne exposé, effectuer une craniotomie de 2,0 à 3,0 mm de diamètre à l’aide d’une perceuse à grande vitesse sur la zone injectée par le virus (c.-à-d. cortex moteur ou cortex somatosensoriel, figure 1B). Tout d’abord, faites quatre petits trous, puis percez dans un cercle reliant les trous. Ensuite, soulevez et retirez l’os avec des ciseaux tranchants et retirez-le. La dure-mère exposée peut être enlevée ou conservée intacte pour l’empantation de la fenêtre crânienne.
   5. Placez un couvercle en verre de 3 à 5 mm de diamètre portant un silicone transparent sur la craniotomie. Utilisez un cure-dent pour pousser doucement la fenêtre crânienne sur la surface du cerveau. Ensuite, scellez le bord avec une petite quantité d’adhésif en silicone.
      NOTES: Alternativement, au lieu d’un disque de silicone, 1,2% de gel d’agarose à faible point de fusion peut être utilisé entre le verre de couverture et le tissu cérébral.
   6. Enfin, scellez les bords du couvercle avec du ciment dentaire. Prenez soin d’appliquer légèrement le ciment au bord de la fenêtre crânienne pour un collage fort. Fixez une plaque de tête en métal sur mesure au crâne avec du ciment dentaire.
      REMARQUE: La plaque métallique est utilisée pour fixer la tête de la souris à l’étape du microscope 2-P pendant la séance d’imagerie (Figure 1C).
   7. Ajouter 0,5 mL de solution ACSF sur le couvercle de la fenêtre crânienne pour une immersion dans l’eau pendant l’imagerie.
   8. Effectuer une imagerie time-lapse in vivo 2-P de mito-GCaMP5G dans les astrocytes et mito-GCaMP6s dans les neurones d’une longueur d’onde de 910 nm à travers la fenêtre crânienne (Figure 1C)^18,20,27.
      REMARQUE: Pendant l’imagerie, les souris sont sur le coussin chauffant pour maintenir la température physiologique. Les souris seront sacrifiées immédiatement après la fin de la séance d’imagerie.
   9. Marquer les astrocytes in vivo avec la sulforhodamine 101 (SR101) lorsqu’il est nécessaire de déterminer la colocalisation.
      1. À la fin de l’étape 3.3.4, appliquer 100 μL de 100 μM SR101 dans ACSF sur la surface corticale pendant 1 à 5 min.
      2. Rincez la surface avec ACSF pour laver le SR101 non lié. En utilisant l’imagerie 2-P, le co-marquage de mito-GCaMP5G et SR101 dans les astrocytes peut être observé 45-60 min plus tard(Figure 4A).

Résultats

L’objectif de cette étude était de fournir une méthodologie pour imager les signaux mitochondriaux Ca²⁺ en utilisant des GECI dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Les résultats de l’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca²⁺ sont présentés ici.

Signalisation mitochondrialein vitro du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neu...

Discussion

Dans cet article, nous fournissons une méthode et un protocole pour l’imagerie des signaux mitochondriaux Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones. Nous avons mis en œuvre des stratégies de ciblage des mitochondries et de type cellulaire spécifiques pour exprimer GECI GCaMP5G/6s. Pour cibler GCaMP5G/6s dans les mitochondries, nous avons inclus une séquence de ciblage des mitochondries dans les plasmides. Pour exprimer GCaMP5G/6s dans les astrocytes et les neurones in vivo,nous avons inséré un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight