Modèle de saignement par transsection veineuse de la queue chez des souris hémophiliques A entièrement anesthésiées

Résumé

Le modèle de saignement par transsection de la veine caudale raffinée (TVT) chez les souris anesthésiées est une méthode in vivo sensible pour l’évaluation des saignements hémophiles. Ce modèle de saignement TVT optimisé utilise la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation, affinant d’autres modèles et évitant la mort comme critère d’évaluation.

Résumé

Les modèles de saignement de la queue sont des outils importants dans la recherche sur l’hémophilie, en particulier pour l’évaluation des effets du procoagulant. Le modèle de survie par transsection de la veine caudale (TVT) a été préféré dans de nombreux contextes en raison de la sensibilité aux doses cliniquement pertinentes de FVIII, tandis que d’autres modèles établis, tels que le modèle du clip de la queue, nécessitent des niveaux plus élevés de composés procoagulants. Pour éviter d’utiliser la survie comme critère d’évaluation, nous avons développé un modèle TVT établissant la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation et d’anesthésie complète pendant toute l’expérience. En bref, les souris anesthésiées sont positionnées avec la queue immergée dans une solution saline tempérée (37 ° C) et dosées avec le composé d’essai dans la veine latérale droite de la queue. Après 5 min, la veine latérale gauche de la queue est transectée à l’aide d’un guide modèle, la queue est retournée à la solution saline et tous les épisodes de saignement sont surveillés et enregistrés pendant 40 minutes tout en recueillant le sang. Si aucun saignement ne se produit à 10 min, 20 min ou 30 min après la blessure, le caillot est remis en question doucement en essuyant la coupe deux fois avec un tampon de gaze humide. Après 40 minutes, la perte de sang est quantifiée par la quantité d’hémoglobine saignée dans la solution saline. Cette procédure rapide et relativement simple se traduit par des saignements cohérents et reproductibles. Par rapport au modèle de survie TVT, il utilise une procédure plus humaine sans compromettre la sensibilité à l’intervention pharmacologique. En outre, il est possible d’utiliser les deux sexes, réduisant ainsi le nombre total d’animaux à élever, conformément aux principes des 3R. Une limitation potentielle dans les modèles de saignement est la nature stochastique de l’hémostase, qui peut réduire la reproductibilité du modèle. Pour contrer cela, la perturbation manuelle du caillot garantit que le caillot est remis en question pendant la surveillance, empêchant l’hémostase primaire (plaquette) d’arrêter le saignement. Cet ajout au catalogue de modèles de lésions hémorragiques offre une option pour caractériser les effets du procoagulant de manière standardisée et humaine.

Introduction

Les modèles animaux sont essentiels pour comprendre la pathogenèse de l’hémophilie et pour développer et tester des schémas thérapeutiques et des thérapies. La souris knock-out de facteur VIII (F8-KO) est un modèle largement utilisé pour l’étude de l’hémophilie A ^1,2. Ces souris récapitulent les principales caractéristiques de la maladie et ont été largement utilisées pour le développement de traitements, tels que les produits recombinants FVIII ^3,4,5 et les stratégies de thérapie génique ^6,7.

Il existe différents modèles de lésions hémorragiques pour évaluer les effets pharmacologiques de différents composés hémostatiques in vivo. L’un de ces modèles de coagulation est le modèle de survie par transsection de la veine caudale chez les souris ^{8,9,10,11,12,13,14}, mesurant la capacité des souris hémophiles à survivre à l’exsanguination après la transsection de la queue. Cette méthode a été introduite il y a plus de quatre décennies¹⁵ et est encore utilisée ^9,16,17. Cependant, le modèle utilise la survie comme critère d’évaluation et nécessite l’observation des animaux sur une période allant jusqu’à 24 heures, au cours de laquelle les animaux sont conscients et peuvent donc ressentir de la douleur et de la détresse.

Des modèles de saignement de plus courte durée et sous anesthésie complète ont été décrits précédemment, tels que le modèle de clip de queue (également connu sous le nom de pointe de la queue)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Néanmoins, pour une normalisation complète de la perte de sang après le défi hémorragique, ces modèles nécessitent des doses de composés procoagulants (par exemple, FVIII) beaucoup plus élevées que celles administrées cliniquement²⁹. Un modèle de blessure différent sous anesthésie, la méthode de saignement vena saphena, est sensible à des doses plus faibles de composés procoagulants³⁰, mais nécessite un niveau élevé d’intervention de l’expérimentateur car les caillots doivent être perturbés fréquemment (par opposition à 3 fois dans le modèle présenté).

La normalisation vers un protocole commun pour tester de nouveaux composés procoagulants faciliterait grandement la comparaison des données entre les laboratoires 31,32,33. Dans les modèles TVT, il n’y a pas encore d’accord commun sur les critères d’évaluation étudiés (perte de sang ^7,26, temps de saignement ^9,34 et taux de survie^35,36), et la durée expérimentale varie entre les études¹³.

Notre objectif principal est de décrire et de caractériser un modèle optimisé avec une reproductibilité élevée, la possibilité d’étudier à la demande ainsi qu’un traitement prophylactique, la sensibilité à l’intervention pharmacologique équivalente au modèle de survie, mais sans utiliser la mort ou la mort imminente comme critères d’évaluation. Afin de réduire la douleur et la détresse, les animaux ne doivent pas être conscients pendant les saignements et un critère d’évaluation plus éthique doit être mis en œuvre³⁷.

Les modèles de clip de queue sont généralement effectués dans l’une des deux variantes, soit en amputant l’extrémité de la queue, par exemple, l’amputation de 1-5 mm ^{18,19,20,21,23,24} ou, dans une variante plus sévère, transecté à un diamètre de queue d’environ 1-3 mm ^8,22,25 . Cela provoque un saignement artérioveineux combiné, car les veines latérales et dorsales et l’artère ventrale sont généralement sectionnées et, en général, plus l’amputation est importante, plus la sensibilité à un composé procoagulant est faible. De plus, comme l’extrémité de la queue est amputée, la blessure artérioveineuse est exposée sans aucun tissu opposé; ainsi, du moins en théorie, il est différent des saignements hémophiles les plus courants.

Comme son nom l’indique, seule la veine est blessée dans les modèles de transsection de la veine caudale tels que décrits dans cet article, entraînant ainsi un saignement exclusivement veineux. Étant donné que le vaisseau n’est pas complètement sectionné, la blessure devrait être plus petite que dans les modèles d’amputation, et le tissu autour de la coupure, auquel un caillot peut adhérer, est conservé. En outre, il y a une pression artérielle plus basse dans la veine par opposition à l’artère. Ces facteurs contribuent à une sensibilité accrue par rapport aux modèles d’amputation, de sorte que la normalisation des saignements peut être obtenue avec des doses cliniquement pertinentes de traitement de remplacement, par exemple avec le rFVIII dans l’hémophilie A, ce qui est utile pour évaluer l’ampleur et la durabilité des effets du traitement par procoagulant 26,38,39.

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Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par l’organisme de bien-être animal de Novo Nordisk A/S et l’Inspection danoise de l’expérimentation animale, ministère danois de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche. La méthode optimisée de 40 minutes inclut l’anesthésie et le temps de dosage dans la conception (Figure 1). Des souris hémophiles des deux sexes âgées de 10 à 16 semaines sont nécessaires pour cette procédure.

1. Préparatifs avant l’étude

1. Préparer les solutions posologiques aux concentrations correctes.
2. Démarrez le bain-marie et chauffez à 37 °C. Remplissez les tubes de centrifugeuse de 15 mL pour la collecte de sang avec une solution saline (0,9% NaCl).
3. Placez les tubes salins de 15 mL dans les trous de la plaque de base chauffée au moins 15 minutes avant le début de l’expérience.
4. Identifiez les souris et enregistrez leur poids. Évitez de manipuler des souris plus que nécessaire, car cela peut causer du stress et affecter l’étude.
5. Préparez le poste de travail dans la hotte avant de continuer afin que tout soit à portée de main : serviettes, porte-queue, gaze, seringues, scalpels, chronomètres et papier de notation du flux sanguin.
6. Placez la marque de queue et les blocs de coupe sur la plaque chauffante - les blocs froids feront contracter les veines et affecteront ainsi le saignement.

2. Anesthésie

1. Effectuer la procédure d’anesthésie à l’isoflurane à l’intérieur d’une hotte.
2. Réglez le vaporisateur de gaz à 5% d’isoflurane dans 30% O₂/70% N₂O dans la chambre d’anesthésie avec un débit de 1 L / min. Prévoyez suffisamment de temps pour que la chambre d’anesthésie se remplisse (environ 5 minutes en fonction du volume de la chambre et du débit de gaz). Assurez une induction rapide (moins d’une minute).
3. Placez les souris dans la chambre d’anesthésie jusqu’à ce qu’elles perdent connaissance.
   REMARQUE: Cela devrait se produire dans une minute ou moins si la chambre est suffisamment remplie.
4. Assurer une bonne anesthésie par l’absence de réponse douloureuse au réflexe de pédale (pincement ferme de l’orteil).
5. Placez les souris sur la plaque chauffante, en vous assurant que le nez est dans le cône de nez.
6. Réduire l’anesthésie à un niveau d’entretien de 2% d’isoflurane dans 30% O₂/70% N₂O et placer un couvercle en plastique au-dessus des souris pour réduire la perte de chaleur. Appliquez une pommade oculaire appropriée pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
7. Marquez la queue à un diamètre de 2,5 mm à l’aide du bloc de marquage de queue. Ne forcez pas la queue dans la fente du bloc - elle doit s’adapter parfaitement (Figure supplémentaire 1)
8. Placez la queue dans le tube salin pendant au moins 5 minutes pour assurer une veine caudale chaude qui est optimale pour le dosage intraveineux (i.v.).

3. Dosage de la solution d’essai

1. Placez une souris dans le porte-queue avec le nez dans un masque d’anesthésie.
2. Dosez l’animal avec le composé d’intérêt (dans ce cas, rFVIII) et démarrez immédiatement le chronomètre (t = 0).
3. Replacez la souris sur la plaque chauffante avec la queue dans le tube salin. Répétez la procédure avec les autres souris.

4. Effectuer la transsection de la veine caudale

1. Effectuer la transsection de la veine caudale exactement 5 min après l’administration. Placez la queue dans le bloc de coupe et tournez de 90° pour exposer la veine (Figure supplémentaire 2).
2. Effectuer la coupe du côté opposé / de la veine à partir de laquelle la solution d’essai a été dosée.
3. Dessinez la lame de scalpel #11 à travers la fente du bloc de coupe qui maintient la queue pour créer un saignement. Réinitialisez le chronomètre et retournez immédiatement la queue à la solution saline.

5. Temps d’observation et défis

1. Observez le saignement et annotez le début et l’arrêt du saignement pendant 40 minutes; annotez-le sur le papier de notation du flux sanguin.
   REMARQUE: Cette évaluation visuelle des saignements peut varier légèrement en raison de la subjectivité.
2. Le saignement primaire doit cesser dans les 3 minutes suivant la coupure. Si ce n’est pas le cas, disqualifiez la souris, euthanasiez-la et remplacez-la (le fait de ne pas arrêter le saignement primaire peut indiquer une blessure trop grave ou un manque d’hémostase primaire, comme chez les souris KO vWF).
3. S’il n’y a pas de saignement à 10 min, 20 min et 30 min après la blessure, remettez la queue au défi comme décrit aux étapes 4 à 5.
4. Utilisez un tampon de gaze imbibé d’une solution saline chaude provenant d’un tube séparé conservé au bain-marie. Soulevez la queue de la solution saline et essuyez doucement deux fois avec la gaze humide dans une direction distale sur la coupe de la queue.
5. Après chaque défi, ré-immergez immédiatement la queue dans le tube salin à nouveau.
6. À t = 40 min, arrêtez la collecte de sang en retirant la queue du tube salin.

6. Prélèvement sanguin

1. Après t = 40 min, obtenir des échantillons de sang de la veine supraorbitaire.

7. Euthanasie

1. Euthanasier les souris par luxation cervicale alors qu’elles sont encore sous anesthésie complète.

8. Traitement des échantillons

1. Centrifuger les tubes de prélèvement sanguin de 15 mL avec une solution saline à 4000 x g pendant 5 min à température ambiante.
2. Jeter le surnageant des tubes de 15 mL, remettre la pastille dans 2 à 14 mL de solution de lysage des érythrocytes (RBC), puis la diluer jusqu’à ce qu’elle atteigne une couleur de café claire.
3. Notez le volume total (volume de sang + volume d’érythrocytes (RBC) solution de lysage ajoutée à l’aide des marques de graduation sur le tube).
4. Transférer 2 mL de la dilution dans un tube d’hémoglobine et réfrigérer jusqu’à l’analyse de l’hémoglobine.
5. Déterminez la perte de sang en mesurant la concentration d’hémoglobine dans la solution saline. Mesurer l’absorbance à 550 nm sur un lecteur de microplaques (Table des matériaux).
6. Convertir l’absorbance en hémoglobine nmol à l’aide d’une courbe standard préparée à partir d’hémoglobine humaine (table des matériaux) et corriger la dilution avec une solution de lysage RBC.

9. Analyses statistiques

1. Analysez les données à l’aide d’un logiciel approprié. Ici, le logiciel GraphPad Prism a été utilisé. Au cours d’une gamme d’études, les méthodes statistiques suivantes se sont avérées efficaces.
   REMARQUE: Pour analyser la perte de sang, le temps de saignement, l’exposition, la numération plaquettaire et l’hématocrite; Le test ANOVA de Brown-Forsythe et Welch a été utilisé (car les données étaient continues mais sans homogénéité de variance des résidus) en appliquant le test de Dunnett pour tenir compte de comparaisons multiples. Un test de Pearson a été utilisé pour tester les corrélations entre le temps de saignement, la perte de sang et les doses. Pour déterminer les valeurs ED₅₀ , une équation de réponse logarithmique inverse (dose) à quatre paramètres a été ajustée aux données sur les saignements et les pertes de sang. Pour analyser l’effet de genre, un test ANOVA bidirectionnel a été utilisé, en appliquant la correction de Bonferroni pour ajuster les comparaisons multiples. Le niveau de signification a été défini comme P < 0,05. Les données sont affichées comme moyens ± SEM.

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Résultats

Pour évaluer l’applicabilité du modèle optimisé, une étude a été réalisée chez des souris F8-KO (C57BL genetic background) administrées avec une thérapie de remplacement du facteur VIII recombinant disponible dans le commerce (rFVIII); quatre doses différentes ont été testées : 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg et 20 UI/kg. De plus, nous avons testé le témoin correspondant du véhicule (négatif) chez des souris F8-KO et un groupe de type sauvage (WT) en utilisant des souris C57BL comme groupe témoin positif...

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Discussion

Cette méthode optimisée de transsection de la veine caudale (TVT) présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de survie TVT. Les animaux sont entièrement anesthésiés pendant toute la durée de l’étude, ce qui facilite la manipulation des souris et augmente le bien-être des animaux. De plus, contrairement au modèle de survie TVT, l’observation de nuit n’est pas nécessaire, et ce modèle optimisé offre la possibilité de mesurer la perte de sang et d’observer le temps de saignement exact sur ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo