Approche génétique inverse pour identifier les régulateurs de pigmentation à l’aide du poisson zèbre

Résumé

Les régulateurs des fonctions mélanocytaires régissent les différences visibles dans le résultat de la pigmentation. Déchiffrer la fonction moléculaire du gène de pigmentation candidat pose un défi. Ici, nous démontrons l’utilisation d’un système modèle de poisson zèbre pour identifier les candidats et les classer en régulateurs de la teneur en mélanine et du nombre de mélanocytes.

Résumé

Les mélanocytes sont des cellules spécialisées dérivées de la crête neurale présentes dans la peau épidermique. Ces cellules synthétisent un pigment de mélanine qui protège le génome des rayons ultraviolets nocifs. Les perturbations du fonctionnement des mélanocytes entraînent des troubles pigmentaires tels que le piébaldisme, l’albinisme, le vitiligo, le mélasma et le mélanome. Le poisson zèbre est un excellent système modèle pour comprendre les fonctions des mélanocytes. La présence de mélanocytes pigmentés visibles, la facilité de manipulation génétique et la disponibilité de lignées fluorescentes transgéniques facilitent l’étude de la pigmentation. Cette étude utilise l’utilisation de lignées de poissons-zèbres de type sauvage et transgéniques qui entraînent l’expression de protéines fluorescentes vertes (GFP) sous les promoteurs mitfa et tyrp1 qui marquent différents stades des mélanocytes.

Le silençage morpholino des gènes candidats est réalisé pour évaluer le résultat phénotypique sur la pigmentation larvaire et est applicable au dépistage des régulateurs de pigmentation. Ce protocole démontre la méthode de microinjection à l’imagerie et à la dissection basée sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de phénotypes en utilisant deux gènes candidats, l’anhydrase carbonique 14 (Ca14) et une variante d’histones (H2afv), pour évaluer de manière exhaustive le résultat de la pigmentation. De plus, ce protocole démontre la ségrégation des gènes candidats en spécificateurs et différenciateurs de mélanocytes qui modifient sélectivement le nombre de mélanocytes et la teneur en mélanine par cellule, respectivement.

Introduction

Alors que l’utilisation de la mélanine pour la photoprotection a évolué plusieurs fois dans le règne animal, les vertébrés ont apparemment perfectionné le processus. Les cellules productrices de pigments dédiées avec une machinerie élaborée pour synthétiser et contenir la mélanine sont conservées des poissons aux humains¹. Cependant, le résultat de la pigmentation est considérablement varié, allant de la couleur à la récipience et se présente sous forme de motifs vifs sur les téguments, la peau et les cheveux². Malgré la diversité, le répertoire des gènes impliqués dans la réponse pigmentaire est remarquablement conservé. Les composants de base de la machinerie de synthèse de mélanine, tels que les enzymes clés de synthèse de mélanine, les composants des mélanosomes et la connectivité en amont à la voie de signalisation, restent essentiellement identiques d’un organisme à l’autre. Des différences génétiques subtiles entraînent des changements spectaculaires dans les schémas de pigmentation observés chez les espèces³. Ainsi, une approche génétique inverse chez un organisme vertébré inférieur, le poisson-zèbre (Danio rerio), offre une excellente occasion de déchiffrer l’implication des gènes dans le rendu de l’état pigmenté⁴.

Les embryons de poisson zèbre se développent à partir d’un zygote fécondé unicellulaire à une larve dans un laps de ~24 h après la fécondation (HPF)⁵. Il est frappant de constater que les cellules équivalentes aux mélanocytes - les mélanophores - sont de grandes cellules présentes dans le derme et qui sont visibles en raison de la teneur en mélanine foncée⁶. Ces cellules dérivées de la crête neurale émanent ~11 hpf et commencent à pigmenter ~24 hpf ^6,7. Les modules d’expression génique conservés ont permis d’identifier des facteurs clés qui orchestrent les fonctions mélanocytaires et ont conduit au développement de lignées de rapporteurs fluorescents transgéniques Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) et Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 qui marquent des stades sélectifs du développement des mélanocytes. L’utilisation de ces lignées de poissons transgéniques permet d’interroger la biologie cellulaire des mélanocytes au niveau de l’organisme dans le contexte tissulaire avec des indices appropriés en fonction des délais de développement. Ces rapporteurs complètent la quantification pigmentaire des mélanocytes et permettent une évaluation distincte du nombre de mélanocytes, quelle que soit la teneur en mélanine.

Cet article fournit un protocole détaillé pour déchiffrer la biologie des mélanocytes en évaluant deux paramètres critiques, à savoir la teneur en mélanine et le nombre de mélanocytes. Alors que le premier est une lecture fonctionnelle commune émanant d’une réponse d’hypopigmentation, le second est associé à une réduction de la spécification ou de la survie des mélanocytes et est souvent associé à des conditions de dépigmentation génétique ou acquise. La stratégie globale de ce dépistage génétique inverse consiste à réduire au silence certains gènes à l’aide d’un morpholino et à étudier les résultats spécifiques aux mélanocytes. La teneur en mélanine est analysée à l’aide d’une quantification par image des valeurs moyennes de gris, suivie d’une confirmation à l’aide d’un test de teneur en mélanine. Le nombre de mélanocytes à différents stades de maturation est analysé à l’aide d’une quantification basée sur l’image et confirmé à l’aide de l’analyse FACS. Ici, le protocole de dépistage est démontré à l’aide de deux gènes candidats, à savoir l’anhydrase carbonique 14, impliquée dans la mélanogénèse, et une variante d’histones H2AFZ.2 impliquée dans la spécification des mélanocytes de la population précurseur de la crête neurale. Alors que le premier modifie la teneur en mélanine et non le nombre de mélanocytes, le second modifie le nombre de mélanocytes spécifiés et, par conséquent, la teneur en mélanine de l’embryon. Dans l’ensemble, cette méthode fournit un protocole détaillé pour identifier le rôle d’un gène candidat dans la pigmentation et distinguer son rôle dans le contrôle du nombre de mélanocytes par rapport à la teneur en mélanine.

Protocole

Les expériences sur le poisson zèbre ont été réalisées en stricte conformité avec l’approbation institutionnelle de l’éthique animale (IAEC) du CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Inde (proposition n ° 45a). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale.

1. Injection de morpholino dans des embryons de poisson zèbre

1. À l’aide d’un extracteur d’aiguille standard, tirez des pipettes très tranchantes et à bout fermé.
2. Charger la solution contenant du morpholino dans les micropipettes à l’aide d’une pointe de microchargeur et l’insérer dans l’appareil de micro-injecteur. Serrez correctement la vis pour verrouiller la micropipette.
   NOTE: La normalisation posologique des morpholinos est nécessaire. La posologie appropriée a un taux de survie de >70% et un phénotype spécifique à 24 hpf.
3. Coupez l’extrémité de la micropipette à l’aide d’une pince fine et étalonnez-la¹¹.
4. Pour étalonner, injecter 1 volume de solution morpholino dans le tube capillaire à partir de la micropipette, en maintenant le temps d’injection à 1 s. Répétez cette opération cinq fois. En utilisant la norme, 1 mm = 30 nL de volume, trouvez le volume injecté en 5 s en maintenant le tube capillaire contre une échelle de mesure. À l’aide des informations ci-dessus, calculer le temps (en secondes) nécessaire pour injecter 1 à 3 nL par injection¹².
   NOTE: La norme, 1 mm = 30 nL, est spécifique aux réglages de pression du micro-injecteur et au diamètre du capillaire utilisé pour l’étalonnage. Idéalement, l’injection doit être faite dans l’interface vitelline-cellule, qui se forme dans les 15-20 minutes après la fécondation. Pour faciliter les injections multiples, le développement peut être légèrement retardé en maintenant les embryons à une température plus basse (18 °C). Cependant, cela devrait être réduit au minimum et ne pas se prolonger au-delà de 30 minutes en raison de l’effet cumulatif de la température plus basse sur les changements d’expression génique.
5. Monter les embryons sur une boîte de Petri coulée à l’agarose (60 mm). Empiler les embryons étroitement dans les crêtes. À l’aide de pipettes en verre poli au feu, alignez-les dans la bonne orientation pour l’injection.
6. Au microscope, utilisez des manipulateurs pour rapprocher la micropipette de l’embryon et injectez à l’intérieur de l’interface vitellin-cellule en appuyant sur la pédale de commande.
7. Injecter tous les embryons de la même manière; les recueillir dans une boîte de Petri contenant de l’eau embryonnaire fraîche et les incuber à 28 °C.
8. Vérifiez les embryons injectés après 6-8 h. Retirez tous les embryons morts identifiables en raison de leur grande opacité et continuez à changer l’eau de l’embryon au moins une fois par jour pour éviter l’infection.

2. Analyse de la pigmentation

1. Préparation pour compter les mélanophores médians latéraux dans 3 embryons de poisson-zèbre dpf
   1. Traiter les embryons avec 0,016% d’anesthésique neuromusculaire pour les immobiliser.
   2. Pour monter les embryons pour l’imagerie, ajoutez quelques millilitres de méthylcellulose à 1,5-2% dans la boîte de Petri (60 mm) afin qu’elle forme une fine couche. À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever les embryons et les positionner doucement dans la méthylcellulose pour limiter tout mouvement ultérieur pendant l’imagerie.
   3. Ajustez leur position pour une imagerie latérale optimale (bande dorsale, bande ventrale, bande vitelline et mélanophores de la ligne médiane) ou dorsale (mélanophores sur la partie dorsale de la tête). Pour une meilleure résolution des mélanophores adjacents, image à un grossissement plus élevé (>5x)
2. Imagerie en fond clair
   REMARQUE: L’imagerie en fond clair est réalisée à l’aide d’un stéréomicroscope avec un grossissement de 8 à 10x.
   1. Placez la boîte de Petri contenant les embryons de poisson zèbre au microscope. À l’aide d’un manipulateur, ajuster le poisson dans une telle orientation de manière à ce que les cinq bandes embryonnaires mélanocytaires soient visibles simultanément (dorsale, ventrale, deux latérales, vitelline) (figure 1C). Capturez rapidement des images à l’aide du logiciel d’acquisition. Dans le cas où l’animal retrouve son mouvement avant d’être imagée, le replonger dans un anesthésique et procéder à l’imagerie une fois qu’il est suffisamment immobilisé.
   2. Répétez cela avec tous les poissons et assurez-vous que le grossissement reste le même pour chaque image.
3. Calcul de la valeur moyenne du gris à l’aide du logiciel ImageJ
   1. Prenez des images dorsales et latérales de 2 embryons de poisson-zèbre dpf.
   2. Ouvrez l’image à quantifier dans ImageJ à l’aide de l’outil Ouvrir . Utilisez l’outil de forme à main levée pour délimiter la zone à analyser. Accédez à l’option Définir les mesures et sélectionnez Valeur de gris moyenne | zone. Appuyez sur M (ou Analyser | Mesure) pour calculer la valeur moyenne de gris pour la zone sélectionnée.
   3. En gardant la zone à analyser constante, calculez la zone grise moyenne pour chaque animal séparément.
   4. Tracez un graphique à barres avec les données acquises (Figure 2F).
4. Dosage de la mélanine
   1. À 2 dpf, utilisez une pipette Pasteur en verre pour prélever ~25 embryons de poisson zèbre.
   2. Effectuer la déchorionation manuelle à l’aide d’aiguilles à insuline de 1 mL et les ajouter à des tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL.
   3. Jeter soigneusement le milieu embryonnaire et ajouter 1 mL de tampon de lyse glacée (phosphate de sodium 20 mM (pH 6,8), 1% Triton X-100, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM) avec cocktail inhibiteur de protéase et préparer des lysats de protéines par sonication.
   4. Dissoudre les lysats dans 1 mL de 1 N NaOH et incuber les échantillons à 100 °C pendant 50 min au bain-marie. Vortex par intermittence pour homogénéiser complètement les lysats.
   5. Prendre des lectures d’absorbance des échantillons à 490 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
   6. Calculer la teneur en mélanine en comparant l’absorbance de l’échantillon à une courbe standard des concentrations connues de mélanine synthétique (Figure 2G).

3. Nombre de mélanophores

NOTE: L’analyse de fluorescence dans les embryons de poisson zèbre transgénique peut être effectuée par deux méthodes: 1) compter les cellules GFP positives; 2) mesurer l’intensité de fluorescence.

1. Préparation pour le comptage basé sur FACS des cellules GFP positives chez les embryons précoces de poisson-zèbre
   1. Prélever 200 à 250 embryons ftyrp:GFP et les laver dans une passoire avec de l’eau d’embryon ordinaire. En tant que contrôle négatif, traiter les embryons de type sauvage (Assam Wildtype) à la GFP négative et appariés^{au stade 12}.
   2. Selon le stade d’intérêt, transférer les embryons dans une boîte de Petri contenant 0,6 mg/mL de pronase. Après 5-10 min, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les embryons déchorionnés dans une boîte de Petri fraîche contenant de l’eau embryonnaire ordinaire. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélever ~100 embryons et les transférer dans un tube microcentrifuge de 2 mL.
   3. Jeter soigneusement le milieu et ajouter 200 μL de solution de Ringer glacée (tampon de dyolking). En gardant le tube sur la glace, pipeter le contenu de haut en bas ~ 20 fois jusqu’à ce que le jaune soit dissous. Centrifuger les tubes à 100 × g pendant 1 min dans une centrifugeuse de table à 4 °C. Centrifuger à nouveau et jeter soigneusement le surnageant.
   4. À l’aide d’une pipette de 1 mL, transférer les embryons éblouis dans une boîte de Pétri contenant 10 mL de solution de trypsine (tampon de dissociation cellulaire). Exécutez-le dans plusieurs boîtes de Petri pour éviter le surpeuplement des embryons et la trypsinisation inefficace. Utilisez une pipette de 1 mL, mélangez la solution contenant les corps embryonnaires une ou deux fois pour diminuer l’agrégation.
   5. Incuber les boîtes de Petri à température ambiante pendant 15 min (<24 embryons hpf) ou 30 min (24-30 hpf embryons). Aspirer et distribuer la suspension de temps en temps à l’aide d’une pipette de 1 mL pour faciliter la désintégration des cellules.
   6. Pendant la période d’incubation, initialisez l’appareil de cytomètre en flux pour le comptage cellulaire.
   7. Placer une crépine cellulaire de 70 μm au-dessus d’un tube conique de 50 ml et faire passer la suspension trypsinisée à travers la crépine pour obtenir une suspension unicellulaire. Lavez la vaisselle de Petri avec la même suspension plusieurs fois pour éliminer les cellules collées à la surface.
   8. Faire tourner les échantillons à 450 × g, 4 °C pendant 5 min dans un rotor de godet oscillant.
   9. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 ml de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS).
   10. Essorer à nouveau à 450 × g, 4 °C pendant 5 min et jeter le surnageant.
   11. Enfin, remettre en suspension la pastille dans du PBS + 5% de sérum fœtal bovin et la garder sur la glace jusqu’à ce que le FACS fonctionne.
2. Préparation du cytomètre en flux
   1. Allumez le cytomètre en flux et lancez le démarrage.
      REMARQUE: Avant d’allumer la machine, videz la poubelle et remplissez le réservoir de liquide de la gaine.
   2. Normaliser le débit du flux pour une buse de 70 μm (ou 85 μm). Laissez-le intact pendant 10-15 minutes s’il est instable.
3. Comptage de cellules marquées par fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux
   1. Initialisez un nouveau dossier d’expérience et créez un nuage de points de diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale et un histogramme de l’intensité de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
   2. Chargez d’abord les cellules de type sauvage pour régler les portes de dispersion avant et latérale (pour exclure les doublets et les débris) et le seuil FITC.
   3. Une fois les portes posées, retirez l’échantillon et chargez les cellules isolées des embryons Tg(ftyrp1:GFP) pour compter les mélanocytes.
      REMARQUE: Ici, comme ftyrp1: GFP étiquette spécifiquement les mélanocytes matures, le nombre de cellules GFP-positives sous la porte FITC correspondra au nombre de mélanocytes.
   4. Répétez l’étape ci-dessus avec des échantillons morpholino-injectés pour estimer et comparer le nombre de mélanocytes avec le témoin.
4. Mesure de l’intensité de fluorescence chez les embryons de poisson zèbre
   1. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélever 100 à 120 embryons et les transférer dans une boîte de Petri contenant de l’eau d’embryon ordinaire.
   2. À ~10-12 hpf, transférer les embryons à 0,003% 1-phényl-2-thiourée pour inhiber la pigmentation.
   3. Effectuer une déchorionation manuelle à l’aide d’aiguilles à insuline pour l’imagerie d’embryons <48 hpf.
   4. Pour immobiliser les embryons, traitez-les avec 0,016% de tricaïne.
   5. Pour monter des embryons pour l’imagerie, mettez quelques mL de méthylcellulose à 1,5-2% dans la boîte de Petri (60 mm) afin qu’elle forme une fine couche. Ajouter les embryons à la méthylcellulose pour restreindre tout mouvement ultérieur pendant l’imagerie. Placez la boîte de Petri contenant les échantillons au microscope. À l’aide d’une pointe de pipette, ajustez l’animal dans l’orientation souhaitée.
   6. Acquérir des images à l’aide du logiciel d’acquisition. Pour les embryons <24 hpf, capturer l’embryon entier à la fois sous un grossissement de 10x. Pour >24 étages hpf, acquérir plusieurs champs de balayage et ensuite les assembler (coudre) ensemble.
   7. Répétez cette opération avec tous les poissons et assurez-vous que le réglage d’acquisition reste constant tout au long de l’expérience.
5. Quantification
   1. Analysez davantage l’image à l’aide du logiciel ImageJ.
   2. Ouvrez l’image à quantifier dans ImageJ à l’aide de l’outil Ouvrir .
   3. Utilisez l’outil de forme à main levée pour délimiter la zone à analyser (Figure 3E).
   4. Appuyez sur M (ou Analyser | Mesure) pour acquérir une mesure de l’intensité de la zone sélectionnée .
   5. En gardant la zone à analyser constante, calculez l’intensité moyenne par zone pour chaque animal séparément.

Résultats

Le flux de travail décrit à la figure 1 a été utilisé pour effectuer une perturbation génétique basée sur le morpholino au stade unicellulaire du poisson zèbre. L’analyse de la pigmentation a été effectuée à l’aide de diverses méthodes, comme mentionné ci-dessous. Pour illustrer les résultats représentatifs, des volumes standardisés de morpholino antisens ciblant les gènes h2afv et ca14 ont été injectés dans le stade vitellin ou unicellulaire de l?...

Discussion

Le phénotype de pigmentation se manifeste souvent par des altérations de la teneur en mélanine ou du nombre de mélanocytes pigmentaires. La méthode décrite ici permet la dissection de cette dichotomie et permet une évaluation qualitative et quantitative de la teneur en mélanine et du nombre de mélanophores par embryon, quelle que soit la teneur en mélanine. La fécondité élevée du poisson zèbre, la nature visible des mélanocytes pigmentés et l’absence de transfert de mélanosomes permettent la dissectio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization