Visualisation de la dynamique des microtubules plus-end dans le modèle de la maladie de Huntington basé sur les fibroblastes de la peau primaire humaine

Résumé

Ce protocole est dédié à la visualisation des microtubules par transfection de la protéine EB3 afin d’étudier leurs propriétés dynamiques en culture cellulaire primaire. Le protocole a été mis en œuvre sur des fibroblastes cutanés primaires humains obtenus chez des patients atteints de la maladie de Huntington.

Résumé

La transfection avec une protéine marqueur d’intérêt marquée par fluorescence en combinaison avec la microscopie vidéo time-lapse est une méthode classique d’étude des propriétés dynamiques du cytosquelette. Ce protocole offre une technique de transfection des fibroblastes primaires humains, ce qui peut être difficile en raison des spécificités des conditions de culture cellulaire primaire. De plus, le maintien des propriétés dynamiques du cytosquelette nécessite un faible niveau de transfection pour obtenir un bon rapport signal/bruit sans provoquer de stabilisation des microtubules. Il est important de prendre des mesures pour protéger les cellules du stress induit par la lumière et de la décoloration des colorants fluorescents. Au cours de nos travaux, nous avons testé différentes méthodes et protocoles de transfection ainsi que différents vecteurs afin de sélectionner la meilleure combinaison de conditions adaptées aux études de fibroblastes primaires humains. Nous avons analysé les vidéos time-lapse résultantes et calculé la dynamique des microtubules à l’aide d’ImageJ. La dynamique des extrémités plus des microtubules dans les différentes parties cellulaires n’est pas similaire, nous avons donc divisé l’analyse en sous-groupes - la région centrosome, la lamelle et la queue des fibroblastes. Notamment, ce protocole peut être utilisé pour l’analyse in vitro de la dynamique du cytosquelette dans les échantillons de patients, permettant la prochaine étape vers la compréhension de la dynamique des différents développements de la maladie.

Introduction

La maladie de Huntington (MH) est une pathologie neurodégénérative incurable causée par un gène mutationnaire codant pour la protéine de lahuntingtine (HTT). HTT est principalement associé aux vésicules et aux microtubules et est probablement impliqué dans les processus de transport dépendants des microtubules^1,2. Pour étudier l’influence de l’HTT mutant sur la dynamique des microtubules, nous avons utilisé la visualisation in vitro de la protéine EB3, qui régule les propriétés dynamiques des microtubules en liant et en stabilisant les extrémités plus en croissance. Pour charger de l’EB3 marqué par fluorescence dans des fibroblastes de peau humaine, une transfection plasmidique a été appliquée. Nous avons utilisé la culture primaire de fibroblastes obtenue à partir de la biopsie cutanée des patients MH pour cette étude.

La mutation du gène de la protéine HTT entraîne l’allongement du tractus de la polyglutamine³. HTT a un rôle dans des processus cellulaires tels que l’endocytose⁴, le transport cellulaire^1,2, la dégradation des protéines⁵, etc. Une partie substantielle de ces processus implique divers éléments du cytosquelette cellulaire, y compris les microtubules.

Les cellules primaires humaines sont le meilleur modèle pour reproduire le plus fidèlement possible les événements qui se produisent dans les cellules des patients. Pour créer de tels modèles, il faut isoler des cellules à partir de matériel de biopsie humaine (par exemple, à partir d’échantillons chirurgicaux). La lignée cellulaire primaire résultante convient à l’étude de la pathogenèse à l’aide de diverses méthodes génétiques, biochimiques, moléculaires et de biologie cellulaire. En outre, les cultures de cellules primaires humaines servent de précurseur pour la création de diverses cultures transdifférenciées et^{transgéniques 6}.

Cependant, contrairement aux cultures cellulaires immortalisées, l’inconvénient significatif des cellules primaires est leur capacité de passage limitée. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser des cellules au stade des premiers passages (jusqu’à 15). Les cultures plus anciennes dégénèrent très rapidement, perdant leurs propriétés uniques. Ainsi, les cellules primaires nouvellement obtenues doivent être conservées congelées pour un stockage à long terme.

Les cultures cellulaires primaires sont sensibles aux conditions de culture. Par conséquent, ils nécessitent souvent des approches uniques et une optimisation des conditions de croissance. En particulier, les fibroblastes primaires de la peau humaine utilisés dans nos expériences sont exigeants sur le substrat. Par conséquent, nous avons utilisé divers revêtements supplémentaires (par exemple, de la gélatine ou de la fibronectine) en fonction du type d’expérience.

Le cytosquelette cellulaire détermine la forme, la mobilité et la locomotion de la cellule. La dynamique du cytosquelette est cruciale pour de nombreux processus intracellulaires à la fois dans l’interphase et la mitose. En particulier, les cytosquelettes polymérisés à partir de la tubuline sont des structures hautement dynamiques et polaires, permettant un transport intracellulaire dirigé médié par les protéines motrices. Les extrémités des microtubules sont en réarrangement constant, leurs phases d’assemblage alternent avec les phases de démontage, et ce comportement est appelé « instabilité dynamique »^7,8,9. Diverses protéines associées modifient l’équilibre de la réaction de polymérisation, conduisant soit à la formation de polymères, soit à la formation de monomères protéiques. L’ajout de sous-unités de tubuline se produit principalement à l’extrémité supérieure des microtubules¹⁰. La famille des protéines de liaison terminale (EB) se compose de trois membres : EB1, EB2 et EB3. Ils servent de protéines de suivi des extrémités plus (+TIP) et régulent les propriétés dynamiques des microtubules en se liant et en stabilisant leurs extrémités supérieures en croissance¹¹.

De nombreuses études utilisent la micro-injection ou la transfection de tubuline marquée par molécule fluorescente avec imagerie time-lapse et analyse vidéo pour visualiser les microtubules in vitro. Ces méthodes peuvent être invasives et nocives pour les cellules, en particulier les cellules humaines primaires. L’étape la plus difficile consiste à trouver les conditions de transfection cellulaire. Nous avons essayé d’atteindre le plus haut niveau possible de transfection sans affecter la viabilité et la morphologie cellulaire native. Cette étude applique la méthode classique pour étudier les différences dans la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés de donneurs sains et de patients atteints de la maladie de Huntington.

Protocole

Ce protocole suit les directives du Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine de la Federal Medical Biological Agency datées du 8 septembre 2015.

REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu du protocole.

1. Obtention d’une culture primaire de fibroblastes cutanés humains (Figure 2)

1. Administrer la biopsie à un laboratoire en quelques heures dans le milieu Modifié Eagle Media (DMEM) de Dulbecco complété par 50 μg/mL de pénicilline et 50 U/mL de streptomycine.
   REMARQUE: Une biopsie cutanée doit être effectuée dans des conditions stériles par un médecin après qu’un patient a signé un consentement éclairé.
2. Placez le tissu de biopsie dans une boîte de Petri de 6 cm avec une petite quantité du milieu.
3. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez l’échantillon de biopsie en morceaux d’environ 0,5 à 1 mm. Placez 1-2 fragments obtenus dans une boîte de Petri de 3,5 cm et placez un couvercle stérile sur les morceaux de biopsie. Ajouter lentement 1,5 mL d’un milieu de croissance à la composition suivante : DMEM, 50 U/mL de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
4. Cultivez des fibroblastes dans le milieu de croissance à l’intérieur d’un incubateur à CO₂ maintenu à_5%de CO2, 37 °C, 80% d’humidité.
   REMARQUE: Après 4-7 jours, les premiers kératinocytes, puis les fibroblastes, commencent à migrer du tissu vers le fond du plat.

2. Entreposage, congélation et décongélation de la culture primaire

1. Retirer les cellules de la boîte de culture (voir points 3.2-3.4).
2. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 200 x g. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 900 μL de FBS refroidi.
3. Transférer dans un tube de cryoconservation goutte à goutte et ajouter 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
4. Placer la cryosonde dans un congélateur à basse température à -80 °C. Vingt-quatre heures plus tard, transférer le cryovial dans l’azote liquide (−196 °C) pour un stockage à long terme.
5. Pour décongeler les cellules cryoconservées, retirer le cryovial du stockage d’azote et, en 1 min, transférer 1 mL du contenu dans un tube conique de 15 mL contenant 9 mL du milieu de transport préchauffé à 37 °C.
6. Remettre soigneusement en suspension puis centrifuger le tube pendant 5 min à 200 x g. Jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans le volume requis du milieu de croissance et placez-les sur une boîte de Pétri du diamètre requis.

3. Culture cellulaire

1. Couvrir le fond du plat avec une solution de gélatine autoclavée à 0,1% préparée dans de l’eau distillée. Incuber pendant 15 min.
   REMARQUE: Pour la visualisation de la transfection, des plats à fond de verre (plats confocaux d’une épaisseur de verre de 170 μm) doivent être utilisés.
2. Préparer un milieu de culture ayant la composition suivante : DMEM complété par 10% FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 50 U/mL pénicilline-streptomycine. Bien mélanger et conserver à 4 °C. Réchauffer le milieu à 37 °C avant de l’ajouter aux cellules.
3. Évaluez la culture au microscope. Retirez le milieu et lavez les fibroblastes avec la solution phosphate-sel (DPBS) de Dulbecco.
4. Ajouter 1 mL de solution de trypsine préchauffée à 0,25 % aux cellules. Vérifiez les cellules au microscope si elles se détachent complètement du substrat. Désactiver la trypsine avec 1 mL du milieu de culture.
5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre la pastille de cellule dans 1 mL du milieu de culture.
6. Comptez le nombre de cellules. Calculer le nombre requis de cellules pour les ensemencer avec une densité de 8-15 x^{10 3}/cm² et les remettre en suspension dans 2 mL du milieu de culture.
7. Retirer la solution de gélatine de la boîte de culture et ajouter immédiatement 2 mL de la suspension cellulaire. Cultivez des fibroblastes à 37 °C dans un incubateur à CO_2.
8. Rafraîchissez le milieu tous les 2-4 jours.
   REMARQUE: Pour les expériences, utilisez les cellules de 4 à 11 passages.

4. Transfection

1. Remplacer le milieu de culture par un milieu de culture frais 24 h avant la transfection.
   REMARQUE: La confluence cellulaire doit être de 70 à 80%.
2. Préparez un complexe ADN-lipide en fonction de la surface et de la densité de l’ensemencement cellulaire. Utilisez un agent de transfection à base de liposomes.
   REMARQUE: Utilisez la densité d’ensemencement cellulaire comme 1 x^{10 4} cellules / cm².
3. Ajouter 3 μL de réactif de transfection commercial à 125 μL de milieu essentiel minimal optimal (Opti-MEM) ne contenant aucun antibiotique, sans toucher les parois du tube. Remettez en suspension doucement.
4. Diluer l’ADN plasmidique (GFP-EB3) en ajoutant 1 μg d’ADN plasmidique à 125 μL d’Opti-MEM. Remettez en suspension doucement.
   REMARQUE: L’encodage vectoriel d’expression GFP-EB3¹¹ a été reçu comme un cadeau aimable du Dr I. Kaverina (Université Vanderbilt, Nashville) avec la permission du Dr A. Akhmanova (Université Erasmus, Rotterdam)¹¹.
5. Ajouter de l’ADN plasmidique dilué à chaque tube de réactif de transfection dilué (1:1). Incuber pendant 30 min.
6. Ajouter le complexe ADN-lipide à la boîte de Petri de 6 cm contenant des cellules et mélanger avec une balançoire cruciforme pendant 30 s. Incuber les cellules avec un agent de transfection pendant 24 h, puis passer à un milieu frais. Analyser l’efficacité de la transfection après 24 h et 48 h.
   REMARQUE: 24 h après la transfection, l’efficacité était de 10-15%, et après 48 h jusqu’à 40%.

5. Préparation à l’imagerie

1. Avant l’imagerie vivante des cellules, changez le milieu de culture en un milieu sans colorant indicateur de pH pour réduire l’autofluorescence.
2. Appliquez soigneusement l’huile minérale sur la surface du milieu pour couvrir complètement le milieu, en l’isolant de l’environnement extérieur pour réduire la pénétration de l’O₂ et l’évaporation du milieu.
3. Utilisez une lampe au mercure et un objectif à immersion dans l’huile 60x ou 100x avec une ouverture numérique élevée pour prendre les images.
   REMARQUE: Pour les observations in vivo, le microscope doit être équipé d’un incubateur pour maintenir les conditions nécessaires aux cellules, y compris le chauffage de la table d’objets et de la lentille à +37 ° C, une chambre fermée avec alimentation en CO₂ et un support du niveau d’humidité. Utilisez de l’eau distillée double pour créer de l’humidité. Vérifiez le niveau d’eau double distillée avant de filmer.
4. Placez la boîte confocale avec les cellules dans le support du microscope avant l’imagerie. Assurez-vous que la parabole et l’appareil photo sont solidement fixés au support pour éviter de dériver lors de la prise d’images.

6. Définition des paramètres d’imagerie

1. Choisissez les faibles valeurs d’exposition, car la lumière induit des espèces réactives de l’oxygène (ROS) endommageant les cellules.
   NOTE: Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes de la peau humaine, une exposition de 300 ms a été sélectionnée.
2. Concentrez-vous sur l’objet d’intérêt.
   REMARQUE: Pour l’imagerie time-lapse à long terme, utilisez le système de stabilisation automatique de la mise au point pour compenser un éventuel décalage le long de l’axe z.
3. Choisissez les conditions d’imagerie optimales en fonction de la photosensibilité des cellules et du taux de décoloration du fluorochrome.
   REMARQUE: Étant donné que les microtubules sont des structures très dynamiques, un intervalle de temps raisonnablement court peut être sélectionné et la fréquence d’images doit être suffisamment élevée. Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés, nous avons utilisé à une fréquence de 1 image/ s pendant 3-5 min.
4. Lorsque vous sélectionnez l’objet suivant pour obtenir l’image, éloignez-vous de la zone déjà imagée. Comme cette zone était sous l’influence de la lumière, il y aura un photo-blanchiment notable.
   REMARQUE: Comme une fréquence d’imagerie relativement élevée a été utilisée, l’obturateur ne s’est pas fermé entre les images et la lampe a été allumée pendant toute la période d’imagerie, ce qui explique pourquoi la décoloration a augmenté.
5. Choisissez la vidéo optimale pour étudier visuellement la dynamique des microtubules, en tenant compte de la qualité de la transfection, de la qualité des images des microtubules (rapport signal/bruit optimal) et de l’absence de dérive dans le cas de la cellule analysée(Figure 3).
6. Utilisez les vidéos sélectionnées pour étudier la dynamique des extrémités plus des microtubules en les traçant dans le programme ImageJ ou Fiji (Figure 4).
   REMARQUE : Pour obtenir des instructions d’analyse quantitative, voir la figure supplémentaire 2 et le dossier supplémentaire 1.

Résultats

Les films GFP-EB3 produits à l’aide du protocole(Figure 1)illustrent les propriétés dynamiques des microtubules. Les microtubules sont impliqués dans différents processus cellulaires, et leurs propriétés dynamiques ont un impact sur diverses caractéristiques de vie de la culture cellulaire humaine primaire à partir du matériel de biopsie des patients (Figure 2).

Les paramètres suivants déterminent l’instabilité dynami...

Discussion

Des résultats de meilleure qualité pour l’analyse de la dynamique des microtubules peuvent être obtenus à partir d’images microscopiques de haute qualité. Il est important d’observer toutes les conditions nécessaires à l’imagerie time-lapse des cellules vivantes et d’ajuster correctement les paramètres d’imagerie. L’utilisation de plats de culture cellulaire spéciaux avec un fond en verre (plats confocaux) est importante, car le verre a un indice de réfraction de la lumière différent de celui du...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD	Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte	Logos Biosystems	L40002
Microscope incubator for lifetime filming	Okolab	Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
		Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)	Open source image processing software
NIS Elements	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil)	MP	151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish	SPL Lifesciences	20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm)	SPL Lifesciences	211350	Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube	SPL Lifesciences	50015
Cryogenic Vials	Corning-Costar	430659
Microcentrifuge Tube	Nest	615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Dimethyl sulfoxide	PanEko	135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	PanEko	C420
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution)	PanEko	P060
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin)	PanEko	070
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax	Gibco	519850026
Penicillin-streptomycin	PanEko	A063
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP	Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]	Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003