Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

Résumé

Dans cette étude, nous présentons un protocole efficace et reproductible pour isoler les populations immunitaires du système respiratoire murin. Nous fournissons également une méthode pour l’identification de toutes les cellules immunitaires innées et adaptatives qui résident dans les poumons de souris saines, en utilisant un panel de cytométrie en flux à base de 9 couleurs.

Résumé

Les voies respiratoires sont en contact direct avec l’environnement extérieur et nécessitent un système immunitaire régulé avec précision pour fournir une protection tout en supprimant les réactions indésirables aux antigènes environnementaux. Les poumons hébergent plusieurs populations de cellules immunitaires innées et adaptatives qui assurent la surveillance immunitaire mais interviennent également dans les réponses immunitaires protectrices. Ces cellules, qui maintiennent le système immunitaire pulmonaire sain en équilibre, participent également à plusieurs conditions pathologiques telles que l’asthme, les infections, les maladies auto-immunes et le cancer. L’expression sélective des protéines de surface et intracellulaires fournit des propriétés immunophénotypiques uniques aux cellules immunitaires du poumon. Par conséquent, la cytométrie en flux joue un rôle déterminant dans l’identification de ces populations cellulaires dans des conditions d’équilibre et pathologiques. Cet article présente un protocole qui décrit une méthode cohérente et reproductible pour identifier les cellules immunitaires qui résident dans les poumons de souris saines dans des conditions d’équilibre. Cependant, ce protocole peut également être utilisé pour identifier les changements dans ces populations cellulaires dans divers modèles de maladie afin d’aider à identifier les changements spécifiques à la maladie dans le paysage immunitaire pulmonaire.

Introduction

Les voies respiratoires murines contiennent un système immunitaire unique responsable de la lutte contre les agents pathogènes et du maintien de l’homéostasie immunitaire. Le système immunitaire pulmonaire se compose de populations cellulaires avec une hétérogénéité significative dans leur phénotype, leur fonction, leur origine et leur emplacement. Les macrophages alvéolaires résidents (AM), provenant principalement de monocytes fœtaux, résident dans la lumière alvéolaire1, tandis que les macrophages interstitiels dérivés de la moelle osseuse (IM) résident dans le parenchyme ^pulmonaire2. Les MESSAGES instantanés peuvent être subclassés par l’expression CD206. Les IM CD206⁺ peuplent la région péribronchique et périvasculaire, tandis que les IM CD206^- sont situés à l’interstitium alvéolaire3. Quelques sous-classifications des GI ont été proposées récemment3,4,5,6. Bien que les MI soient moins étudiées que les AM, des preuves récentes soutiennent leur rôle crucial dans la régulation du système immunitaire du ^poumon7. En outre, CD206 est également exprimé dans AMs8 activé alternativement.

Les cellules dendritiques pulmonaires (DC) sont un autre groupe hétérogène de cellules immunitaires pulmonaires en ce qui concerne leurs propriétés fonctionnelles, leur emplacement et leur origine. Quatre sous-catégories de DC ont été décrites dans les poumons : les DC CD103⁺ conventionnels (également connus sous le nom de cDC1), les DC CD11b⁺ conventionnels (également connus sous le nom de cDC2), les DC dérivés de monocytes (MoDC) et les DC plasmocytoïdes9,10,11,12,13. Les trois premières sous-classes peuvent être définies comme complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Les DC plasmocytoïdes expriment le CMH II et sont moyennement positifs pour cd11c, mais expriment des niveaux élevés de B220 et de PDCA-19,13,16. Dans les poumons murins naïfs, les DC CD103 et CD11b sont situés dans l’interstitium des voies respiratoires, tandis que les DC plasmocytoïdes sont situés dans l’interstitium ^{alvéolaire17}.

Deux grandes populations de monocytes résident dans le poumon pendant l’état d’équilibre: les monocytes classiques et les monocytes non classiques. Les monocytes classiques sont Ly6C⁺ et sont essentiels pour la réponse inflammatoire initiale. En revanche, les monocytes non classiques sont Ly6C^- et ont été largement considérés comme des cellules anti-inflammatoires3,16,18. Récemment, une population supplémentaire de monocytes CD64⁺CD16.2⁺ a été décrite, qui proviennent de monocytes Ly6C^- et donnent naissance à CD206⁺ IMs3.

Les éosinophiles apparaissent principalement dans les poumons lors d’une infection à helminthes ou de conditions allergiques. Cependant, il y a un petit nombre d’éosinophiles dans le parenchyme pulmonaire pendant l’état d’équilibre, connus sous le nom d’éosinophiles résidents. Contrairement aux éosinophiles résidents, les éosinophiles inflammatoires se trouvent dans l’interstitium pulmonaire et le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans les modèles murins d’acariens de la poussière domestique (HDM), les éosinophiles inflammatoires sont recrutés dans les poumons après une stimulation médiée par l’antigène. Il a été proposé que les éosinophiles résidents pourraient avoir un rôle régulateur dans l’allergie en inhibant la sensibilisation de T helper 2 (Th2) à ^HDM19.

Contrairement au reste des cellules myéloïdes pulmonaires, les neutrophiles expriment Ly6G mais pas CD68 et sont caractérisés par une signature de l’immunophénotype CD68-Ly6G⁺16,20,21. Des études de visualisation ont montré qu’à l’état d’équilibre, le poumon réserve un pool de neutrophiles dans le compartiment intravasculaire et héberge un nombre considérable de neutrophiles extravasculaires22. Semblable aux éosinophiles, les neutrophiles ne se trouvent pas dans BAL à l’état d’équilibre; cependant, plusieurs formes de stimulation immunitaire, telles que le défi LPS, l’asthme ou la pneumonie, conduisent les neutrophiles dans la lumière alvéolaire, ce qui entraîne leur présence dans BAL21,22,23.

Un nombre important de cellules CD45⁺ du poumon représentent un tueur naturel (NK), des cellules T et des cellules B et sont négatives pour la plupart des marqueurs myéloïdes24. Dans les poumons de souris naïves, ces trois types de cellules peuvent être identifiés sur la base de l’expression de CD11b et de CMH ^II18. Environ 25% des cellules PULMONAIREs CD45^{+ sont des} cellules B, tandis que le pourcentage de cellules NK est plus élevé dans les poumons que les autres tissus lymphoïdes et non lymphoïdes24,25,26. Parmi les lymphocytes T pulmonaires, une fraction considérable est ^CD4-CD8- et joue un rôle important dans les infections ^{respiratoires26}.

Parce que le poumon héberge un système immunitaire très complexe et unique, plusieurs stratégies de contrôle pour l’identification des cellules immunitaires pulmonaires ont été développées et rapportées16,18,20,27. La stratégie de contrôle décrite ici fournit un moyen complet et reproductible d’identifier jusqu’à 12 populations immunitaires myéloïdes et non myéloïdes pulmonaires différentes à l’aide de 9 marqueurs. Des marqueurs supplémentaires ont été utilisés pour valider les résultats. En outre, une méthode détaillée est fournie pour la préparation d’une suspension unicellulaire qui minimise la mort cellulaire et permet l’identification du profil le plus complet du compartiment cellulaire immunitaire du poumon. Il convient de noter que l’identification des cellules non immunitaires du poumon, telles que les cellules épithéliales (CD45-CD326⁺CD31^-), les cellules endothéliales (CD45-CD326-CD31⁺) et les fibroblastes nécessite une approche ^{différente28,29}. L’identification de ces populations n’est pas incluse dans le protocole et la méthode décrits ici.

Protocole

Toutes les études et expériences décrites dans ce protocole ont été menées selon les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Beth Israel Deaconess Medical Center. Des souris C57BL/6 âgées de six à dix semaines de l’un ou l’autre sexe ont été utilisées pour développer ce protocole.

1. Excision chirurgicale et préparation des tissus

1. Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de 1 mL de tribromoéthanol (préparé selon le protocole standard; Tableau des matériaux).
   REMARQUE: L’asphyxie au _CO2 doit être évitée dans les études pulmonaires, car elle pourrait causer des lésions pulmonaires et altérer les caractéristiques et les propriétés des cellules immunitaires pulmonaires. La luxation cervicale doit également être évitée car elle pourrait causer des lésions mécaniques du poumon.
2. Transférez la souris dans une zone propre et dédiée pour une opération chirurgicale.
3. Stabilisez la face dorsale de la souris vers le bas en utilisant des aiguilles ou du ruban adhésif sur les quatre extrémités. Utilisez 70% d’éthanol pour désinfecter la peau de la zone ventrale.
4. Effectuez une incision dans la peau, du cou à l’abdomen. Retirez soigneusement la peau de la région thoracique.
5. Retirez soigneusement le sternum et les côtes.
6. Rincer les poumons en injectant 10 mL de PBS froid directement dans le ventricule droit, à l’aide d’une aiguille de 18 à 21 G, jusqu’à ce que les poumons deviennent complètement blancs.
7. Retirez soigneusement le thymus et le cœur sans toucher les poumons.
8. Détachez doucement les poumons des tissus environnants et transférez-les dans un tube avec un tampon BSA froid (tableau 1).
   REMARQUE: Un effort doit être fait pour éliminer toute la graisse adjacente des poumons avant de préparer davantage la suspension unicellulaire, car cela pourrait biaiser les lectures.

2. Préparation de la suspension monocellulaire

1. Transférer les poumons dans une boîte de Pétri vide et les hacher avec deux scalpels fins. Transférer tous les morceaux du poumon haché dans un nouveau tube conique de 50 mL. Utilisez 5 mL de tampon de digestion pour laver la plaque et ajoutez-la au tube de 50 mL contenant le poumon haché (tableau 1).
   REMARQUE: Le tampon de digestion doit être préparé immédiatement avant utilisation. Utilisez 5 mg/mL de ^{collagénase28}. La combinaison de 1 ou 5 mg de collagénase avec un tampon BSA ou un PBS sans protéines n’a pas amélioré les résultats (figure supplémentaire S1).
2. Fixez le couvercle du tube et digérez le poumon pendant 30 min sur un agitateur orbital à une vitesse de 150 tr/min à 37 °C. Arrêtez la réaction en ajoutant 10 mL de tampon BSA froid.
3. Après la digestion, utilisez une aiguille de 18 G pour mélanger et dissoudre les morceaux de poumon. Placez une crépine filtrante de 70 μm au sommet d’un nouveau tube conique de 50 mL.
   REMARQUE: L’utilisation d’un filtre micron plus petit peut entraîner la perte de populations myéloïdes majeures.
4. Transférer lentement le mélange pulmonaire digéré directement sur la passoire. Utilisez le côté en caoutchouc d’un piston de seringue de 10 mL pour briser les morceaux de poumon restants sur le filtre. Lavez le matériau traité sur le filtre avec un tampon BSA.
5. Centrifuger la suspension monocellulaire à 350 × g pendant 8 min à 4 °C.
6. Jetez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse ACK. Bien mélanger à l’aide d’une pipette de 1 mL et incuber pendant 90 s à température ambiante.
7. Ajouter 10 mL de tampon BSA froid pour arrêter la réaction et centrifuger à 350 × g pendant 7 min à 4 °C.Jeter soigneusement le surnageant et remettre la pastille dans le tampon de coloration pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
8. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 5 × ¹⁰⁶ cellules/mL et les utiliser pour la coloration de surface (voir rubrique 3).
   REMARQUE: À cette fin, plaquez les cellules dans une plaque à fond rond de 96 puits, suivie d’une coloration et d’un lavage des anticorps. Si une centrifugeuse à plaques n’est pas disponible, utilisez des tubes d’écoulement au lieu de plaques. Avec ce protocole, environ 15 à 20 × ¹⁰⁶ cellules par poumon peuvent être obtenues à partir d’une souris C57BL / 6 de taille moyenne âgée de 6 à 10 semaines.

3. Coloration des anticorps de surface

1. Transférer 1 × ¹⁰⁶ cellules dans 200 μL par puits dans une plaque de 96 puits. Centrifuger la plaque à 350 × g pendant 7 min à 4 °C. Entre-temps, préparer la solution de bloc Fc en diluant l’anticorps anti-16/32 (1:100) dans un tampon de coloration (tableau 1).
2. Remettre les cellules en suspension dans 50 μL de la solution anti-Fc pré-préparée (Table des matériaux) et incuber pendant 15-20 min à 4 °C ou sur glace.
3. Ajouter 150 μL de tampon de coloration et centrifuger la plaque à 350 × g pendant 5 min à 4 °C. Pendant ce temps, préparez le cocktail d’anticorps de surface en diluant les anticorps de surface (1:100; Tableau 2) dans le tampon de coloration.
   REMARQUE: (i) L’anticorps anti-16/32 pour le blocage fc peut être utilisé avec les anticorps de surface dans le même mélange. ii) Si un colorant de viabilité fixable est utilisé, ajoutez-le au cocktail d’anticorps de surface à une dilution de 1:1 000.
4. Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du cocktail d’anticorps de surface pré-préparé et incuber pendant 30 à 40 min à 4 °C dans l’obscurité. Lavez les cellules avec un tampon de coloration deux fois.
   REMARQUE: Si aucune coloration intracellulaire n’est nécessaire, remettez en suspension les cellules dans 200 μL de tampon de coloration et procédez directement à l’acquisition des données sur le cytomètre en flux. Alternativement, les cellules peuvent être fixées et stockées à 4 °C pour une acquisition ultérieure. Nous recommandons d’utiliser les cellules pour la cytométrie en flux dans les 24 heures.

4. Fixation cellulaire et coloration intracellulaire

1. Préparer le tampon de fixation/perméabilisation (fix/tampon permanent) en mélangeant trois parties de concentré de fixation/perméabilisation et 1 partie de diluant de fixation/perméabilisation du tampon de coloration FoxP3/Transcription Factor (tableau 1).
2. Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du tampon Fix/Perm pré-préparé par puits de la plaque de 96 puits, où les cellules ont été plaquées comme décrit à la section 3, et les incuber pendant 20-25 min à 4 °C dans l’obscurité.
3. Diluer le tampon de perméabilisation 10x comme 1: 10 dans de l’eau désionisée purifiée pour préparer 1x tampon de perméabilisation.
4. Lavez les cellules une fois avec 1x tampon de perméabilisation. Pendant ce temps, préparez le cocktail d’anticorps intracellulaires en diluant les anticorps intracellulaires (1:100) dans 1 mL de tampon de perméabilisation.
5. Remettre en suspension les cellules en utilisant 50 μL du cocktail d’anticorps de surface pré-préparé par cellule de la plaque de 96 puits et incuber pendant 40 min à 4 °C dans l’obscurité.
6. Lavez les cellules une fois avec un tampon de perméabilisation et une fois avec un tampon de coloration. Après le lavage final, remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de coloration.
   REMARQUE: Si aucun cytomètre de flux avec lecteur de plaque n’est disponible, transférez les cellules dans des tubes de cytométrie en flux.
7. Acquérir un minimum de 1,5 × ¹⁰⁶ cellules par échantillon sur le cytomètre en flux.
   REMARQUE: Pour les échantillons de contrôle de couleurs uniques et non colorés, 0,5 à 1 × ¹⁰⁶ cellules par échantillon suffiront. Il est recommandé de titrer les anticorps individuels utilisés pour obtenir une coloration optimale et réduire les coûts. Le protocole actuel a été optimisé à l’aide du tampon Fix/Perm préparé à l’aide du tampon de coloration FoxP3. Étant donné que CD68 est un cytoplasmique et non un marqueur nucléaire, d’autres solutions de perméabilisation telles qu’une faible concentration de paraformaldéhyde ou de kits cytofix/cytoperme de divers fournisseurs pourraient suffire.

Résultats

Stratégie de contrôle
La première étape de notre stratégie de contrôle est l’exclusion des débris et des doublets (Figure 1A). Une exclusion prudente des doublets est essentielle pour éviter les populations faussement positives (figure supplémentaire S2). Ensuite, les cellules immunitaires sont identifiées à l’aide de CD45⁺, un marqueur des cellules hématopoïétiques (Figure 1B). La tache morte viv...

Discussion

L’identification des cellules immunitaires pulmonaires peut être difficile en raison des multiples types de cellules immunitaires résidant dans le poumon et de leurs caractéristiques immunophénotypiques uniques par rapport à leurs homologues résidant dans d’autres tissus. Dans plusieurs conditions pathologiques, des cellules présentant des caractéristiques phénotypiques distinctes apparaissent dans les poumons. Par exemple, les lésions pulmonaires induites par la bléomycine entraînent le recrutement de ma...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co