Méthode de PCR par gouttelettes numériques pour la quantification de l’efficacité de la transduction de l’AAV dans la rétine murine

Résumé

Ce protocole montre comment quantifier l’efficacité de la transduction de l’AAV dans la rétine de souris en utilisant la PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) ainsi que la production d’AAV à petite échelle, l’injection intravitréenne, l’imagerie rétinienne et l’isolement de l’ADN génomique rétinien.

Résumé

De nombreux laboratoires de biologie cellulaire de la rétine utilisent maintenant régulièrement des virus associés à l’adéno (AAV) pour l’édition de gènes et des applications réglementaires. L’efficacité de la transduction de l’AAV est généralement critique, ce qui affecte les résultats expérimentaux globaux. L’un des principaux déterminants de l’efficacité de la transduction est le sérotype ou la variante du vecteur AAV. Actuellement, divers sérotypes et variantes artificiels de l’AAV sont disponibles avec différentes affinités pour les récepteurs de surface des cellules hôtes. Pour la thérapie génique rétinienne, il en résulte différents degrés d’efficacité de transduction pour différents types de cellules rétiniennes. En outre, la voie d’injection et la qualité de la production d’AAV peuvent également affecter l’efficacité de la transduction de l’AAV rétinien. Par conséquent, il est essentiel de comparer l’efficacité de différentes variantes, lots et méthodologies. La méthode de PCR par gouttelettes numériques (dd-PCR) quantifie les acides nucléiques avec une grande précision et permet d’effectuer une quantification absolue d’une cible donnée sans étalon ni référence. En utilisant la dd-PCR, il est également possible d’évaluer l’efficacité de la transduction des AAV par quantification absolue du nombre de copies du génome AAV dans une rétine injectée. Ici, nous fournissons une méthode simple pour quantifier le taux de transduction des AAV dans les cellules rétiniennes en utilisant la dd-PCR. Avec des modifications mineures, cette méthodologie peut également servir de base à la quantification du nombre de copies de l’ADN mitochondrial ainsi qu’à l’évaluation de l’efficacité de l’édition de base, essentielle pour plusieurs maladies de la rétine et applications de thérapie génique.

Introduction

Les virus associés à l’adéno (AAV) sont maintenant couramment utilisés pour diverses études de thérapie génique rétinienne. Les AAV offrent un moyen sûr et efficace d’administration de gènes avec moins d’immunogénicité et moins d’intégrations du génome. L’entrée de l’AAV dans la cellule cible se produit par endocytose, ce qui nécessite la liaison des récepteurs et des co-récepteurs à la surface de la cellule^1,2. Par conséquent, l’efficacité de transduction des AAV pour différents types de cellules dépend principalement de la capside et de ses interactions avec les récepteurs de la cellule hôte. Les AAV ont des sérotypes et chaque sérotype peut avoir des tropismes cellulaires / tissulaires distincts et des efficacités de transduction. Il existe également des sérotypes et des variantes artificiels de l’AAV générés par la modification chimique de la capside virale, la production de capsides hybrides, l’insertion peptidique, le brassage de la capside, l’évolution dirigée et la mutagénèse rationnelle³. Même des changements mineurs dans la séquence d’acides aminés ou la structure de la capside peuvent avoir une influence sur les interactions avec les facteurs de la cellule hôte et entraîner différents tropismes⁴. En plus des variantes de capside, d’autres facteurs tels que la voie d’injection et la variation de lot à lot de la production d’AAV peuvent affecter l’efficacité de transduction des AAV dans la rétine neuronale. Par conséquent, des méthodes fiables de comparaison des taux de transduction pour différentes variantes sont nécessaires.

La majorité des méthodes permettant de déterminer l’efficacité de la transduction de l’AAV reposent sur l’expression du gène rapporteur. Il s’agit notamment de l’imagerie fluorescente, de l’immunohistochimie, du transfert western ou de l’analyse histochimique du produit du gène rapporteur^5,6,7. Cependant, en raison de la contrainte de taille des AAV, il n’est pas toujours possible d’inclure des gènes rapporteurs pour surveiller l’efficacité de la transduction. L’utilisation de promoteurs puissants comme l’activateur hybride CMV/bêta-actine de poulet ou l’élément régulateur post-transcriptionnel de l’hépatite Woodchuck (WPRE) comme séquence stabilisatrice d’ARNm complique encore le problème de taille⁸. Par conséquent, il sera également avantageux de définir le taux de transduction des AAV injectés avec une méthodologie plus directe.

La PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) est une technique puissante pour quantifier l’ADN cible à partir de quantités infimes d’échantillons. La technologie dd-PCR dépend de l’encapsulation de l’ADN cible et du mélange réactionnel PCR par des gouttelettes d’huile. Chaque réaction dd-PCR contient des milliers de gouttelettes. Chaque gouttelette est traitée et analysée comme une réaction PCR indépendante⁹. L’analyse des gouttelettes permet de calculer le nombre absolu de copies des molécules d’ADN cibles dans n’importe quel échantillon en utilisant simplement l’algorithme de Poisson. Étant donné que l’efficacité de transduction des AAV est corrélée avec le nombre de copies des génomes AAV dans la rétine neuronale, nous avons utilisé la méthode dd-PCR pour quantifier les génomes AAV.

Ici, nous décrivons une méthodologie dd-PCR pour calculer l’efficacité de transduction des vecteurs AAV à partir de l’ADN^{génomique rétinien 6,10}. Tout d’abord, les AAV qui expriment tdTomato reporter ont été générés en utilisant le protocole à petite échelle, et titrés par la méthode dd-PCR¹¹. Deuxièmement, les AAV ont été injectés par voie intravitréenne dans la rétine neuronale. Pour démontrer l’efficacité de la transduction, nous avons d’abord quantifié l’expression de tdTomato à l’aide de la microscopie fluorescente et du logiciel ImageJ. Cela a été suivi par l’isolement de l’ADN génomique pour la quantification des génomes AAV dans les rétines injectées à l’aide de la dd-PCR. La comparaison des niveaux d’expression de tdTomato avec les génomes dAV transduilés quantifiés par la dd-PCR a montré que la méthode dd-PCR quantifiait avec précision l’efficacité de transduction des vecteurs AAV. Nos protocoles ont démontré une description détaillée d’une méthodologie basée sur la dd-PCR pour quantifier l’efficacité de la transduction de l’AAV. Dans ce protocole, nous montrons également le nombre absolu de génomes AAV qui sont transduis après des injections intravitréennes en utilisant simplement le facteur de dilution après l’isolement de l’ADN génomique et les résultats de la dd-PCR. Dans l’ensemble, ce protocole fournit une méthode puissante, qui serait une alternative à l’expression rapporteure pour quantifier l’efficacité de la transduction des vecteurs AAV dans la rétine.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été acceptés par le comité d’éthique de l’Université Sabanci et les expériences ont été menées conformément à la déclaration de « L’Association pour la recherche en vision et ophtalmologie » pour l’utilisation des animaux dans la recherche

1. Production d’AAV à petite échelle¹²

1. Culture de cellules HEK293T à l’aide de plaques de 15 cm dans 10 mL de DMEM/10% FBS jusqu’à 70-80% de confluence.
2. Préparer le mélange de transfection avec 20 μg de plasmide auxiliaire (pHGT1-Adeno1), 7 μg de plasmide de capside et 7 μg de vecteur AAV2-CBA-tdTomato-WPRE et 136 μL de solution PEI (1 mg/mL) dans 5 mL de DMEM.
3. Ajouter le mélange de transfection préparé de 5 mL dans une boîte de culture cellulaire contenant 10 mL de milieux de culture et incuber les cellules transfectées pendant 48 à 60 h à 37 °C.
4. Recueillir le milieu à 48-60 h après la transfection et le digérer avec de la DNase I à une concentration finale de 250 U/mL pendant 30 min à 37 °C.
5. Centrifuger le milieu digéré à 4000 x g,4 °C pendant 30 min, puis filtrer avec un filtre à seringue de 0,22 μm dans la membrane de cellulose régénérée pré-mouillée pendant 100 kDa.
6. Centrifuger la membrane de cellulose régénérée à 4000 x g,4 °C pendant 30 min et jeter le support.
7. Laver et centrifuger la membrane de cellulose régénérée avec du PBS contenant 0,001% de Pluronic F-68 trois fois à 4000 x g,4 °C pendant 30 min. Jetez le PBS à chaque étape.
8. Recueillir les AAV concentrés de la partie supérieure de la membrane de cellulose régénérée et aliquote pour d’autres utilisations.
9. Digester 5 μL d’AAV fraîchement préparé avec de la DNase I (0,2U/μl) pendant 15 min à 37 °C pour le titrage. Ceci est suivi de 10 min à 95 °C d’incubation pour à la fois l’inactivation de la DNase I et la dégradation des capsides virales.
10. Préparer une dilution série 10 fois supérieure à partir d’AAV digérés à l’aide de Pluronic F-68 à 0,05 %. Utilisez les amorces AAV2-ITR et WPRE pour le titrage (Tableau 1). Les titres ont été calculés en multipliant les résultats de la dd-PCR avec les facteurs de dilution. Les résultats ont été convertis en copie du génome/mL (GC/mL).
    REMARQUE: Les concentrations d’AAV pour la production d’AAV à petite échelle devraient être d’environ 1 x^{10 12} GC / mL. Ce protocole ne s’applique pas aux souches d’AAV qui ne libèrent pas efficacement les AAV dans des supports comme AAV2¹³.

2. Injection intravitréenne d’AAV

1. Préparation de l’équipement
   1. Avant de commencer, préparez 10 μL de microsyringe avec une aiguille émoussée de 36 G. Rincez cinq fois avec 70% d’EtOH, cinq fois dans ddH₂O, et enfin cinq fois avec PBS.
   2. Chargez la quantité appropriée d’AAV dans le microsyringe pour chaque injection.
   3. Préparez l’aiguille chirurgicale (suture, soie, 6/0), le ruban adhésif, la pince et les ciseaux.
2. Injection intravitréenne
   1. Appliquer 1 goutte de 0,5 % de tropicamide et de chlorhydrate de phényléphrine à 2,5 % (p. ex. Mydfrin) contenant du collyre avant l’anesthésie pour dilater les pupilles.
   2. Anesthésier les souris avec de l’isoflurane 5% (1 L / min) et continuer avec 1,5% d’isoflurane (1 L / min) pendant la procédure. Une petite chambre d’isoflurane est utilisée pour la première induction.
   3. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par la perte du réflexe de redressement, le réflexe de retrait et la réponse au pincement de la queue.
   4. Appliquer 0,3% de tobramycine et 0,1% de dexaméthasone solution ophtalmique stérile sur chaque œil avant la procédure d’injection. L’application de goutte oculaire prévient la sécheresse et exerce des effets anti-inflammatoires et antibactériens.
   5. Utilisez le crochet chirurgical pour stabiliser la paupière supérieure. Tirez légèrement en arrière pour exposer la partie dorsale de l’œil. Collez le crochet sur le banc pour le maintenir en position.
   6. Retirer la conjonctive (moins de 1 mm²⁾avec les ciseaux à iris incurvés pour exposer la sclérotique de l’œil sous le microscope à dissection. Utilisez une seringue à insuline fraîche et stérile (30 G) pour percer la sclérotique.
   7. Insérez l’aiguille du microsyringe à travers la même ponction à l’aide d’un micromanipulateur. Placez le bout de l’aiguille derrière la lentille au milieu de l’œillet.
   8. Injecter 1 μL d’AAV2/BP2 et d’AAV2/PHP. Vecteurs S ayant des concentrations de 1,63 x^{10 12} GC/mL et 1,7 x 10¹² GC/mL lentement dans le vitré de l’œil. Le contrôle du volume d’injection se fait manuellement. Laissez l’aiguille en place pendant 1 min et retirez lentement l’aiguille.
   9. Relâchez la paupière et appliquez un traitement en gel topique anti-inflammatoire et antibactérien contenant 0,3% de tobramycine et 0,1% de dexaméthasone sur les oculaires. Surveillez et évaluez les souris dans les jours suivants en fonction de la feuille de score en termes d’apparence (yeux brillants, pelage soigné, intuition), de comportement (activité, immobilisation, automutilation) et de poids corporel sur une échelle de 0 à 3. Chaque condition a un score de 0-3 et un score total de 3 ou plus est un critère de terminaison.
   10. Placez les animaux dans la cage après la récupération.

3. Fluorescence et imagerie du fond d’œil

1. Filtrer la souris et dilater la pupille en plaçant des gouttes de 0,5% de tropicamide et de 2,5% de chlorhydrate de phényléphrine dans chaque œil.
2. Anesthésiez l’animal avec la procédure ci-dessus avec de l’isoflurane. Évaluez soigneusement la profondeur de l’anesthésie en pinçant les pattes.
3. Placez la souris sur la scène d’imagerie et vérifiez la dilatation correcte en vérifiant à travers la caméra du fond d’œil. Appliquer un gel topique (0,2% carbomère 980) sur la surface des yeux pour protéger les yeux de la déshydratation sous anesthésie et l’utiliser comme gel de couplage pour l’imagerie.
4. Manipulez l’étape d’imagerie pour l’aligner avec le nez de l’objectif. Ajustez la scène au besoin pour centrer l’œil de la souris. Une fois l’œil centré, déplacez lentement l’objectif jusqu’à ce qu’il entre en contact avec l’œil.
5. Effectuer une imagerie du fond d’œil et de la fluorescence sur les deux yeux pour suivre l’expression de tdTomato à 1 semaine et 2 semaines après l’injection intravitréenne (Figure 3B)¹⁴. Prenez des images de fond d’œil et de fluorescence à des paramètres identiques pour comparer l’expression du rapporteur.

4. Isolement de la rétine

1. Euthanasier les animaux après le fond d’œil et l’imagerie par fluorescence par inhalation de CO₂ pour la collecte de la rétine à 2 semaines.
2. Déplacez le globe oculaire vers l’avant à l’aide d’une pince fendeuse de 13,5 cm.
3. Retirez la lentille avec les restes du vitré en appliquant une légère pression avec la pince.
4. Coupez la connexion du globe oculaire au nerf optique avec une pince incurvée de précision et pressez doucement la rétine avec la même pince incurvée.
5. Transférer les rétines disséquées dans un tube de microcentrifugation.
6. Snap freeze rétine en plaçant les tubes dans l’azote liquide.

5. Isolement de l’ADN génomique tissulaire

1. Isolez l’ADN génomique avec un kit d’ADN génomique tissulaire commercialisé à base de digestion de la protéinase K.
2. Digérer la rétine à 55 °C, 200 x g pendant 30 min avec la protéinase K, qui est déjà fournie dans le kit.
3. Effectuez l’étape d’incubation de la RNase, les étapes de lavage avec le tampon de lavage I et II, et enfin l’étape d’élution selon le protocole du fabricant.
4. Ajouter une étape d’essorage supplémentaire après le dernier lavage pour éliminer l’éthanol résiduel.
5. Mesurer la concentration d’ADN génomique et stocker les échantillons à -20 °C.

6. Analyse par PCR numérique par gouttelettes d’échantillons de rétine de souris pour la quantification des génomes viraux

1. Diluer les ADN génomiques des rétines injectées dans une solution de Pluronic F-68 à 0,05 % pour atteindre une concentration finale de 1 ng/μL pour chaque échantillon.
2. Effectuer des réactions distinctes pour WPRE et 18S à l’aide d’amorces spécifiques à la cible avec une concentration finale de 125 nM pour chaque amorce.
3. Effectuer la génération de gouttelettes dans un mélange de réaction PCR de 20 μL comprenant 1 ng d’ADN génomique, des amorces de 125 nM et 2x supermélange evagreen.
4. Chargez le mélange d’échantillons dans la partie centrale de la cartouche pour la génération de gouttelettes.
5. Une fois le chargement de l’échantillon sur la cartouche terminé, ajoutez 70 μL d’huile de génération de gouttelettes dans la rangée inférieure de la cartouche.
6. Placez le joint sur le dessus de la cartouche et placez-le dans le générateur de gouttelettes. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’espace entre le joint et la cartouche.
7. Prenez doucement environ 40 μL de gouttelettes générées dans le puits supérieur. Ajouter la solution de gouttelettes à la plaque de réaction PCR semi-jupe de 96 puits.
8. Scellez la plaque PCR avec un scellant à plaque PCR à l’aide d’une feuille d’étanchéité en aluminium.
9. Placez la plaque PCR dans un cycleur thermique thermoscellé à 96 puits. Utilisez le protocole PCR; 95 °C pendant 5 min, 40 cycles de 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 1 min, 4 °C pendant 5 min, 90 °C pendant 5 min et 4 °C en tenue infinie. Appliquer une vitesse de rampe de 2 °C/s à chaque cycle pour s’assurer que les gouttelettes atteignent la température correcte pour chaque étape pendant le cycle
10. Placez la plaque PCR dans le lecteur de gouttelettes pour quantifier les gouttelettes à l’aide du logiciel dd-PCR. Un modèle est configuré à l’aide de paramètres spécifiques pour evagreen.
11. Analysez les données à l’aide d’un graphique 1D avec chaque échantillon pour l’intensité de fluorescence par rapport au nombre de gouttelettes. La valeur seuil est disposée de manière à ce que les gouttelettes au-dessus du seuil soient attribuées comme positives et les gouttelettes ci-dessous comme négatives. Ceci est suivi par l’application de l’algorithme de Poisson pour déterminer la concentration de départ de l’ADN cible en unités de copies/μL. Le rapport entre WPRE et 18S est calculé pour mesurer l’efficacité de la transduction de l’AAV.

Résultats

La production d’AAV à petite échelle est une méthode rapide et efficace qui fournit des vecteurs pour les injections intravitréennes (Figure 1). La production d’AAV à petite échelle donne généralement des titres dans la plage de 1 x 10¹² GC / ml, ce qui est suffisant pour détecter l’expression du rapporteur dans la rétine (Figure 2). Le titrage de l’AAV à l’aide de dd-PCR donne des résultats cohérents. Des amorces spécifiques ?...

Discussion

Dans ce protocole, nous avons généré deux vecteurs AAV qui ont des protéines de capside différentes, puis nous les avons titrés en conséquence. L’une des étapes les plus cruciales de ce protocole est de produire des quantités suffisantes d’AAV qui produiront une expression de rapporteur détectable après la transduction^12,13.

Le titrage des AAV est également un facteur important pour ajuster les doses d’AAV pour les...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates	BioRad	12001925	ddPCR
Amicon Filter	Millipore	UFC910096	AAV
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS	BioRad	1851197	ddPCR
C57BL/6JRj mice strain	Janvier	C57BL/6JRj	Mice
DG8 gaskets	BioRad	1863009	ddPCR
DG8 Cartridges	BioRad	1864008	ddPCR
DMEM	Lonza	BE12-604Q	AAV
DPBS	PAN BIOTECH	L 1825	AAV
Droplet generation oil eva green	BioRad	1864006	ddPCR
Droplet reader oil	BioRad	1863004	ddPCR
FBS	PAN BIOTECH	p30-3306	AAV
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer	BioRad	1814040	ddPCR
Insulin Syringes	BD Medical	320933	Intravitreal injection
Isoflurane	ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET	N01AB06	anesthetic
Microinjector MM33	World Precision Instruments	82-42-101-0000	Intravitreal injection
Micron IV	Phoenix Research Labs	Micron IV	Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)	Alcon	S01FB01	pupil dilation
Nanofil Syringe 10 μl	World Precision Instruments	NANOFIL	Intravitreal injection
Needle RN G36, 25 mm, PST 2	World Precision Instruments	NF36BL-2	Intravitreal injection
PEI-MAX	Polyscience	24765-1	AAV
Penicillin-Streptomycin	PAN BIOTECH	P06-07100	AAV
Plasmid pHGT1-Adeno1	PlasmidFactory	PF1236	AAV
Pluronic F-68	Gibco	24040032	AAV
PX1 PCR Plate Sealer system	BioRad	1814000	ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	BioRad	1864034	ddPCR
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator	BioRad	1864001	ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM	endostall medical	EJN-160-0155	Retina isolation
Steril Syringe Filter	AISIMO	ASF33PS22S	AAV
Tissue Genomic DNA Kit	EcoSpin	E1070	gDNA isolation
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)	Alcon	S01CA01	anti-inflammatory / antibiotic
Tropamid (% 0.5 tropicamide)	Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.	S01FA06	pupil dilation
Turbonuclease	Accelagen	N0103L	AAV
Viscotears (carbomer 2 mg/g)	Bausch+Lomb	S01XA20	lubricant eye drop