In vivo Contrôle optogénétique sans fil du comportement moteur qualifié

Résumé

Le présent protocole décrit comment utiliser l’optogénétique sans fil combinée à la vidéographie à grande vitesse dans une seule tâche de portée à la saisie de pastilles pour caractériser les circuits neuronaux impliqués dans la performance du comportement moteur qualifié chez les souris en mouvement libre.

Résumé

La motricité fine est essentielle dans la vie quotidienne et peut être compromise dans plusieurs troubles du système nerveux. L’acquisition et l’exécution de ces tâches nécessitent une intégration sensori-motrice et impliquent un contrôle précis des circuits cérébraux bilatéraux. La mise en œuvre de paradigmes comportementaux unimanuels dans des modèles animaux améliorera la compréhension de la contribution des structures cérébrales, comme le striatum, au comportement moteur complexe, car elle permet la manipulation et l’enregistrement de l’activité neuronale de noyaux spécifiques dans des conditions de contrôle et de maladie pendant l’exécution de la tâche.

Depuis sa création, l’optogénétique a été un outil dominant pour interroger le cerveau en permettant une activation ou une inhibition sélective et ciblée des populations neuronales. La combinaison de l’optogénétique avec des tests comportementaux met en lumière les mécanismes sous-jacents de fonctions cérébrales spécifiques. Les systèmes sans fil montés sur la tête avec diodes électroluminescentes miniaturisées (LED) permettent un contrôle optogénétique à distance chez un animal entièrement en mouvement libre. Cela évite qu’un système câblé ne soit moins restrictif pour le comportement des animaux sans compromettre l’efficacité de l’émission de lumière. Le protocole actuel combine une approche optogénétique sans fil avec une vidéographie à grande vitesse dans une tâche de dextérité unimanuelle pour disséquer la contribution de populations neuronales spécifiques au comportement moteur fin.

Introduction

Le comportement habileté motrice est présent lors de la plupart des mouvements effectués par nous, et il est connu pour être affecté dans plusieurs troubles cérébraux ^1,2,3,4,5,6. La mise en œuvre de tâches permettant d’étudier le développement, l’apprentissage et l’exécution de mouvements qualifiés est cruciale pour comprendre les fondements neurobiologiques de la fonction motrice, en particulier dans les modèles de lésions cérébrales, de troubles neurodégénératifs et neurodéveloppementaux ^{2,7,8,9,10,11,12,13} . Atteindre et récupérer des objets se fait régulièrement dans les actions de la vie quotidienne, et c’est l’une des premières habiletés motrices acquises au début du développement, puis affinées au cours des années ^5,6. Il comprend un comportement complexe qui nécessite des processus sensori-moteurs tels que la perception des caractéristiques de l’objet, la planification du mouvement, la sélection de l’action, l’exécution du mouvement, la coordination du corps et la modulation de la vitesse ^7,14,15,16. Ainsi, les tâches de haute dextérité unimanuelle nécessitent la participation de nombreuses structures cérébrales des deux hémisphères 16,17,18,19,20,21,22. Chez la souris, la tâche d’atteinte à la saisie d’une seule pastille est caractérisée par plusieurs phases qui peuvent être contrôlées et analysées séparément ^7,13,23. Cette fonctionnalité permet d’étudier la contribution de sous-populations neuronales spécifiques à différents stades d’acquisition et de performance comportementale et fournit une plate-forme pour des études détaillées des systèmes moteurs 13,23,24. Le mouvement se produit en quelques secondes; ainsi, la vidéographie à grande vitesse devrait être utilisée pour l’analyse cinématique à des étapes distinctes de la trajectoire motrice qualifiée ^7,25. Plusieurs paramètres peuvent être extraits des vidéos, notamment la posture du corps, la trajectoire, la vitesse et le type d’erreurs²⁵. L’analyse cinématique peut être utilisée pour détecter des changements subtils lors de la manipulation optogénétique sans fil ^7,23.

L’utilisation de diodes électroluminescentes (LED) miniaturisées pour fournir de la lumière via un système sans fil monté sur la tête permet d’avoir un contrôle optogénétique à distance pendant que l’animal effectue la tâche. Le contrôleur optogénétique sans fil accepte les commandes à impulsion unique ou à déclenchement continu d’un stimulateur et envoie des signaux infrarouges (IR) à un récepteur connecté à la LED miniaturisée^23,26. Le protocole actuel combine cette approche optogénétique sans fil avec la vidéographie à grande vitesse d’une tâche de dextérité pour disséquer le rôle de populations neuronales spécifiques lors de la performance du comportement moteur fin²³. Comme il s’agit d’une tâche unimanale, elle permet d’évaluer la participation des structures dans les deux hémisphères. Traditionnellement, le cerveau contrôle le mouvement du corps d’une manière très asymétrique; cependant, les tâches de haute dextérité nécessitent une coordination et un contrôle minutieux de nombreuses structures cérébrales, y compris les noyaux ipsilatérals et la contribution différentielle des sous-populations neuronales dans les noyaux ^{10,20,21,22,23}. Ce protocole montre que les structures sous-corticales des deux hémisphères contrôlent la trajectoire du membre antérieur²³. Ce paradigme peut convenir à l’étude d’autres régions du cerveau et de modèles de maladies cérébrales.

Protocole

Les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été menées conformément aux directives locales et nationales et approuvées par le comité institutionnel correspondant pour les soins et l’utilisation des animaux (protocole VLH151-19 de l’Institut de physiologie cellulaire IACUC). Des souris mâles transgéniques Drd1-Cre²⁷, 35-40 jours postnatales avec C57BL/6 de fond ont été utilisées dans le protocole actuel. Les souris ont été gardées dans les conditions suivantes: température 22±1 ° C; humidité 55%; horaire de lumière 12/12 h avec lumières éteintes à 19 h et ont été sevrés au jour postnatal 21. Les chiots sevrés étaient logés dans des groupes de même sexe de 2 à 5 personnes. Les animaux étaient logés dans des logements statiques avec des sommets à micro-barrières. La literie était composée de copeaux de tremble stériles. Des granulés de rongeurs et de l’eau purifiée par OI ont été fournis ad libitum, sauf indication contraire.

1. Interventions chirurgicales

1. Préparer une canule LED à la longueur souhaitée selon les coordonnées dorsoventrales de la structure d’intérêt (idéalement 0,5 mm de plus pour tenir compte de l’épaisseur du crâne, pour le striatum dorsolatéral 3,5 mm) (Figure 1).
   1. Coupez la fibre de verre à une longueur supérieure à la taille finale souhaitée, broyez la pointe de la fibre à la longueur cible avec du papier de verre rugueux et, enfin, polissez la pointe de fibre avec du papier de verre fin.
      REMARQUE: La canule LED est une fibre optique en verre de 250 μm de diamètre fixée à un récepteur infrarouge (voir tableau des matériaux).
2. Tirez des pipettes en verre (1,14 mm de diamètre extérieur, 0,53 mm de diamètre intérieur et 3,5 de longueur) pour le nano-injecteur avec un extracteur horizontal (voir tableau des matériaux) et stockez-les pour plus tard. Programmez l’extracteur en une boucle pour obtenir un diamètre de pointe de 15-20 μm avec une longue pente progressive (4-5 mm).
3. Préparez la zone chirurgicale en désinfectant soigneusement l’appareil stéréotaxique, la hotte, le micro-injecteur (voir tableau des matériaux) et les surfaces environnantes avec de l’éthanol à 70%.
   REMARQUE: Un appareil stéréotaxique de souris est essentiel pour injecter Adeno Associated Virus (AAV) avec précision et placer la canule LED dans la région d’intérêt.
4. Portez l’équipement de protection individuelle approprié pour la procédure, y compris une blouse de laboratoire propre ou une blouse chirurgicale jetable, des gants stériles, un masque facial et un bonnet de tête jetable.
5. Placez l’équipement nécessaire près de la zone de chirurgie, comme des outils chirurgicaux stériles, des embouts en coton, des solutions, une micropipette, des embouts de pipette, des capillaires, un micro-remplissage avec de l’huile minérale et un marqueur.
6. Remplissez une pipette pour les microinjections avec de l’huile minérale et placez-la dans le micro-injecteur. Assurez-vous que le micro-injecteur fonctionne correctement en éjectant de l’huile minérale.
   REMARQUE: Tous les instruments utilisés pendant la chirurgie doivent être autoclavés et stériles. Une technique aseptique doit être utilisée.
7. Anesthésier les animaux avec de l’isoflurane gazeux 4-5% pour induire l’anesthésie et 1,2% tout au long de la chirurgie avec 0,5-1 L / min d’oxygène pur. La chirurgie ne commence qu’après que l’animal a atteint un point d’anesthésie profonde, évalué par l’absence de retrait de la patte après un léger pincement.
   1. Surveillez en permanence la fréquence respiratoire et la température de l’animal. Maintenir la température corporelle par un coussin chauffant réglé à 34 °C.
8. Appliquez une pommade ophtalmique. Enlevez les poils du cuir chevelu avec un coupe-cheveux et une crème dépilatoire. Essuyez le cuir chevelu avec des cotons-tiges contenant 8% de povidone-iode (voir tableau des matériaux) et 70% d’éthanol alternés trois fois chacun.
9. Placez la souris dans l’appareil stéréotaxique et fixez la tête, en veillant à ce que le crâne soit nivelé dans les axes médiolatéral et antérieur-postérieur.
10. Faites une incision de 1 cm avec un scalpel à travers le cuir chevelu au niveau des yeux le long de l’axe sagittal. Rétractez la peau pour exposer le crâne et nettoyez le périoste avec des cotons-tiges.
11. Nettoyez la surface du crâne avec une solution saline et des cotons-tiges stériles. Résolvez tout saignement à la surface à l’aide de lances oculaires absorbantes stériles (voir tableau des matériaux) ou d’un matériau absorbant stérile similaire.
12. Appliquez une goutte de peroxyde d’hydrogène à 2,5% avec un coton-tige et laissez-le agir pendant quelques secondes pour rendre les sutures du crâne visibles et avoir une meilleure référence. Après quelques secondes, nettoyez soigneusement avec un coton-tige propre.
13. Avec la pipette en verre (diamètre final de la pointe de 15 μm), localisez bregma et lambda pour vérifier que le crâne est nivelé dans l’axe antérieur-postérieur.
    REMARQUE: Il est recommandé d’avoir un microscope stéréoscopique ou un microscope USB pour voir la pointe de la pipette en verre. Au cas où cela serait nécessaire, ajustez la hauteur du porte-bouche pour niveler le crâne.
14. Déplacer le capillaire vers les coordonnées antérieures-postérieures (AP) et médiales-latérales (ML) sélectionnées (striatum dorsolatéral AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Peignez un point de référence dans le cuir chevelu au-dessus des coordonnées sélectionnées avec un marqueur stérile.
15. Au point de référence, effectuez une craniotomie d’environ 1 mm de diamètre en appliquant une légère pression sur le crâne avec un outil rotatif stérile ou une perceuse dentaire à une vitesse faible à moyenne avec un petit foret dentaire rond (voir Tableau des matériaux).
16. Charger le capillaire avec 300-400 nL de virus adéno-associé (AAV) dépendant de la Cre, tel que AAV1-dflox-hChR-2-mCherry pour exprimer la Channelrhodopsine ou un AAV pour exprimer uniquement la protéine rapporteure (par exemple, mCherry) comme témoin dans la région d’intérêt (voir tableau des matériaux). Vérifiez que la pointe n’est pas bouchée, puis introduisez la pipette en verre dans le cerveau aux coordonnées dorso-ventrales (DV) souhaitées (striatum dorsolatéral DV -3,35 mm).
    1. Injecter 200 nL à l’aide d’un injecteur automatique à une vitesse de 23 nL/s. Attendez 10 minutes après avoir terminé l’injection, retirez lentement la pipette en verre pour éviter tout déversement.
       REMARQUE: Il est possible d’utiliser une aiguille de 30 G pour injecter avec le micro-injecteur approprié.
17. Nettoyez et séchez tous les résidus avec des cotons-tiges.
18. Fixez la canule LED en verre stérile au bras stéréotaxique et calibrez les coordonnées en utilisant bregma comme référence. Insérez la canule très lentement (300 μm/min) pour éviter les lésions tissulaires et placez-la à 100 μm au-dessus du site d’injection.
19. Une fois la canule LED en place, ajoutez une goutte (100 μL) d’adhésif tissulaire au bord de la craniotomie.
20. Préparez un mélange de ciment dentaire (voir la table des matériaux) en suivant les instructions du fabricant pour fixer la fibre au crâne.
    REMARQUE: En bref, utilisez un plat en porcelaine réfrigérée pour avoir plus de temps de travail avant les ensembles de ciment. Ajouter 2 cuillères de poudre transparente de résine au plat en porcelaine, ajouter 4 gouttes de base rapide et 1 goutte de catalyseur, puis bien mélanger. Le rapport poudre/liquide peut être ajusté si une viscosité plus mince ou plus épaisse est nécessaire.
21. À l’aide d’une brosse stérile, appliquez le mélange de ciment dentaire autour du connecteur de la canule petit à petit, en construisant des couches jusqu’à ce que le crâne soit recouvert et que le connecteur soit solidement attaché au crâne, laissant les broches complètement libres. Évitez d’obtenir du ciment dentaire sur la peau de la souris.
22. Laisser sécher complètement.
23. Fermez la peau autour de l’implant à l’aide d’un adhésif tissulaire (voir tableau des matériaux).
24. Placer la souris dans une cage de récupération au-dessus d’un coussin chauffant à 33 ° C. Surveiller la présence d’un ou de plusieurs des signes suivants de douleur / inconfort: 1) Penché, manque ou réduction de l’activité motrice, 2) Défaut de toilettage reflété dans un pelage sale non entretenu, 3) Léchage ou grattage excessif, rougeur dans le site d’incision, 4) comportement agressif, 5) anorexie ou déshydratation, et 6) manque de formation de nid.
    REMARQUE: Gardez la souris individuellement en cage pendant toutes les procédures pour éviter le détachement de l’implant. En cas de détachement de la canule, effectuer l’euthanasie en injectant 150 mg/kg de pentobarbital de sodium suivi d’une décapitation après une anesthésie profonde.
25. Injecter par voie sous-cutanée (SC) du méloxicam 1 mg/kg une fois par jour pendant trois jours après la chirurgie pour fournir une analgésie.
26. Attendez au moins 7 jours pour la récupération complète et 14 jours pour l’expression de l’opsine avant d’autres procédures.
    REMARQUE: Effectuez un suivi postopératoire toutes les 12 heures pendant trois jours, puis vérifiez les animaux tous les jours jusqu’au jour de l’euthanasie à la fin de l’expérience.

2. Formation reach-to-grasp

1. Le jour 7 après la chirurgie, commencez le protocole de privation de nourriture²⁸. Pesez les souris pendant trois jours consécutifs pour déterminer leur poids corporel moyen ad libitum. Ensuite, planifiez des restrictions alimentaires afin que les animaux reçoivent suffisamment de nutriments pour maintenir environ 90% et au moins 85% du poids corporel.
   REMARQUE: Ceci est réalisé en fournissant 2,5-3 g de nourriture par jour. Surveillez quotidiennement le poids des animaux et notez leur bien-être général en observant le comportement et l’apparence des animaux, par exemple l’apparence du pelage et des yeux. Utilisez le système de notation de l’état corporel de la référence²⁹.
2. Pendant les périodes de pré-formation, d’entraînement et de test, fournissez à chaque souris 20 pastilles (20 mg de granulés sans poussière aromatisés au chocolat) par jour (voir la table des matériaux) (consommées pendant la tâche ou après) en plus des granulés alimentaires standard.
3. Trois jours avant l’accoutumance, dispersez 0,4 g / animal / jour 20 mg de granulés sans poussière aromatisés au chocolat dans leurs cages domestiques, afin que les souris se familiarisent avec les granulés qui servent de récompense pendant la tâche de portée à saisir.
4. Habituez les souris en les plaçant 10 minutes dans la chambre d’essai un jour avant le pré-entraînement avec des granulés dispersés sur le sol de la chambre (Figure 1A).
5. Laissez la nourriture tous les jours après l’entraînement et les tests. Gardez un horaire similaire tous les jours.
6. Le premier jour de pré-entraînement, placez les souris dans la chambre de portée à saisir et observez de face. Placez les granulés devant la chambre près de l’ouverture afin qu’ils commencent à consommer les granulés. À ce stade, les souris sont autorisées à saisir les granulés sous n’importe quelle forme.
7. Le deuxième jour du pré-entraînement, placez les granulés de plus en plus loin de l’ouverture jusqu’à ce qu’ils atteignent l’indentation (à 1 cm de l’ouverture) afin que les souris puissent façonner leur mouvement de portée à saisir (Figure 1C).
8. Entraînez les souris à courir à l’arrière de la cage et retournez à l’ouverture de la cage pour recevoir le prochain granulé de nourriture comme stratégie pour individualiser les essais.
   REMARQUE: Cela peut être réalisé en attendant que la souris soit à l’arrière de la cage avant de placer une pastille dans l’indentation pour chaque essai.
9. Placez les granulés à saisir par leur patte droite ou gauche.
   REMARQUE: Les souris commencent à utiliser de préférence une patte à saisir, qui sera utilisée les jours suivants d’entraînement et de test.
10. Entraînez les animaux pendant 6 jours en séances quotidiennes d’une durée de 20 essais ou jusqu’à ce qu’un maximum de 10 minutes s’écoule. À partir du jour 2 de la formation, mettez le récepteur simulé (dimensions 12 x 18 x 7 mm, 1 g, voir Tableau des matériaux), afin que les souris s’habituent au poids pendant l’exécution de la tâche (Figure 1B). Chaque jour, notez le nombre d’essais réussis et manqués.
11. Enregistrez le comportement avec une caméra ordinaire et capturez 30 à 60 images / s de l’avant de la chambre. De plus, on peut placer un miroir sous la chambre d’entraînement à un angle de 45° pour surveiller la posture des animaux (Figure 1D,E).
12. Pour l’analyse cinématique post-hoc (Figure 2), montez une caméra haute vitesse (voir Tableau des matériaux) à un angle de 45° pour enregistrer depuis le côté de la cage. Si une analyse 3D est nécessaire, placez une deuxième caméra haute vitesse pour enregistrer à un angle de 35° par rapport à l’avant de la chambre; les deux caméras doivent être placées dans le côté droit ou gauche de la cage en fonction de la face des animaux et doivent capturer à la même fréquence d’images et être synchronisées⁷ (Figure 3D, E).
13. Réglez les caméras haute vitesse sur 100 images/s avec une résolution de 376 x 252 pixels ou plus si possible. Placez des parois en polystyrène blanc derrière les côtés et l’arrière de la chambre pour réduire l’arrière-plan et augmenter le contraste (Figure 1E).
14. Le jour du test, remplacez l’unité simulée par un récepteur infrarouge pour la stimulation optogénétique sans fil (Figure 1B, C).
15. Lorsque les souris commencent à atteindre, tournez la canule LED manuellement avec la télécommande pour avoir une stimulation continue pendant le temps que le comportement est effectué et pas plus de 2 s. La programmation d’un paradigme de stimulation automatique est préférable. Le dispositif de stimulation déclenche une LED de 470 nm (lumière bleue) avec une intensité à la pointe de 1,0 mW/mm².
16. Recueillez les vidéos pour un examen plus approfondi, y compris la notation et l’analyse cinématique.

3. Confirmation histologique post-hoc

1. À la fin d’une expérience, confirmez l’expression virale et la mise en place de la canule LED. Anesthésier l’animal avec un cocktail de kétamine 100 mg/kg et de xylazine 10 mg/kg. Une fois que la souris présente des signes d’anesthésie profonde (étape 1.7), perfuser avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée suivie de 4% de PFA.
2. Retirez soigneusement la canule implantée en saisissant fermement le connecteur avec une pince et en tirant doucement vers le haut.
3. Extraire et post-fixer le cerveau pendant 24 h dans 4% PFA²³.
4. Effectuez des lavages de 3 à 10 minutes avec PBS.
5. Coupez le cerveau en sections de 50 μm à l’aide d’un microtome (voir Tableau des matériaux).
6. Montez les sections dans des diapositives avec des supports de montage rigides avec DAPI pour tacher les noyaux et couvrir les diapositives.
7. Après séchage, observez les sections au microscope confocal et vérifiez l’emplacement de la canule implantée et l’expression de Ch2R fusionnée avec n’importe quelle protéine fluorescente.

Résultats

La tâche de portée à saisir est un paradigme largement utilisé pour étudier la mise en forme, l’apprentissage, la performance et la cinématique du mouvement des compétences fines sous différentes manipulations expérimentales. Les souris apprennent à exécuter la tâche en quelques jours et atteignent une précision de plus de 55% atteignant un plateau après 5 jours d’entraînement (Figure 2A, B). À l’instar de ce qui a été signalé précédemment, un pour...

Discussion

L’utilisation de la manipulation optogénétique des populations neuronales dans des paradigmes comportementaux bien définis fait progresser nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents au contrôle moteur ^7,23. Les méthodes sans fil sont particulièrement adaptées aux tâches qui nécessitent des tests sur plusieurs animaux ou la libre circulation^34,35. Néanmoins, à mesure que les techniques...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia machine	RWD	R583S	Isoflurane vaporizer
Anesket	PiSA		Ketamine
Breadboard	Thorlabs	MB3090/M	Solid aluminum optical breadboard
Camera lense	Canon		50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system	BrainVision	MiCAM02	Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution	PiSA		Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber	In house
Drill bit #105	Dremel	2 615 010 5AE	Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets	Bio-Serv	F05301
Ethyl Alcohol	J.T.  Baker	9000-02	Ethanol
Eyespears	Ultracell	40400-8	Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso	VetOne	V1 502017-250	Isoflurane
Glass capillaries	Drumond Scientific	3-000-203-G/X	Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide	Farmacom		Antiseptic
High-speed camera	BrainVision	MiCAM02-CMOS	Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter	Teleopto
Insulin syringe
LED cannula	Teleopto	TelC-c-l-d	LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL	Eppendorf	Z740436
Micro-pipette puller	Sutter	P-87	Horizontal puller
Microscope LSM780	Zeiss		Confocal microscope
Microtome
Mock receiver	Teleopto
NanoJect II	Drumond Scientific	3-000-204	Micro injector
Oxygen tank	Infra	na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA	Addgene	20297	Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde	Sigma	P-6148
Phosphate saline buffer	Sigma	P-4417	Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL	ThermoFisher	AM12635	0.5-10 uL  volume
Pisabental	PiSA		Sodium pentobarbital
Plexiglass	commercial		Acrylic sheet
Povidone iodine	Farmacom		Antiseptic
Procin	PiSA		Xylacine
Puralube	Perrigo pharma	1228112	Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool	Kmoon	Mini grinder	Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus	Stoelting	51730D	Digital apparatus
Super-Bond C&B	Sun Medical		Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller	Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line	Gensat	036916-UCD	Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
TPI Vibratome 1000 plus	Peico		Microtome
Vectashield mounting media with DAPI	Vector laboratories	H-1200	Mounting media
Wireless receiver	Teleopto	TELER-1-P