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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons le processus d’isolement, de propagation et de caractérisation des bactéries dégradant les hydrocarbures des habitats aquatiques. Le protocole décrit l’isolement bactérien, l’identification par la méthode de l’ARNr 16S et le test de leur potentiel de dégradation des hydrocarbures. Cet article aiderait les chercheurs à caractériser la biodiversité microbienne dans les échantillons environnementaux, et plus particulièrement à dépister les microbes ayant un potentiel de biorestauration.

Résumé

Les polluants hydrocarbonés sont récalcitrants à la dégradation et leur accumulation dans l’environnement est toxique pour toutes les formes de vie. Les bactéries codent pour de nombreuses enzymes catalytiques et sont naturellement capables de métaboliser les hydrocarbures. Les scientifiques exploitent la biodiversité dans les écosystèmes aquatiques pour isoler les bactéries ayant un potentiel de biodégradation et de biorestauration. Ces isolats de l’environnement fournissent un riche ensemble de voies métaboliques et d’enzymes, qui peuvent être utilisées pour intensifier le processus de dégradation à l’échelle industrielle. Dans cet article, nous décrivons le processus général d’isolement, de propagation et d’identification des espèces bactériennes des habitats aquatiques et examinons leur capacité à utiliser les hydrocarbures comme seule source de carbone in vitro en utilisant des techniques simples. Le présent protocole décrit l’isolement de diverses espèces bactériennes et leur identification ultérieure à l’aide de l’analyse de l’ARNr 16S. Le protocole présente également des étapes pour caractériser le potentiel de dégradation des hydrocarbures des isolats bactériens. Ce protocole sera utile aux chercheurs qui tentent d’isoler des espèces bactériennes des habitats environnementaux pour leurs applications biotechnologiques.

Introduction

Les hydrocarbures (HC) sont largement utilisés à la fois comme combustibles et dans des applications chimiques. Les hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, le toluène et le xylène sont largement utilisés comme solvants1. Les alcènes tels que l’éthylène et le propylène servent de précurseurs dans la synthèse des polymères de polyéthylène et de polypropylène, respectivement. Polymérisation d’un autre hydrocarbure, le styrène forme du polystyrène. Les activités anthropiques introduisent des hydrocarbures dans l’environnement au cours de leur production et de leur transport. La contamination des sols et de l’eau par les hydrocarbures est très préoccupante pour l’environnement et la santé humaine. Les microbes jouent un rôle majeur dans le maintien de l’écosystème en régulant les cycles biogéochimiques et en utilisant un large éventail de substrats, qui comprennent également des polluants et des xénobiotiques, les convertissant en carbone et en source d’énergie. Ce processus de détoxification des contaminants environnementaux par les micro-organismes est connu sous le nom de biorestauration 3,4,5,6,7.

On trouve des microorganismes capables de dégrader les hydrocarbures dans les habitats aquatiques et pédologiques 8,9,10. De nombreuses bactéries ayant le potentiel de dégrader les alcanes et les HC aromatiques ont été identifiées, telles que Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter et Oleibacter11. Le développement d’approches technologiquement avancées indépendantes de la culture a permis de découvrir de nouvelles communautés microbiennes dégradant HC12. Le matériel génomique directement isolé des échantillons sources est amplifié et séquencé par des méthodes à haut débit telles que le séquençage de nouvelle génération (NGS) suivi d’une analyse éliminant le besoin de cultiver des micro-organismes. Les méthodes NGS, telles que l’analyse du métagénome, sont coûteuses et souffrent d’inconvénients liés au processus d’amplification13. Les techniques de culture telles que la culture d’enrichissement sélectif14 qui ciblent l’isolement des microbes dégradant les hydrocarbures sont toujours utiles car elles permettent aux chercheurs de sonder et de manipuler les voies métaboliques dans les isolats bactériens.

L’isolement de l’ADN génomique et le séquençage ultérieur du matériel génomique révèlent des informations précieuses sur tout organisme. Le séquençage du génome entier aide à identifier les gènes qui codent pour la résistance aux antibiotiques, les cibles médicamenteuses potentielles, les facteurs de virulence, les transporteurs, les enzymes métabolisant les xénobiotiques, etc.15,16,17. Le séquençage du gène codant pour l’ARN16Sr s’est avéré être une technique robuste pour identifier la phylogénie bactérienne. La conservation de la séquence et de la fonction des gènes au fil des ans en fait un outil fiable pour identifier les bactéries inconnues et comparer un isolat avec les espèces les plus proches. De plus, la longueur de ce gène est optimale pour l’analyse bioinformatique18. Toutes ces caractéristiques, ainsi que la facilité d’amplification des gènes à l’aide d’amorces universelles et l’amélioration de la technologie de séquençage des gènes, en font une référence en matière d’identification des microbes.

Ici, nous décrivons une procédure pour récupérer des micro-organismes cultivables ayant un potentiel de dégradation des HC à partir d’échantillons environnementaux. La méthode décrite ci-dessous décrit la collecte et l’identification des bactéries dégradant les HC et est divisée en cinq sections : (1) collecte de bactéries à partir d’échantillons d’eau, (2) isolement de cultures pures, (3) exploration de la capacité de dégradation des HC des isolats bactériens (4) isolement de l’ADN génomique et (5) identification basée sur le séquençage du gène de l’ARNr 16S et l’analyse BLAST. Cette procédure peut être adaptée pour isoler des bactéries pour de nombreuses applications biotechnologiques différentes.

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Protocole

1. Collecte, traitement et analyse des échantillons

NOTE: Ici, nous présentons un protocole pour isoler les bactéries des habitats aquatiques. Certains des isolats peuvent être pathogènes, par conséquent, portez des gants et désinfectez la zone de travail avant et après utilisation.

  1. Prélever 500 mL d’échantillon d’eau dans cinq bouteilles de verre stériles provenant de différents sites du plan d’eau. Mesurer le pH et la température de chaque échantillon à l’aide d’un pH-mètre et d’un thermomètre, respectivement.
    REMARQUE : Le protocole n’est pas spécifique au site et peut être facilement adapté pour isoler les organismes des plans d’eau contaminés par des hydrocarbures.
  2. Filtrer l’échantillon dans un lot de feuilles filtrantes de 100 mL à des feuilles filtrantes de 0,22 μm de pores, dans des conditions aseptiques.
    NOTE: Le diamètre du papier filtre ne doit pas dépasser le diamètre de la boîte de Pétri. Par exemple, un papier filtre ne dépassant pas 85 mm de diamètre est optimal pour une boîte de Petri de 100 à 120 mm.
  3. Conserver les papiers filtres sur différentes plaques de milieux nutritifs (PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M6321 et M2G22). Les différents types de milieux de croissance permettent la sélection et l’enrichissement de différents micro-organismes. Les compositions des différents milieux de culture sont énumérées dans le tableau 1. Utilisez un papier pour chaque plaque de média et décollez-la après 2 heures à l’aide de pinces stériles.
  4. Diluer en série les échantillons d’eau non filtrée (dilution 10à 6 ) dans de l’eau distillée double stérile en ajoutant 100 μL de l’échantillon d’eau recueillie dans 900 μL d’eau stérile. Il en résulte une dilution de 1:10. À partir de cet échantillon, prélever 100 μL et ajouter 900 μL d’eau stérile pour obtenir une dilution de 1:100. Répéter la dilution jusqu’à ce que le pli de dilution soit égal à 1:1 000 000. Mélanger par pipetage. Le volume final de chaque dilution sera de 1 mL.
  5. Étaler 100 μL de l’échantillon d’eau diluée individuellement sur toutes les plaques de milieux de croissance mentionnées à l’étape 3 en trois exemplaires.
  6. Incuber les plaques à 30 °C pendant 24 à 48 h selon la croissance des colonies.
    REMARQUE : La plupart des isolats environnementaux poussent à une température optimale de 30 °C. Si vous isolez les échantillons d’un environnement avec des températures extrêmes, incuber les plaques à la même température que celle du site de prélèvement.
  7. Ensuite, choisissez les colonies à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette et effectuez des stries de quadrant pour obtenir des colonies isolées.
  8. Incuber les assiettes pendant la nuit. Le lendemain, filtrez les colonies en fonction de leurs caractéristiques morphologiques telles que la couleur, la texture, la forme, la taille, la marge, l’élévation, etc. Restreak les colonies pour obtenir des cultures pures.
  9. Effectuer la coloration de gramme de chaque culture pure23 et procéder à la préparation du stock de glycérol.
  10. Pour préparer les stocks de glycérol, inoculer une seule colonie dans 3 mL de milieu de croissance approprié et incuber à 30 °C. De la culture de nuit, prélever 700 μL et ajouter 300 μL de glycérol à 100% (stérilisé par autoclavage) dans des cryoflacons24. Congeler les flacons à -80 °C pour un stockage à long terme.

2. Dégradation des hydrocarbures

REMARQUE : L’exemple ci-dessous consiste à examiner les isolats qui peuvent dégrader le styrène. Il s’agit d’une légère modification de la méthode adaptée dans un précédent rapport25. Suivez les étapes dans des conditions aseptiques.

  1. Dans une assiette fraîchement striée, cueillir une colonie et inoculer dans 5 ml de bouillon de soya tryptique (BST)/bouillon nutritif (N.-B.). Cultiver la culture pendant la nuit à 30 °C en agitant à 200 tr / min jusqu’à ce que l’absorbance atteigne ~2.
    REMARQUE : À l’exception du BST/NB, on peut choisir n’importe quel milieu de croissance dans lequel les bactéries atteignent une densité cellulaire élevée.
  2. Le lendemain, pelleter les cellules à 2862 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
  3. Laver la pastille deux fois avec 2 mL de solution saline autoclavée (0,9 % NaCl) et essorer à 2862 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE: La solution saline est isotonique et, par conséquent, elle maintient la pression osmotique à l’intérieur des cellules bactériennes.
  4. Remettez la pastille en suspension dans 2 mL de milieu basal liquide sans carbone (LCFBM). Mesurer l’absorbance (OD600).
  5. Prenez deux flacons d’erlenmeyer stériles d’une capacité de 150 ml pour le contrôle et le groupe expérimental. Étiquetez-les comme A et B.
  6. Dans le groupe témoin non inoculé (fiole A), ajouter 40 mL de LCFBM et de styrène (5 mM).
  7. Dans la fiole B, ajouter 35 mL de LCFBM et de styrène (ajuster la concentration finale de styrène à 5 mM). Ajouter la suspension cellulaire avec un ODfinal 600 de cellules ≈ 0,1 et compléter le volume restant avec LCFBM jusqu’à 40 mL. Incuber les fioles à 30 °C en agitant à 200 tr/min pendant 30 jours.
    REMARQUE: Les hydrocarbures en excès peuvent être toxiques pour les microbes, par conséquent, commencez avec une faible concentration et augmentez-la progressivement.
  8. Répéter ce qui précède pour chaque souche supplémentaire qui doit être évaluée pour la dégradation des hydrocarbures.
  9. Mesurer les DO600 de chaque fiole tous les 5 jours et tracer une courbe de croissance. Augmentez l’incubation jusqu’à 45 jours si la bactérie peut utiliser le styrène. Une augmentation de la DO600 indique que la bactérie peut métaboliser le styrène.

3. Dépistage de la dégradation des catéchols par des isolats bactériens

NOTE: La dégradation des hydrocarbures aromatiques tels que le styrène, le benzène, le xylène, le naphtalène, les phénols, etc. produit des catéchols comme intermédiaires de réaction. Les catéchols sont ensuite métabolisés par des bactéries à l’aide des enzymes catéchol 1,2-dioxygénase et catéchol 2,3-dioxygénase par les voies ortho- et méta-clivage, respectivement26. Ces enzymes sont également impliquées dans la dégradation d’autres hydrocarbures tels que le chlorobenzène27. Le protocole mentionné ci-dessous utilise le lysat de cellules entières pour le dosage enzymatique de la catéchol 2, 3-dioxygénase28. La même méthode de lyse peut être utilisée pour dépister l’activité de la catéchol 1, 2-dioxygénase. Cependant, la composition du mélange réactionnel variera. Les deux enzymes sont inductibles dans la nature et peuvent être induites par l’ajout de phénol au milieu de croissance.

  1. À l’aide d’une boucle stérile, inoculer la colonie bactérienne d’une plaque fraîchement striée dans un milieu de sels minéraux (MSM) supplémenté de 1 à 4 mM de phénol. Incuber la culture à 30 °C et 200 tr/min. Récolter la culture à 4 °C lorsque la DO 600 atteint entre 1,4 et 1,6 (c’est-à-dire en phase exponentielle tardive) en tournant à4500 x g pendant 20 min.
  2. Laver la pastille cellulaire avec un tampon phosphate (0,5 M, pH 7,5).
  3. Remettez les cellules en suspension dans le tampon phosphate mentionné ci-dessus et réglez la DO600 finale ≈ 1.0.
  4. Lyser les cellules par sonication pulsée pendant 1,5 min, la durée de chaque impulsion étant de 15 s. Après cette étape, la suspension doit être claire ou moins trouble. Sinon, augmentez le nombre d’impulsions et vérifiez si la suspension est claire. Après chaque impulsion, conservez l’échantillon sur de la glace pour éviter la dégradation des protéines.
  5. Éliminer les débris cellulaires et les cellules intactes par centrifugation à 9 000 x g pendant 30 min, en maintenant la température froide (4 °C).
  6. Pipeter soigneusement le surnageant clair. Cette fraction a l’extrait brut pour le dosage enzymatique.
  7. Déterminer la concentration en protéines de l’extrait brut par la méthode de Bradford ou de Lowry 29,30.
  8. Pour déterminer l’activité de la catéchol 2,3-dioxygénase, mesurer la formation du produit final de la réaction (semi-aldéhyde 2-hydroxymuconique) à l’aide d’un spectrophotomètre.
  9. Préparer le mélange réactionnel en ajoutant 20 μL de catéchol (50 mM), 960 μL de tampon phosphate (50 mM, pH 7,5) et 20 μL d’extrait brut.
  10. Pour le témoin négatif, remplacer l’extrait brut par un tampon phosphate et ajuster le volume final à 1 mL.
  11. Incuber le mélange réactionnel pendant 30 min. À intervalles de temps définis, mesurer l’absorbance à 375 nm. Une augmentation de l’absorbance indique la formation du produit final de la réaction, le semialdéhyde de l’acide 2-hydroxymuconique (2-HMS). Effectuez l’expérience en trois exemplaires.
    REMARQUE: Catechol est sensible à la lumière et à l’oxygène. Conserver le mélange réactionnel dans l’obscurité et fermer hermétiquement les tubes pour éviter la dégradation naturelle du catéchol.

4. Isolement de l’ADN génomique de la culture pure

NOTE: Ceci est le protocole général pour l’isolement de l’ADN génomique. La coloration au gramme a été effectuée au cours de l’étape de prélèvement, de traitement et d’analyse de l’échantillon. En raison de la variation de l’épaisseur de la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif et à Gram négatif, la méthode de lyse cellulaire est modifiée en conséquence. Portez des gants pendant l’isolement et désinfectez l’établi avec de l’éthanol à 70 % pour éviter que les nucléases ne dégradent l’ADN. Certains des produits chimiques mentionnés ci-dessous peuvent causer de graves brûlures sur la peau et des précautions appropriées doivent être prises lors de leur manipulation.

  1. Isolement de l’ADN génomique des bactéries à Gram négatif31.
    1. Prélever une seule colonie et inoculer dans un milieu de croissance frais dans des tubes à essai stériles.
    2. Placez les tubes dans un agitateur d’incubateur à 200 tr/min et laissez les bactéries se développer pendant la nuit à 30 °C.
    3. Le lendemain, granuler 1,5 mL de culture de nuit à 12 400 x g pendant 3 min.
    4. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de tampon de lyse (40 mM de tris-acétate, pH 7,8, 20 mM d’acétate de sodium, 1 mM d’EDTA, 1% de SDS).
    5. Ajouter 66 μL de solution de NaCl (5 M) et bien mélanger.
    6. Enduire en granuler le mélange obtenu à 12 400 x g pendant 10 min (4 °C).
    7. Pipeter le surnageant transparent dans un tube microcentrifuge frais et ajouter un volume égal de chloroforme.
    8. Retourner mélanger la solution plusieurs fois jusqu’à ce qu’une solution laiteuse soit observée.
    9. Faire tourner à 12 400 x g pendant 3 min et transférer le surnageant dans un flacon propre.
    10. Ajouter 1 mL d’éthanol 100 % glacé; mélanger par inversion jusqu’à ce que des brins blancs d’ADN précipitent.
    11. Centrifuger l’ADN précipité à 2 200 x g pendant 10 min à 4 °C et éliminer le surnageant.
    12. Lavez la pastille d’ADN avec 1 mL d’éthanol à 70 % et laissez sécher la pastille d’ADN pendant 5 minutes à température ambiante.
    13. Une fois séchée, remettre la pastille en suspension dans 100 μL de 1x tampon Tris-EDTA(TE) et stocker l’ADN à -20 °C.
    14. Mesurer la concentration (A260/280) à l’aide d’un spectrophotomètre et exécuter l’ADN sur gel d’agarose (1%) pour évaluer la qualité de l’ADN24.
  2. Isolement de l’ADN génomique de la souche à Gram positif32
    1. Prélever une seule colonie et inoculer dans un milieu de croissance frais dans des tubes à essai stériles.
    2. Placez les tubes dans un agitateur d’incubateur à 200 tr / min et laissez les bactéries se développer pendant la nuit à une température de croissance appropriée.
    3. Le lendemain, prendre 1,5 mL de la culture cultivée et centrifuger à 8 600 x g pendant 5 min.
    4. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le tampon TE.
    5. Régler le OD600 = 1,0 avec le tampon TE et transférer 740 μL de la suspension cellulaire dans un tube à microfuge propre.
    6. Ajouter 20 μL de lysozyme (100 mg/mL de bouillon) et bien mélanger par pipetage. Incuber à 37 °C pendant 30 min (dans un bain sec).
    7. Ajouter 40 μL de FDS à 10% et bien mélanger.
    8. Ajouter 8 μL de protéinase K (10 mg/mL). Bien mélanger et incuber à 56 °C pendant 1-3 h (dans un bain sec). La suspension devrait devenir claire maintenant avec une viscosité accrue, marquant une lyse cellulaire efficace.
      REMARQUE: La suspension peut être laissée pendant la nuit si les cellules ne sont pas lysées correctement.
    9. Préchauffer le mélange CTAB/NaCl à 65 °C (dans un bain sec) et ajouter 100 μL de ce mélange à la suspension cellulaire. Bien mélanger.
    10. Incuber à 65 °C pendant 10 min (dans un bain sec).
    11. Ajouter 500 μL de chloroforme:alcool isoamylique (24:1) et bien mélanger. Essorer à 16 900 x g pendant 10 min à 25 °C.
    12. Transférer la phase aqueuse dans un tube microcentrifuge frais en évitant la phase organique (phase visqueuse au fond).
    13. Ajouter délicatement 500 μL d’alcool phénol:chloroforme:isoamylique (25:24:1) et bien mélanger. Essorer à 16 900 x g pendant 10 min à 25 °C.
    14. Prendre la phase aqueuse dans un nouveau tube microcentrifugeux. Ajouter 500 μL de chloroforme:alcool isoamylique (24:1) et bien mélanger.
    15. Transférer la phase aqueuse et ajouter 0,6 volume d’isopropanol (prérefroidi à -20 °C).
    16. Les brins d’ADN précipités doivent être visibles sous forme filiforme. Incuber à -20 °C pendant 2 h à toute la nuit.
    17. Centrifuger à 16 900 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler l’ADN.
    18. Décanter soigneusement l’isopropanol et laver la pastille avec 1 mL d’éthanol froid à 70 % (prérefroidi à -20 °C) pour éliminer les impuretés.
    19. Centrifuger à 16 900 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
    20. Laisser sécher la pastille à température ambiante pendant 20 min ou maintenir le tube à 37 °C. Assurez-vous que le granulé n’est pas trop séché.
    21. Remettez en suspension dans 100 μL de 1x tampon TE et stockez l’ADN à -20 °C.
      REMARQUE : Si la pastille est trop sèche et qu’il est difficile de la remettre en suspension, incuber le tube microcentrifuge avec de la pastille d’ADN et de l’eau exempte de nucléases à 37 °C pendant 15 à 20 minutes et remettre en suspension à nouveau par pipetage.
    22. Mesurer la concentration (A260/280) à l’aide d’un spectrophotomètre après avoir effectué une dilution de 1:100 dans un tampon TE 1x et exécuter l’ADN sur gel d’agarose (1%) pour évaluer la qualité de l’ADN24.

5. Séquençage de l’ARNr 16S

REMARQUE: Le protocole décrit ci-dessous concerne l’amplification et le séquençage de l’ARNr 16S pour l’identification bactérienne. L’information dérivée de la séquence d’ARNr 16S est utilisée pour l’identification d’un organisme inconnu et pour trouver la parenté entre différents organismes.

  1. Pour identifier les souches, amplifier l’ADN isolé des cultures bactériennes pures par PCR avec des amorces universelles ciblant la séquence d’ARNr 16S pour les bactéries : 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') et 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
  2. Préparer le mélange de PCR (réactions de 25 μL) sur de la glace avec 18 μL d’eau autoclavée/sans nucléase, 2,5 μL de tampon 10x, 0,5 μL d’amorces avant et arrière (100 μM de stock), 2 μL du mélange de dNTP (100 μM stock), 1 μL de matrice d’ADN (2-15 ng/μL) et 1 U de Taq Polymérase.
  3. Utiliser les conditions de cycle suivantes pour l’amplification du gène de l’ARNr 16S : Dénaturation initiale à 94 °C pendant 10 min (dénaturation finale à 94 °C pendant 40 s, recuit de l’amorce à 56 °C pendant 1 min, extension à 74 °C pendant 2 min) x 30 cycles, extension finale à 74 °C pendant 10 min.
  4. Une fois le cycle terminé, mélanger 5 μL d’échantillon et 1 μL de colorant de chargement d’ADN 5x. Exécutez sur du gel d’agarose à 1% pour vérifier l’amplification. Conservez les produits PCR à 4 °C à court terme ou congelez-les à -20 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
  5. Pour le séquençage du gène de l’ARNr 16S, mettre en place la même réaction que celle mentionnée ci-dessus pour un volume plus élevé (100 μL).
  6. Purifier les amplicons pour le séquençage de Sanger24,34 à l’aide du kit de purification de produit PCR ou mélanger l’échantillon entier avec un colorant de chargement d’ADN et charger sur un gel d’agarose pour effectuer la méthode d’extraction du gel.
  7. Une fois le séquençage terminé, convertissez le fichier de résultats au format FASTA et vérifiez la similitude de séquence avec l’outil de recherche d’alignement local de base (BLAST) sur NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.

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Résultats

Le schéma décrivant l’ensemble de la procédure d’isolement et de criblage des bactéries des habitats aquatiques et leur identification ultérieure par l’analyse de l’ARNr 16S est représenté à la figure 1. Des échantillons d’eau prélevés dans une zone humide de Dadri, en Inde, ont été prélevés dans des bouteilles en verre stériles et immédiatement emmenés au laboratoire pour traitement. Les échantillons ont été passés à travers des feuilles fil...

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Discussion

Il est bien établi que seulement environ 1% des bactéries sur Terre peuvent être facilement cultivées en laboratoire6. Même parmi les bactéries cultivables, beaucoup restent non caractérisées. L’amélioration des méthodes moléculaires a donné une nouvelle dimension à l’analyse et à l’évaluation des communautés bactériennes. Cependant, ces techniques ont des limites, mais elles ne rendent pas les analyses de culture redondantes. Les techniques de culture pure pour isoler des e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions le Dr Karthik Krishnan et les membres du laboratoire de RP pour leurs commentaires et suggestions utiles. DS est soutenu par la bourse SNU-Doctoral et la bourse Earthwatch Institute India. Le laboratoire RP est soutenu par une subvention CSIR-EMR et des fonds de démarrage de l’Université Shiv Nadar.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA4718Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Growth medium component
Ammonium sulphateSigma-AldrichA4418Growth medium component
Bacto-AgarMillipore1016141000Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2)MERCKC4901-500GGrowth medium component
CatecholSigma-Aldrich135011Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTABSigma-AldrichH6269Genomic DNA Isolation
ChloroformHIMEDIAMB109Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Growth medium component
EDTASigma-AldrichE9884gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Growth medium component
GlucoseSigma-AldrichG7021Growth medium component
GlycerolSigma-AldrichG5516Growth medium component; Glycerol stocks
IsopropanolHIMEDIAMB063Genomic DNA isolation
LB AgarDifco244520Growth medium
Luria-Bertani (LB)Difco244620Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4)MERCKM2643Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20)Sigma-Aldrich221287Growth medium component
Nutrient Broth (NB)Merck (Millipore)03856-500GGrowth medium
PeptoneMerck91249-500GGrowth medium component
PhenolSigma-AldrichP1037Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Growth medium component
Proteinase KThermoFisher ScientificAM2546Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kitQIAGEN160016235DNA purification
QIAquick PCR Purification kitQIAGEN163038783DNA purification
R2A AgarMillipore1004160500Growth medium
SmartSpec Plus SpectrophotometerBIO-RAD4006221Absorbance measurement
Sodium acetateSigma-AldrichS2889Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS)Sigma-AldrichL3771Genomic DNA isolation
StyreneSigma-AldrichS4972Styrene biodegradation
Taq DNA PolymeraseNEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB)Merck22092-500GGrowth medium
Yeast extractSigma-AldrichY1625-1KGGrowth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376Growth medium component

Références

  1. Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
  2. Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578(2020).
  3. Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
  4. Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
  5. Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408(2020).
  6. Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
  7. Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
  8. Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
  9. Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
  10. Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
  11. Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879(2021).
  12. Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530(2012).
  13. Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459(2016).
  14. Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543(2018).
  15. Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482(2018).
  16. Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
  17. Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
  18. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  19. Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
  20. Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
  21. Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
  22. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
  23. R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  24. Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890(2012).
  25. Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
  26. Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
  27. Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
  28. Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  30. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  31. Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260(1993).
  32. William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
  33. Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
  34. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  35. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
  36. Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
  37. Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594(2020).
  38. Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  39. Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840(2004).
  40. Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
  41. Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
  42. du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
  43. Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  44. Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
  45. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
  46. Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
  47. Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71(2010).
  48. Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191(2000).
  49. Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).

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