Génération d’une xénogreffe orthotopique de cellules cancéreuses du pancréas par injection guidée par ultrasons

Résumé

Nous présentons un protocole pour générer un modèle orthotopique de cancer du pancréas mini-invasif par injection guidée par ultrasons de cellules cancéreuses du pancréas humain et la surveillance ultérieure de la croissance tumorale in vivo par imagerie échographique.

Résumé

Le cancer du pancréas (PCa) représente l’un des types de cancer les plus meurtriers au monde. Les raisons de la malignité PCa reposent principalement sur son comportement malin intrinsèque et sa résistance élevée aux traitements thérapeutiques. En effet, malgré de nombreux efforts, la chimiothérapie standard et les thérapies cibles innovantes ont considérablement échoué lorsqu’elles sont passées de l’évaluation préclinique au cadre clinique. Dans ce scénario, le développement de modèles murins précliniques imitant mieux les caractéristiques in vivo du PCa est nécessaire de toute urgence pour tester les médicaments nouvellement développés. Le présent protocole décrit une méthode pour générer un modèle murin de PCa, représenté par une xénogreffe orthotopique obtenue par injection guidée par ultrasons de cellules tumorales pancréatiques humaines. En utilisant un protocole aussi fiable et peu invasif, nous fournissons également des preuves de greffe in vivo et de développement de masses tumorales, qui peuvent être surveillées par imagerie par ultrasons (US). Un aspect notable du modèle PCa décrit ici est le développement lent des masses tumorales au fil du temps, ce qui permet une identification précise du point de départ des traitements pharmacologiques et un meilleur suivi des effets des interventions thérapeutiques. De plus, la technique décrite ici est un exemple de mise en œuvre des principes des 3R puisqu’elle minimise la douleur et la souffrance et améliore directement le bien-être des animaux en recherche.

Introduction

Le PCa, et sa forme la plus courante, le carcinome adéno canalaire pancréatique (PDAC), est l’une des causes les plus fréquentes de décès liés au cancer avec un taux de survie à 1 an inférieur à 20% et un taux de survie à 5 ans de 8%, quel que soit le stade ^1,2. La maladie est presque toujours mortelle et son incidence devrait continuer d’augmenter au cours des prochaines années, contrairement à d’autres types de cancer, dont l’incidence est en baisse³. Des facteurs tels que la détection tardive du cancer, la tendance à la progression rapide et le manque de thérapies spécifiques conduisent à un mauvais pronostic de PCa⁴. De grands progrès dans la recherche sur le cancer ont été obtenus, grâce au développement de modèles murins précliniques plus précis. Les modèles ont fourni des informations appropriées pour la compréhension du mécanisme moléculaire sous-jacent au cancer et pour le développement de nouveaux traitements⁵. Ces avancées s’appliquent mal au PCa qui, malgré de gros efforts récents, reste résistant aux traitements chimiothérapeutiques actuels¹. Pour ces raisons, le développement de nouvelles approches pour améliorer les perspectives des patients est obligatoire.

Au fil des années, de nombreux modèles de souris PCa ont été développés, y compris les xénogreffes, qui sont les modèles les plus utilisés de nos^jours5. Les modèles de xénogreffe sont classés comme hétérotopiques sous-cutanés et orthotopiques, en fonction de l’emplacement des cellules tumorales implantées. Les xénogreffes hétérotopiques sous-cutanées sont plus faciles et moins coûteuses à réaliser, mais manquent certaines caractéristiques de la PCa (c’est-à-dire le microenvironnement tumoral particulier, caractérisé par l’accumulation de tissu fibreux, l’hypoxie, l’acidité et l’angiogenèse)^6,7. Cela explique pourquoi les xénogreffes sous-cutanées ne fournissent souvent pas de données solides pour les traitements thérapeutiques, ce qui conduit à des échecs lorsqu’elles sont traduites en milieu clinique⁸. D’autre part, les xénogreffes orthotopiques ressemblent davantage au microenvironnement tumoral, ce qui permet de mieux imiter le développement naturel de la maladie. En outre, les xénogreffes orthotopiques sont plus appropriées pour étudier le processus métastatique et les caractéristiques invasives de PCa, qui ne se produisent presque pas dans les modèles sous-cutanés⁹. Dans l’ensemble, les modèles murins de xénogreffe orthotopique sont aujourd’hui préférés pour effectuer des tests précliniques^{de médicaments 9,10}. Les xénogreffes orthotopiques reposent généralement sur des procédures chirurgicales pour implanter des cellules ou de très petits morceaux de tissu tumoral dans le pancréas. En effet, plusieurs articles basés sur des modèles chirurgicaux de PCa ont été publiés au cours des dernières décennies¹¹. Cependant, la qualité et le résultat de l’intervention chirurgicale pour l’établissement d’un modèle de tumeur orthotopique dépendent fortement de la compétence technique de l’opérateur. Un autre point clé pour une xénogreffe PCa orthotopique réussie pour une approche clinique translationnelle est la possibilité d’établir une maladie localisée avec une cinétique de croissance prévisible.

Pour répondre à ces problèmes, nous décrivons ici une procédure innovante pour produire une xénogreffe orthotopique PCa, exploitant l’injection guidée par ultrasons (US) de cellules PCa humaines dans la queue du pancréas chez des souris immunodéficientes. Cette procédure génère un modèle de souris PCa fiable. La croissance tumorale est suivie in vivo par l’imagerie américaine.

Protocole

Le présent protocole a reçu l’approbation du ministère italien de la Santé avec le numéro d’autorisation 843/2020-PR. Afin d’assurer des conditions d’asepsie, les animaux ont été maintenus à l’intérieur de la salle barrière du vivarium des animaux de recherche (Ce.S.A.L.) de l’Université de Florence. Toutes les procédures ont été effectuées dans le même espace où les souris étaient logées dans les installations LIGeMA de l’Université de Florence (Italie).

1. Préparation cellulaire

1. Culture de cellules PCa de la lignée cellulaire PCa dans une boîte de Petri de 100 mm contenant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 2% de L-glutamine et 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
2. Incuber les cellules dans la normoxie à 37 °C avec 5% de CO₂.
3. Détacher les cellules avec de la trypsine. Comptez et remettez en suspension 1 x 10⁶ cellules dans 20 μL de PBS, 1 h avant l’inoculation.

2. Préparation de souris pour l’injection guidée par ultrasons (US-GI)

REMARQUE: Les étapes suivantes ont été effectuées dans des conditions stériles. L’ensemble de la procédure d’injection guidée par les États-Unis, du début de l’anesthésie jusqu’à ce que la souris soit retirée de la plate-forme animale, prend environ 10-12 minutes plus 5 minutes pour une récupération complète de la souris.

1. Juste avant l’intervention, administrer du carprofène (AINS) par voie sous-cutanée (s.c.) à une dose finale de 5 mg/kg ou du tramadol à une dose finale de 5 mg/kg à l’aide d’une seringue à tuberculine avec une aiguille de 27 G.
   NOTE: Pour le présent protocole, 20 souris femelles Athymic Nude-Foxn^1nu ont été utilisées. Les souris étaient âgées de 8 semaines et pesaient 20-22 g.
2. Allumez l’imageur et sélectionnez Souris (petite) abdominale dans le menu de l’application du panneau du transducteur. Assurez-vous que la fenêtre d’imagerie Mode B (Mode luminosité) s’affiche et que le système est prêt à acquérir des données en mode B.
   REMARQUE: B-Mode est le mode d’imagerie par défaut du système. Le système affiche les échos dans une vue bidimensionnelle (2D) en attribuant un niveau de luminosité basé sur l’amplitude du signal d’écho. Le mode B est le mode le plus efficace pour localiser les structures anatomiques.
   1. Accédez à la Banque d’études.
   2. Sélectionnez Nouvelle étude et tapez le nom et les informations de l’étude, c.-à-d. la date de l’étude, etc.
   3. Remplissez toutes les informations nécessaires dans le nom de la série, c’est-à-dire la souche animale, la pièce d’identité, la date de naissance, etc.
   4. Appuyez sur Terminé; le programme est prêt pour l’imagerie en mode B.
3. Anesthésier la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie en utilisant 4% d’isoflurane avec un débit gazeux de 2 L/min de_O2.
   REMARQUE: Environ 4 minutes suffisent pour une anesthésie correcte (respiration autour de 50-60 respirations par minute).
4. Une fois la souris anesthésiée, modifiez la connexion de l’appareil anesthésique pour diriger l’isoflurane vers la table de manipulation de la souris.
5. Placer la souris anesthésiée sur son flanc droit sur la table de manipulation (chauffée à 37 °C) avec son museau dans un cône nasal pour s’assurer que la souris est anesthésiée à l’aide d’isoflurane à 2 % avec un débit gazeux de 0,8 L/min d’O2 (Figure 1A).
6. Appliquez une goutte de larmes artificielles sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
7. Collez fermement la main droite, le pied droit et la queue sur les électrodes de la plate-forme animale avec de la gaze adhésive.
   REMARQUE: La fréquence respiratoire et l’électrocardiogramme (ECG) de la souris sont enregistrés à travers les électrodes.

3. Injection de cellules PANC1 dans le pancréas par la méthode US-GI

1. Désinfectez la peau de souris avec de l’éthanol à 70% et maintenez la peau du flanc gauche étirée à l’aide de gaze adhésive.
   REMARQUE: Garder la peau étirée est important pour réduire la résistance à l’insertion de l’aiguille et pour prévenir les déformations de l’aiguille.
2. Appliquer le gel à ultrasons sur l’abdomen et le flanc gauche de la souris à l’aide d’une seringue de 20 ml (sans l’aiguille).
3. À l’aide du bouton de contrôle de la hauteur du transducteur US, abaissez le transducteur pour toucher le flanc gauche de la souris et placez-le transversalement sur le corps de l’animal.
4. Déplacez le transducteur pour visualiser le pancréas sur l’écran du transducteur à l’aide de l’imagerie en mode B (Figure 1B).
5. Préparer une seringue Hamilton de 50 μL, contenant 1 x 10⁶ cellules PANC1 en suspension dans 20 μL de PBS, avec une aiguille de 30 mm 28 G et placer la seringue sur le support approprié (figure 1C).
   REMARQUE: Avant utilisation, désinfectez l’aiguille de la seringue avec de l’éthanol à 70% pendant une période de 5 à 10 minutes.
6. À l’aide du micromanipulateur porteur, abaisser la seringue sur la peau de la souris, avec le biseau de l’aiguille vers le haut et dans le même plan que le transducteur à ultrasons, formant un angle de 45° avec le transducteur (Figure 1D).
   REMARQUE: À partir de cette étape, procédez en surveillant l’image américaine à l’écran.
7. À l’aide du micromanipulateur, perforez la peau et insérez l’aiguille de la seringue dans le pancréas et observez l’image US sur l’écran, pour suivre sa trajectoire (Figure 1E).
   REMARQUE: Avant l’injection, prenez la queue du pancréas comme référence qui est située derrière la rate et près du rein gauche.
8. Une fois l’aiguille insérée dans le pancréas, injecter un bolus de 20 μL contenant les cellules directement dans le pancréas en appliquant une pression constante sur le piston de la seringue (Figure 1F).
   REMARQUE: La procédure d’injection correcte est vérifiée par la présence d’une petite bulle dans le pancréas et l’écoulement du liquide hypoéchogénique, qui est à peine visible de la pointe de l’aiguille.
9. Laissez l’aiguille en place pendant 5 à 10 secondes après l’injection de tout le bolus, puis rétractez-la lentement.
10. Retirez le transducteur US, nettoyez le gel du flanc et placez la souris seule dans une nouvelle cage. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale.

4.3D Imagerie américaine pour la surveillance des tumeurs pancréatiques chez la souris

REMARQUE: L’évaluation du développement tumoral a été réalisée à partir de 8 jours après l’injection cellulaire, en utilisant le même instrument utilisé pour l’injection guidée par les États-Unis (répertorié dans le tableau des matériaux). Par conséquent, certaines procédures, telles que l’allumage du système (étape 2.2.), l’anesthésie (étapes 2.3. - 2.6.) et le placement de la souris sur la plate-forme animale (étape 2.7.), correspondent parfaitement à ce qui a été décrit ci-dessus dans le protocole.

1. Avant de commencer l’imagerie américaine, configurez le poste de travail comme illustré à la figure 2A.
2. Fixez le transducteur sur le système de moteur 3D (Figure 2A).
3. Activez l’imageur et sélectionnez Nouvelle étude dans le navigateur d’études.
4. Placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie (isoflurane à 4%).
5. Placer la souris anesthésiée sur son flanc droit sur la table de manipulation chauffée à 37 °C avec son museau dans le tube anesthésique et réduire l’isoflurane à 2 % (figure 2B).
   REMARQUE: Il est important que la souris soit placée dans la même position que l’injection guidée par les États-Unis, afin de conserver les mêmes références anatomiques.
6. Appliquez une goutte de pommade vétérinaire sur les yeux de la souris.
7. Appliquez une couche de gel à ultrasons sur l’abdomen et le flanc gauche de la souris.
8. Placez le transducteur de 55 MHz dans l’orientation transversale pour toucher la peau du flanc gauche de telle sorte que le pancréas soit approximativement centré (figure 2C).
9. Utilisez le moteur 3D pour acquérir des images de l’ensemble du pancréas dans l’orientation transversale, en rassemblant idéalement 90 à 100 images par acquisition (le nombre d’images peut varier en fonction du choix personnel).
   1. Sélectionnez la position du moteur 3D sur le pavé tactile de l’imageur.
   2. Indiquez la distance de balayage en déplaçant le curseur pour acquérir des images de l’ensemble du pancréas des deux extrémités.
   3. Sélectionnez Scan Frames et commencez l’acquisition 3D.
10. Une fois l’imagerie 3D terminée, retirez le transducteur, nettoyez le gel de la peau et placez la souris seule dans une nouvelle cage pour la récupération. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale.

Résultats

Conformément au protocole décrit ci-dessus, les souris ont d’abord été anesthésiées dans une chambre d’isoflurane et placées sur la plateforme animale (Figure 1A). Le pancréas a été visualisé par échographie (figure 1B). Une seringue Hamilton de 50 μL a été chargée de 1 x 10⁶ cellules PANC1 suspendues dans 20 μL de PBS et placée sur le porte-aiguille (figure 1C). L’angle optimal entre la seringue e...

Discussion

Bien que l’utilisation de l’imagerie américaine soit répandue en clinique, le développement tumoral dans de nombreux modèles murins précliniques est généralement décrit à l’aide de l’imagerie bioluminescente¹¹. Ce dernier est un moyen indirect d’évaluer la greffe et l’expansion tumorale et il ne fournit pas non plus une cinétique de croissance tumorale fiable. Dans la présente étude, nous avons appliqué l’imagerie américaine pour effectuer une injection cellulaire ains...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157