Isolement de cellules endothéliales de la lumière des artères carotides de souris pour des expériences multi-omiques unicellulaires

Sandeep Kumar; Aitor Andueza; Nicolas Villa-Roel; Juyoung Kim; Dong-Won Kang; Hanjoong Jo

doi:10.3791/63128

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Isolement de cellules endothéliales de la lumière des artères carotides de souris pour des expériences multi-omiques unicellulaires

DOI:

10.3791/63128

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October 4th, 2021

Sandeep Kumar*¹, Aitor Andueza*¹, Nicolas Villa-Roel¹, Juyoung Kim¹, Dong-Won Kang¹, Hanjoong Jo¹^,²

¹Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, ²Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University

* Ces auteurs ont contribué à parts égales

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Résumé

Nous présentons une méthode pour isoler les cellules endothéliales et les noyaux de la lumière des artères carotides de souris exposées à des conditions d’écoulement stables ou perturbées pour effectuer des expériences omiques unicellulaires.

Résumé

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire des régions artérielles exposées à un flux sanguin perturbé (d-flow). Le flux D régule l’expression des gènes dans l’endothélium aux niveaux transcriptomique et épigénomique, ce qui entraîne des réponses proathérogènes. Récemment, des études de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) et de dosage unicellulaire pour le séquençage de la chromatine accessible par transposase (scATACseq) ont été réalisées pour déterminer les changements transcriptomiques et d’accessibilité de la chromatine à une résolution unicellulaire à l’aide du modèle de ligature partielle des carotides (LCP) chez la souris. Comme les cellules endothéliales (CE) représentent une fraction mineure des populations cellulaires totales dans la paroi artérielle, une méthode de digestion luminale a été utilisée pour obtenir des préparations unicellulaires enrichies en CE. Pour cette étude, des souris ont été soumises à une chirurgie PCL pour induire un flux d dans l’artère carotide gauche (ACL) tout en utilisant l’artère carotide droite (RCA) comme témoin. Les artères carotides ont été disséquées deux jours ou deux semaines après la chirurgie du LCP. La lumière de chaque carotide a été soumise à une digestion de collagénase et des cellules uniques enrichies en endothéliales ou des noyaux simples ont été obtenus. Ces préparations unicellulaires et mononucléiformes ont ensuite été codées à barres à l’aide d’une configuration microfluidique 10x Genomics. Les cellules uniques et les noyaux uniques codés à barres ont ensuite été utilisés pour la préparation de l’ARN, la génération de bibliothèques et le séquençage sur un séquenceur d’ADN à haut débit. Après le traitement bioinformatique, les ensembles de données scRNAseq et scATACseq ont identifié divers types de cellules à partir de la digestion luminale, principalement constituées de CE. Des cellules musculaires lisses, des fibroblastes et des cellules immunitaires étaient également présents. Cette méthode d’enrichissement de la CE a aidé à comprendre l’effet du flux sanguin sur l’endothélium, ce qui aurait pu être difficile avec la méthode de digestion de l’artère totale. La méthode de préparation unicellulaire enrichie en CE peut être utilisée pour effectuer des études omiques unicellulaires chez des souris knockouts EC et transgéniques lorsque l’effet du flux sanguin sur ces gènes n’a pas été étudié. Il est important de noter que cette technique peut être adaptée pour isoler des cellules uniques enrichies en CE à partir d’explants d’artères humaines afin d’effectuer des études mécanistiques similaires.

Introduction

Ce laboratoire a précédemment démontré que l’induction du flux d conduit à un développement rapide et robuste de l’athérosclérose chez les souris hyperlipidémiques ^1,2. Le nouveau modèle murin d’athérosclérose induite par le flux d a été possible en utilisant la chirurgie de ligature carotidienne partielle (LCP) ³. La chirurgie PCL induit un débit sanguin faible et oscillatoire ou un flux d dans l’artère carotide gauche ligaturée (ACL). En revanche, l’artère carotide droite controlatérale (ARC) continue de faire face à un flux laminaire stable (s-flux....