Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Résumé

Ce protocole vise à isoler les ARNm ribosomales de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP.

Résumé

L’hétérogénéité cellulaire pose des défis pour comprendre la fonction des tissus complexes au niveau du transcriptome. L’utilisation d’ARN spécifiques au type cellulaire évite les pièges potentiels causés par l’hétérogénéité des tissus et libère la puissante analyse du transcriptome. Le protocole décrit ici montre comment utiliser la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purity) pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir d’une petite quantité de cellules exprimant l’EGFP dans un tissu complexe sans tri cellulaire. Ce protocole convient à l’isolement d’ARN spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP récemment disponible et pourrait également être utilisé pour isoler les ARN de toutes les cellules exprimant l’EGFP.

Introduction

Les approches à haut débit, y compris le séquençage de l’ARN (RNA-seq) et les microarrays, ont permis d’interroger les profils d’expression génique à l’échelle du génome. Pour les tissus complexes tels que le cœur, le cerveau et les testicules, les données spécifiques au type cellulaire fourniront plus de détails comparant l’utilisation des ARN du tissu entier ^1,2,3. Pour surmonter l’impact de l’hétérogénéité cellulaire, la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purifie) est développée depuis le début des années 2010⁴. TRAP est capable d’isoler les ARN liés aux ribosomes de types cellulaires spécifiques sans dissociation tissulaire. Cette méthode a été utilisée pour l’analyse des translatomes (ARNm qui sont recrutés sur le ribosome pour la traduction) dans différents organismes, y compris le ciblage d’une population extrêmement rare de cellules musculaires chez les embryons de drosophile⁵, l’étude de différentes cellules racinaires dans la plante modèle Arabidopsis thaliana⁶ et l’analyse du transcriptome des cellules endothéliales chez les mammifères⁷.

TRAP nécessite une modification génétique pour marquer le ribosome d’un organisme modèle. Evan Rosen et ses collègues ont récemment développé un modèle murin appelé Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) ^{mouse 8}, disponible auprès du Jackson Laboratory depuis 2017. En croisant avec une lignée de souris Cre, les chercheurs peuvent utiliser ce modèle murin NuTRAP pour isoler les ARN liés aux ribosomes et les noyaux cellulaires des cellules exprimant Cre sans tri cellulaire. Dans les cellules exprimant Cre qui portent également l’allèle NuTRAP , le ribosome marqué EGFP/L10a permet l’isolement des ARNm transposés à l’aide de tests d’affinité. Dans la même cellule, la membrane nucléaire marquée au peptide de reconnaissance de la biotine ligase (BLRP), qui est également positive à la cerise, permet l’isolement nucléaire en utilisant une purification basée sur l’affinité ou la fluorescence. La même équipe de recherche a également généré une lignée de souris similaire dans laquelle la membrane nucléaire est marquée uniquement avec mCherry sans biotine⁸. Ces deux lignées de souris génétiquement modifiées donnent accès à la caractérisation des profils épigénomiques et transcriptomiques appariés de types spécifiques de cellules d’intérêt.

La voie de signalisation du hérisson (Hh) joue un rôle essentiel dans le développement des tissus⁹. GLI1, un membre de la famille GLI, agit comme un activateur transcriptionnel et médie la signalisation Hh. Les cellules Gli1⁺ peuvent être trouvées dans de nombreux organes sécrétant des hormones, y compris la glande surrénale et le testicule. Pour isoler les ADN et les ARN spécifiques du type cellulaire des cellules Gli1⁺ à l’aide du modèle murin NuTRAP, des souris Gli1-CreER^T2 ont été croisées avec les souris NuTRAP . Des souris Shh-CreER^T2 ont également été croisées avec les souris NuTRAP visant à isoler les cellules exprimant sonic hedgehog (Shh). Le protocole suivant montre comment utiliser Gli1-CreER^T2; Des souris NuTRAP pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir de cellules Gli1⁺ dans des testicules de souris adultes.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux effectuées ont suivi les protocoles approuvés par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’Auburn.

REMARQUE: Le protocole suivant utilise un testicule (environ 100 mg) à P28 de Gli1-CreER^T2; Souris NuTRAP (Mus musculus). Les volumes de réactifs peuvent devoir être ajustés en fonction des types d’échantillons et du nombre de tissus.

1. Prélèvement de tissus

1. Euthanasier les souris à l’aide d’une chambre CO₂ , désinfecter la surface de l’abdomen avec de l’éthanol à 70%.
2. Ouvrez le bas-ventre avec des ciseaux et retirez les testicules. Utilisez de l’azote liquide (LN₂) pour congeler immédiatement les testicules.
3. Conserver les échantillons dans la phase vapeur de LN₂ jusqu’à utilisation.

2. Préparation des réactifs et des billes

1. Préparer la solution mère d’homogénéisation : Ajouter 50 mM de Tris (pH 7,4), 12 mM de MgCl₂, 100 mM de KCl, 1 % de NP-40 et 1 mg/mL d’héparine. Conserver la solution à 4 °C jusqu’à utilisation (jusqu’à 1 mois).
2. Préparer le tampon de travail d’homogénéisation à partir de la solution mère (étape 2.1) fraîchement avant utilisation : Ajouter le DTT (concentration finale : 1 mM), le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL), la ribonucléase recombinante (concentration finale : 200 unités/mL) et le cocktail inhibiteur de protéase (concentration finale : 1x) à la solution mère d’homogénéisation pour obtenir la quantité requise du tampon de travail d’homogénéisation. Conserver le tampon de travail fraîchement préparé sur de la glace jusqu’à utilisation.
3. Préparez les tampons de lavage à faible teneur en sel et à haute teneur en sel :
   1. Pour préparer un mélange tampon de lavage à faible teneur en sel, 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl₂, 100 mM KCl et 1% NP-40. Ajouter le DTT (concentration finale : 1 mM) et le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL) avant utilisation.
   2. Pour préparer un mélange tampon de lavage à haute teneur en sel 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl₂, 300 mM KCl, 1% NP-40. Ajouter le DTT (concentration finale : 2 mM) et le cycloheximide (concentration finale : 100 μg/mL) avant utilisation.
4. Préparer des billes de protéines G (tableau des matières) :
   1. Chaque échantillon nécessitera 50 μL de billes de protéine G. Placez la quantité requise de billes dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et séparez les billes de la solution à l’aide d’une grille magnétique en laissant le tube sur le rack pendant 30 à 60 s.
   2. Retirer le surnageant par pipetage. Lavez les billes trois fois avec 1 ml de tampon de lavage glacé à faible teneur en sel à chaque fois.

3. Lyse tissulaire et homogénéisation

1. Ajouter 2 mL de tampon de travail d’homogénéisation à froid glacé (fraîchement préparé à partir de l’étape 2.2) dans un ensemble de broyeur de tissu en verre. Placez rapidement l’échantillon congelé dans le broyeur et homogénéisez le tissu en 30 coups sur glace à l’aide d’un pilon lâche.
2. Transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de 2 ml et centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 mL. Économisez 100 μL dans un tube de 1,5 mL comme « entrée ».
4. Incuber le surnageant dans le tube de 2 mL avec l’anticorps anti-GFP (5 μg/mL; 1:400) à 4 °C sur un rotateur bout à bout (24 rpm) pendant une nuit.

4. Immunoprécipitation

1. Transférer le mélange homogénat/anticorps dans un nouveau tube à fond rond de 2 mL contenant les billes de protéines G lavées de l’étape 2.4. Incuber à 4 °C sur un rotateur bout à bout (24 tr/min) pendant 2 h.
2. Séparez les billes magnétiques du surnageant à l’aide d’un support magnétique. Enregistrer le surnageant comme « fraction négative ». La fraction négative contient (1) des ARN dans les cellules EGFP-négatives et (2) des ARN dans les cellules EGFP-positives qui ne sont pas liés aux ribosomes.
3. Ajouter 1 ml de tampon de lavage à haute teneur en sel aux billes et vortex brièvement le tube pour laver les perles. Placez le tube dans un support magnétique.
4. Retirez le tampon de lavage. Répétez l’étape de lavage deux fois de plus. Les billes contiennent maintenant le complexe billes-ribosome-ARN des cellules EGFP-positives.

5. Extraction de l’ARN

NOTE: Les étapes suivantes sont adaptées du kit d’isolement ARN (Table of Materials). Traiter chaque fraction (c.-à-d. entrée, positive et négative) comme un échantillon indépendant et isoler les ARN indépendamment.

1. Incuber les billes de l’étape 4.4 avec 50 μL de tampon d’extraction (du kit d’isolement d’ARN) dans un thermomélangeur (42 °C, 500 rpm) pendant 30 min pour libérer les ARN des billes.
2. Séparez les billes avec un support magnétique, transférez le surnageant qui contient le complexe perles-ribosome-ARN dans un tube de 1,5 mL.
3. Centrifuger le tube à 3000 x g pendant 2 min, puis pipeter le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ce tube contient la « fraction positive » de l’étape TRAP.
   NOTE: Pour les fractions d’entrée et négatives, extraire l’ARN de 25 μL d’échantillons en utilisant 1 mL de tampon d’extraction. Incuber dans un thermomélangeur (42 °C, 500 tr/min) pendant 30 min.
4. Préconditionner la colonne de purification de l’ARN : Pipeter 250 μL de tampon de conditionnement sur la colonne de purification. Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Centrifuger la colonne à 16 000 x g pendant 1 min.
5. Piper un volume égal de 70% d’EtOH dans le surnageant à partir de l’étape 5.3 (environ 50 μL d’EtOH à 70% pour la fraction positive et 1 mL d’EtOH à 70% pour les fractions entrantes et négatives). Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
6. Introduire à la pipette le mélange dans la colonne à partir de l’étape 5.4.
7. Centrifuger la colonne à 100 x g pendant 2 min pour permettre à l’ARN de se lier à la membrane dans la colonne, puis continuer la centrifugeuse à 16 000 x g pendant 30 s immédiatement. Jetez le flux continu.
   NOTE: Pour les fractions d’entrée et négatives, ajouter 250 μL du mélange à la colonne à chaque fois. Répétez les étapes 5.6 et 5.7 jusqu’à ce que tous les mélanges soient utilisés.
8. Introduire à la pipette 100 μL de tampon de lavage 1 (W1) dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
9. Pipeter 75 μL de solution de DNase mélanger directement dans la membrane de la colonne de purification. Incuber à TA pendant 15 min.
10. Pipeter 40 μL de W1 dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
11. Introduire à la pipette 100 μL de tampon de lavage 2 (W2) dans la colonne et centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
12. Pipeter 100 μL de W2 dans la colonne et centrifuger à 16 000 x g pendant 2 min. Jetez le flux continu. Recentrifuger la même colonne à 16 000 x g pendant 1 min pour éliminer toute trace de tampon de lavage avant l’étape d’élution.
13. Transférer la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL.
14. Pipeter 12 μL d’eau exempte de RNase directement sur la membrane de la colonne de purification. L’embout de la pipette ne doit pas toucher la membrane. Incuber à TA pendant 1 min et centrifuger à 1000 x g pendant 1 min. Poursuivre ensuite la centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min pour éluer l’ARN.

6. Concentration et qualité de l’ARN

1. Utiliser un bioanalyseur pour évaluer la qualité et la quantité de l’ARN¹⁰ extrait.

7. Stockage et analyse plus approfondie

1. Conservez l’ARN à -80 °C (jusqu’à 1 an) jusqu’à une analyse plus approfondie (p. ex. microréseau, PCR quantitative (qPCR), RNA-seq, etc.).
   REMARQUE : Pour plus de détails sur l’analyse qPCR, y compris la synthèse de l’ADNc, se reporter à Lyu et ^coll.11. Les amorces pour la qPCR sont énumérées dans le tableau des matériaux.

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Résultats

Les souris Gli1-CreER^T2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) ont d’abord été croisées avec la souris rapporteure NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) pour générer des souris double-mutantes. Des souris portant les deux allèles génétiques génétiquement modifiés (c.-à-d. Gli1-CreER^T2 et NuTRAP) ont reçu une injection de tamoxifène une fois par jour, tous les deux jours, pour trois injections. Des échantillons de tissus ont été prélevés le 7^ème

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Discussion

L’utilité de l’analyse du transcriptome des tissus entiers pourrait être atténuée, en particulier lors de l’étude de tissus hétérogènes complexes. Comment obtenir des ARN spécifiques au type cellulaire devient un besoin urgent de libérer la puissante technique de séquençage de l’ARN. L’isolement d’ARN spécifiques à un type cellulaire repose généralement sur la collecte d’un type spécifique de cellules à l’aide de la micromanipulation, du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actb	eurofins	qPCR primers	ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore	11836170001
cycloheximide	Millipore	239764-100MG
Cyp11a1	eurofins	qPCR primers	CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTP	Thermo Fisher Scientific	R0191
DTT, Dithiothreitol	Thermo Fisher Scientific	P2325
DynaMag-2 magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
Falcon tubes 15 mL	VWR	89039-666
GFP antibody	Abcam	ab290
Glass grinder set	DWK Life Sciences	357542
heparin	BEANTOWN CHEMICAL	139975-250MG
Hsd3b	eurofins	qPCR primers	GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KCl	Biosciences	R005
MgCl2	Biosciences	R004
Microcentrifuge tubes 2 mL	Thermo Fisher Scientific	02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarrays	Thermo Fisher Scientific		Microarray service
NP-40	Millipore	492018-50 Ml
oligo (dT)20	Invitrogen	18418020
PicoPure RNA Isolation Kit	Thermo Fisher Scientific	KIT0204
Protein G Dynabead	Thermo Fisher Scientific	10003D
RNase-free water	growcells	NUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019
Sox9	eurofins	qPCR primers	TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptase	Invitrogen	18090050
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155
Sycp3	eurofins	qPCR primers	GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
Tris	Alfa Aesar	J62848