Mesure de la dynamique de la saillie du bord cellulaire pendant la propagation à l’aide de la microscopie à cellules vivantes

Résumé

Ce protocole vise à mesurer les paramètres dynamiques (protubérances, rétractions, volants) des protubérances au bord des cellules étalées.

Résumé

Le développement et l’homéostasie des organismes multicellulaires reposent sur une régulation coordonnée de la migration cellulaire. La migration cellulaire est un événement essentiel dans la construction et la régénération des tissus, et est essentielle au développement embryonnaire, aux réponses immunologiques et à la cicatrisation des plaies. La dérégulation de la motilité cellulaire contribue à des troubles pathologiques, tels que l’inflammation chronique et les métastases cancéreuses. La migration cellulaire, l’invasion tissulaire, l’excroissance de l’axone et de la dendrite commencent toutes par des protubérances de bord cellulaire médiées par la polymérisation de l’actine. Nous décrivons ici une méthode simple, efficace et rapide pour l’imagerie et l’analyse quantitative de la dynamique de la saillie des bords cellulaires pendant l’épandage. Cette méthode mesure les caractéristiques discrètes de la dynamique de la membrane du bord cellulaire, telles que les protubérances, les rétractions et les volants, et peut être utilisée pour évaluer l’impact des manipulations des principaux régulateurs d’actine sur les protubérances du bord cellulaire dans divers contextes.

Introduction

La migration cellulaire est un processus critique qui contrôle le développement et la fonction de tous les organismes vivants. La migration cellulaire se produit à la fois dans des conditions physiologiques, telles que l’embryogenèse, la cicatrisation des plaies et la réponse immunitaire, et dans des conditions pathologiques, telles que les métastases cancéreuses et les maladies auto-immunes. Malgré les différences dans les types de cellules qui participent à différents événements migratoires, tous les événements de motilité cellulaire partagent des mécanismes moléculaires similaires, qui ont été conservés dans l’évolution des protozoaires aux mammifères, et impliquent des mécanismes de contrôle cytosquelettiques communs qui peuvent détecter l’environnement, répondre aux signaux et moduler le comportement cellulaire en ^réponse1.

Une première étape de la migration cellulaire peut être la formation de protubérances très dynamiques au bord d’attaque de la cellule. Derrière le lamellipodium, on peut trouver la lamelle, qui couple l’actine à la contractilité médiée par la myosine II et médie l’adhésion au substrat sous-jacent. Les lamellipodies sont induites par des stimuli extracellulaires tels que les facteurs de croissance, les cytokines et les récepteurs d’adhésion cellulaire et sont entraînées par la polymérisation de l’actine, qui fournit la force physique qui pousse la membrane plasmique vers ^l’avant2,3. De nombreuses protéines de signalisation et structurelles ont été impliquées dans cela; parmi eux se trouvent les RHO GTPases, qui agissent en coordination avec d’autres signaux pour activer les protéines régulatrices de l’actine telles que le complexe Arp 2/3, les protéines de la famille WASP et les membres des familles Formin et Spire dans les lamellipodies2,4,5.

En plus de la polymérisation de l’actine, l’activité de la myosine II est nécessaire pour générer des forces contractiles au niveau du lamellipodium et de la lamelle antérieure. Ces contractions, également définies comme des rétractions du bord cellulaire, peuvent également résulter de la dépolymérisation de l’actine dendritique à la périphérie de la cellule et sont essentielles pour développer le bord d’attaque lamellipodial et permettre à la saillie de sentir la flexibilité de la matrice extracellulaire et d’autres cellules et de déterminer la direction de la ^{migration6,7,8} . Les protubérances de bord cellulaire qui ne peuvent pas s’attacher au substrat formeront des volants de membrane périphérique, des structures en forme de feuille qui apparaissent sur la surface ventrale de la lamellipodie et de la lamelle et se déplacent vers l’arrière par rapport à la direction de la migration. Comme le lamellipodium ne parvient pas à se fixer au substrat, un lamellipodium postérieur se forme en dessous et pousse mécaniquement le premier lamellipodium vers la surface ventrale supérieure. Les filaments d’actine dans le volant qui étaient autrefois parallèles au substrat deviennent maintenant perpendiculaires à celui-ci, et le volant est maintenant positionné au-dessus du lamellipodium en progression. Le volant qui recule retombe dans le cytosol et représente un mécanisme cellulaire de recyclage de l’actine lamellipodiale9,10.

Ici, nous décrivons un test pour la mesure de la dynamique de la saillie des bords cellulaires. Le test de saillie utilise la microscopie vidéo time-lapse pour mesurer la dynamique de la protrusion d’une seule cellule pendant 10 minutes pendant la phase d’étalement de la cellule. La dynamique de la saillie est analysée en générant des kymographes à partir de ces films. En principe, un kymographe fournit des données quantitatives détaillées sur les particules en mouvement dans un diagramme spatio-temporel pour donner une compréhension qualitative de la dynamique des bords cellulaires. L’intensité de la particule en mouvement est tracée pour toutes les piles d’images dans un diagramme temporel par rapport à l’espace, où l’axe X et l’axe Y représentent respectivement le temps et la ^distance11. Cette méthode utilise une analyse kymographique manuelle avec ImageJ pour obtenir des données quantitatives détaillées, permettant de récupérer des informations à partir de films et d’images en cas de faible rapport signal/bruit et/ou de densité de caractéristiques élevée, et l’analyse d’images acquises en microscopie optique à contraste de phase ou en mauvaise qualité d’image.

Le test de dynamique de la saillie du bord cellulaire décrit ici est une méthode rapide, simple et rentable. En tant que tel, et parce qu’il a été démontré qu’il est directement corrélé avec la migration ^{cellulaire11,12}, il peut être utilisé comme méthode préliminaire pour tester la dynamique du cytosquelette impliquée dans la motilité cellulaire avant de décider d’effectuer des méthodes plus exigeantes en ressources. En outre, il permet également de mesurer quantitativement l’impact des manipulations génétiques (knockout, knockdown ou rescue) des protéines cytosquelettiques sur la dynamique du cytosquelette à l’aide d’une plate-forme simple. Le test est un modèle instructif pour explorer la dynamique du cytosquelette dans le contexte de la migration cellulaire et pourrait être utilisé pour élucider les mécanismes et les molécules sous-jacents à la motilité cellulaire.

Protocole

Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Bar-Ilan.

Remarque : Une représentation graphique étape par étape de la procédure décrite dans cette section apparaît à la figure 1.

1. Culture cellulaire

REMARQUE: Les cellules utilisées dans le protocole sont des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) qui ont été générés à partir d’embryons E11.5-13.5 de souris de type sauvage C57BL / 6. Les MEF primaires ont été générés selon le protocole de laboratoire ^Jacks13. Les cellules de cinq embryons différents ont été regroupées et immortalisées par infection par un vecteur rétroviral exprimant le grand antigène T SV40, suivie d’une sélection avec 4 mM d’histidinol pendant 3 semaines.

1. Cellules de culture dans des plaques de culture tissulaire contenant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 1 g/L de glucose, 1 % de glutamine, 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) (voir tableau des matériaux), dans un incubateur humidifié contenant 5 % de _CO2 à 37 °C.
2. Cultivez les cellules jusqu’à 90% à 95% de confluence et divisez-les dans un rapport de 1: 5 tous les 2-3 jours.

2. Revêtement de plat à fond de verre

REMARQUE: Le revêtement de la parabole à fond de verre doit être effectué dans la hotte de culture tissulaire dans des conditions stériles.

1. Ajouter 2 mL de solution de HCl 1N au centre d’un plat à fond de verre (Table des matériaux) et incuber pendant 20 min à température ambiante (RT).
   REMARQUE: Cette étape est destinée à éliminer les résidus du verre qui peuvent interrompre l’imagerie plus tard.
2. Lavez le plat à fond de verre trois fois avec 2 mL de 1x PBS (Table des matériaux) chacun.
3. Diluer la fibronectine (voir tableau des matériaux) à 10 μg/mL dans 1x PBS. Ajouter 200 μL de la solution de fibronectine diluée au centre en verre du plat. Incuber à 37 °C (incubateur de culture tissulaire) pendant 1 h.
   REMARQUE: Alternativement, le plat à fond de verre peut être incubé pendant la nuit à 4 ° C sur une surface plane.
4. Pendant le temps d’incubation du revêtement de fibronectine, préparer une solution de BSA (Table des matériaux) à 1 % dans 1x PBS, filtrer à 0,2 μm et dénaturer en incubant à 70 °C pendant 30 min dans un bain-marie préchauffé.
5. Lavez le plat à fond de verre enduit trois fois avec 2 mL de 1x PBS chacun.
6. Ajouter 2 mL de solution de BSA dénaturée au centre du verre et incuber pendant 1 h à 37 °C (incubateur de culture tissulaire).
   REMARQUE: Alternativement, le plat à fond de verre peut être incubé pendant la nuit à 4 ° C sur une surface plane.
7. Lavez le plat à fond de verre 3 fois avec 2 mL de 1x PBS chacun.
   REMARQUE: L’incubation des plats à fond de verre avec de la fibronectine doit être effectuée pendant au moins 1 h à 37 ° C pour recouvrir correctement la surface. Un temps d’incubation plus court peut ne pas produire un revêtement approprié et, par conséquent, le phénotype cellulaire peut ne pas être lié à l’activation de l’intégrine. La couche de BSA est inerte et n’affectera pas la dynamique de la saillie et est destinée à bloquer les sites potentiels libres pour l’adhésion cellulaire indépendante de l’intégrine. Le BSA doit être dénaturé avant le revêtement pour l’empêcher d’induire l’apoptose cellulaire, ce qui peut influencer la dynamique du bord cellulaire.

3. Préparation des cellules pour l’imagerie

1. Seize à dix-huit heures avant l’expérience, plaquez les cellules pour atteindre 70% à 80% de confluence le lendemain. Pour les MEF, plaque 0,7 x ¹⁰⁶ cellules par plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre un jour avant d’effectuer l’expérience.
   REMARQUE: Pour une expérience de protrusion réussie, il est important que les cellules soient utilisées pendant leur phase de croissance logarithmique. Pour ce faire, les cellules doivent atteindre une confluence de 70% à 80% le jour de l’expérience. Une densité plus élevée de cellules entraînera un temps d’étalement plus long et / ou un obstacle à la fixation pendant l’expérience.
2. Le jour de l’expérience, ajouter 2 mL de solution de trypsine (Table des matériaux) par plaque de culture tissulaire de 10 cm de diamètre et incuber pendant 2 à 3 minutes dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce que les cellules se détachent. Inactiver la trypsine en ajoutant 5 mL du milieu complet.
3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaquer 20 000 cellules dans 2 mL du milieu complet sur un plat à fond de verre recouvert comme ci-dessus (section 2).
   REMARQUE: Le nombre de cellules pour le placage dépend de la taille et du type de cellules. Pour les cellules plus grandes ou plus répandues, ne plaquez que 10 000 cellules pour avoir suffisamment de cellules pour l’imagerie. Il est important de choisir des cellules individuelles qui ne se touchent pas, car le contact de cellule à cellule peut modifier les comportements de propagation intrinsèques à la cellule.
4. Incuber les plats à fond de verre avec des cellules plaquées dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 15 min.
   REMARQUE: Au cours de cette étape, les cellules adhèrent au substrat de fibronectine et s’y propagent. Lors de la mesure des protubérances pendant la propagation cellulaire, les cellules doivent être autorisées à se propager pendant 15 minutes après le placage et avant l’imagerie. L’imagerie peut être effectuée dans une fenêtre de temps comprise entre 15 min et ~1 h après le placage, et dans tous les cas, avant que les cellules ne commencent à migrer.

4. Configuration du microscope et imagerie

REMARQUE: Divers systèmes de microscopie à cellules vivantes sont disponibles. Le système utilisé ici est un microscope inversé Leica AF6000 équipé de _CO2 et d’unités de chauffage et est fixé à un appareil photo CMOS numérique ORCA-Flash 4.0 V2.

1. Allumez l’unité de chauffage au moins 1 h avant l’imagerie et réglez-la à 37 °C.
2. Allumez l’unité de _CO2 au moins 10 minutes avant l’imagerie et réglez-la à 5% de _CO2.
3. Allumez le microscope, l’appareil photo et l’ordinateur.
4. Ouvrez le logiciel d’acquisition de microscope (voir Tableau des matériaux). Choisissez le dossier dans lequel enregistrer les images capturées et tapez un nom de fichier. Enregistrez chaque film en tant que nouveau fichier.
5. Réglez le grossissement sur une lentille sèche 40x, contraste de phase. Réglez l’intervalle de temps sur 5 s, la durée totale du film 10 min.
6. Après 15 minutes d’incubation des cellules plaquées, placez le plat à fond de verre avec les cellules adhérentes dans l’adaptateur et fixez-le. Insérez l’adaptateur avec la parabole dans sa fente dans l’étage du microscope.
7. Retirez le couvercle du plat et placez plutôt le couvercle en _CO2 . Ouvrez la vanne de _CO2 .
   REMARQUE: Assurez-vous que le couvercle de _CO2 est propre avant de le placer sur le dessus du plat en verre. Une couverture sale réduira la qualité des films. Essuyez le dessous du couvercle au _CO2 avec une lingette non pelucheuse imbibée d’éthanol à 70% pour éliminer la poussière et la saleté. Essuyez une deuxième fois avec une lingette sèche non pelucheuse.
8. Visualisez les cellules et trouvez une cellule appropriée pour l’imagerie. Assurez-vous que la cellule est au point et commencez l’acquisition du film.

5. Analyse d’images

REMARQUE: L’analyse d’image est effectuée à l’aide d’ImageJ (Table des matériaux) comme suit:

1. Ouvrez le film acquis dans ImageJ.
2. À l’aide de l’outil Droit de la barre d’outils principale, créez huit lignes de 20 unités arbitraires perpendiculaires chacune aux saillies, y compris la lame et le bord de la cellule, dans un arrangement radial tous les 45°, comme illustré à la figure 2A.
3. Dans la barre d’outils principale, accédez à Piles > d’images > Reslice. Cela donnera une image kymographique, qui décrit le mouvement de points uniques à l’intérieur de la membrane cellulaire (Figure 2B). Cette action doit être effectuée séparément pour chaque ligne sur les huit lignes.
4. Extrayez et comptez manuellement à partir des images kymographiques respectives le nombre de protubérances, de rétractions et de volants dans chacune des huit régions de la cellule, marquées par les lignes de la grille. Ces chiffres représentent la fréquence des protubérances, des rétractions et des volants par 10 minutes (Figure 2C, D).
   REMARQUE: Les volants peuvent être distingués des autres structures en fonction de leur apparence sombre en microscopie à contraste de phase et de leur mouvement centripète, qui commence au bord de la cellule et se termine à la frontière du corps cellulaire, ce qui peut être observé dans les films acquis. Il convient de noter que lors de la quantification de la protrusion, de la rétraction et de la fréquence des volants, les films doivent être observés comme un contrôle pour la quantification et en particulier pour définir les volants.
5. Déterminez la persistance, la distance et la vitesse de la saillie par analyse par kymographie. Pour chacun des kymographes générés, l’axe X représente la distance et l’axe Y représente le temps.
6. Pour mesurer la distance de saillie, suivez les étapes 5.6.1 à 5.6.2.
   1. Tracez une ligne perpendiculaire de la base de la saillie au plus haut sommet de la saillie. Appuyez sur M dans ImageJ pour mesurer la longueur de la ligne en pixels.
   2. Pour convertir la longueur des pixels en μm, assurez-vous que le rapport pixel/μm est connu.
      REMARQUE: Le rapport μm / pixel est la longueur physique d’un pixel sur la caméra CCD / grossissement total. La taille des pixels est caractéristique de chaque type d’appareil photo. Par exemple, pour la caméra utilisée dans cette étude, la taille des pixels est de 6,5 μm x 6,5 μm, la longueur physique est de 6,5 μm et le grossissement que nous avons utilisé est de 40x. Par conséquent, le rapport μm / pixel de notre appareil photo est de 0,1625 μm / pixel. Dans l’analyse, pour une ligne d’une longueur de 30 pixels, la distance de saillie serait de 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm (Figure 3).
7. Pour mesurer le temps de saillie (persistance; le temps qu’une saillie passe à dépasser avant de se rétracter), suivez les étapes 5.7.1 à 5.7.2.
   1. Tracez une ligne horizontale du début de la saillie (de gauche à droite) jusqu’à la région du plus haut sommet. Appuyez sur M dans ImageJ pour mesurer la longueur de la ligne en pixels.
   2. Pour convertir la longueur des pixels en minutes, calculez le rapport pixel/min. Cette valeur dépend de l’intervalle entre les images.
      Remarque : Dans cet exemple, l’intervalle entre les images est de 5 s, le rapport min/pixel est de 0,0833 et la longueur de ligne horizontale est de 8 pixels. Par conséquent, le temps de saillie est de 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.
8. Mesurez et calculez le temps de rétraction de la même manière que le temps de saillie pour une ligne tracée horizontalement à la base de la saillie à partir de laquelle se trouve le pic de la saillie jusqu’à sa base à droite (ligne X2 de la figure 3).
9. Calculez la vitesse de saillie en divisant la distance de saillie par le temps de saillie. Calculez la vitesse de rétraction en divisant la distance de saillie par le temps de rétraction. Dans cet exemple, la vitesse de saillie est calculée comme 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., et la vitesse de rétraction est identique car la ligne représentant le temps est de même longueur.
   REMARQUE: En comparant différents types de cellules, c’est-à-dire des cellules exprimant des constructions de type sauvage et mutantes de la même protéine, il est impératif d’effectuer une analyse en aveugle, afin qu’aucun biais ne soit introduit.

Résultats

Dans l’expérience décrite à la figure 2, des MEF immortalisés ont été plaqués sur des boîtes à fond de verre pré-enduites de fibronectine pour activer la signalisation médiée par l’intégrine, bloquée par la BSA dénaturée, afin de bloquer les sites potentiels libres pour l’adhésion cellulaire qui ne dépend pas de l’activation de l’intégrine. Pour atteindre la phase de croissance logarithmique à une confluence de cellules de 70% à 80% le jour de l’expérience, ...

Discussion

La dynamique de la saillie du bord cellulaire, composée de protubérances, de rétractions et de volants, est à la fois une condition préalable et un événement limitant le débit potentiel dans la motilité cellulaire. Nous décrivons ici une méthode rapide et simple pour mesurer la dynamique des protubérances du bord cellulaire pendant l’étalement. Cette méthode permet une imagerie à court terme, génère une quantité importante de données, ne nécessite pas de marquage fluorescent des cellules ou d’équ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A