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  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La recherche ouverte permet d’identifier des glycopeptides décorés avec des compositions de glycanes jusque-là inconnues. Dans cet article, une approche simplifiée pour entreprendre une recherche ouverte et des recherches ultérieures de glycopeptides axées sur le glycane est présentée pour des échantillons bactériens en utilisant Acinetobacter baumannii comme modèle.

Résumé

La glycosylation des protéines est de plus en plus reconnue comme une modification courante au sein des organismes bactériens, contribuant à la physiologie procaryote et à l’infectiosité optimale des espèces pathogènes. Pour cette raison, il existe un intérêt croissant pour la caractérisation de la glycosylation bactérienne et un besoin d’outils analytiques à haut débit pour identifier ces événements. Bien que la protéomique ascendante permette facilement la génération de riches données sur les glycopeptides, l’étendue et la diversité des glycanes observés chez les espèces procaryotes rendent l’identification des événements de glycosylation bactérienne extrêmement difficile.

Traditionnellement, la détermination manuelle des compositions de glycanes dans les ensembles de données protéomiques bactériennes en faisait une analyse largement sur mesure réservée aux experts spécifiques au domaine. Récemment, les approches ouvertes basées sur la recherche sont apparues comme une alternative puissante pour l’identification de modifications inconnues. En analysant la fréquence des modifications uniques observées sur les séquences peptidiques, les techniques de recherche ouverte permettent d’identifier les glycanes communs attachés aux peptides dans des échantillons complexes. Cet article présente un flux de travail rationalisé pour l’interprétation et l’analyse des données glycoprotéomiques, démontrant comment des techniques de recherche ouvertes peuvent être utilisées pour identifier les glycopeptides bactériens sans connaissance préalable des compositions de glycanes.

En utilisant cette approche, les glycopeptides dans les échantillons peuvent rapidement être identifiés pour comprendre les différences de glycosylation. En utilisant Acinetobacter baumannii comme modèle, ces approches permettent de comparer les compositions de glycanes entre les souches et d’identifier de nouvelles glycoprotéines. Pris ensemble, ces travaux démontrent la polyvalence des techniques de recherche dans des bases de données ouvertes pour l’identification de la glycosylation bactérienne, ce qui rend la caractérisation de ces glycoprotéomes très divers plus facile que jamais.

Introduction

La glycosylation des protéines, le processus de fixation des glucides aux molécules de protéines, est l’une des modifications post-traductionnelles (PTM) les plus courantes dans la nature 1,2. Dans tous les domaines de la vie, une gamme de machines complexes a évolué dédiée à la génération de glycoprotéines qui ont un impact sur une myriade de fonctions cellulaires 1,3,4,5. Alors que la glycosylation des protéines se produit sur une gamme d’acides aminés 6,7, les événements de glycosylation liés à l’azote et à l’O sont deux formes dominantes observées dans la nature. La glycosylation liée à l’azote implique la fixation des glycanes à un atome d’azote de résidus d’asparagine (Asn), tandis que dans la glycosylation liée à l’O, les glycanes sont attachés à un atome d’oxygène de résidus de sérine (Ser), de thréonine (Thr) ou de tyrosine (Tyr)7. Malgré les similitudes dans les résidus ciblés par les systèmes de glycosylation, les différences au sein des glycanes attachés aux protéines font de la glycosylation la classe de PTM la plus chimiquement diversifiée trouvée dans la nature.

Alors que les systèmes de glycosylation eucaryotes possèdent une diversité de glycanes, ces systèmes sont généralement limités dans le nombre de glucides uniques utilisés. La diversité résultante provient de la façon dont ces glucides sont disposés en glycanes 8,9,10,11,12. En revanche, les espèces bactériennes et archéales possèdent une diversité de glycanes pratiquement illimitée en raison de la vaste gamme de sucres uniques générés dans ces systèmes 2,10,13,14,15,16,17. Ces différences dans la diversité des glycanes observées dans les domaines de la vie représentent un défi analytique important pour la caractérisation et l’identification des événements de glycosylation. Pour la glycosylation eucaryote, la capacité d’anticiper les compositions de glycanes a facilité l’intérêt croissant pour la glycobiologie; pourtant, il n’en va pas de même pour la glycosylation bactérienne, qui est encore largement limitée à l’étude par des laboratoires spécialisés. Comme l’accessibilité de l’instrumentation de spectrométrie de masse (SEP) a augmenté dans les biosciences, les approches basées sur la SEP sont maintenant la principale méthode d’analyse glycoprotéomique.

La SEP est devenue l’outil par excellence pour la caractérisation de la glycosylation, avec des approches descendantes et ascendantes maintenant couramment utilisées pour caractériser les glycoprotéines6. Alors que la protéomique descendante est utilisée pour évaluer les modèles globaux de glycosylation de protéines spécifiques18,19, des approches ascendantes sont utilisées pour permettre la caractérisation spécifique des glycanes des glycopeptides, même à partir de mélanges complexes 6,20,21,22,23. Pour l’analyse des glycopeptides, la génération d’informations de fragmentation informatives est essentielle pour la caractérisation des événements de glycosylation24,25. Une gamme d’approches de fragmentation est maintenant couramment accessible sur les instruments, y compris la dissociation induite par collision basée sur un piège à ions de résonance (IT-CID), la dissociation induite par collision de type faisceau (CID) et la dissociation par transfert d’électrons (ETD). Chaque approche possède des forces et des faiblesses différentes pour l’analyse des glycopeptides25,26, avec des progrès significatifs au cours de la dernière décennie dans l’application de ces approches de fragmentation pour analyser la glycosylation 6,20. Cependant, pour l’analyse de la glycosylation bactérienne, la limitation critique n’a pas été la capacité de fragmenter les glycopeptides, mais plutôt l’incapacité de prédire les compositions potentielles de glycanes dans les échantillons. Au sein de ces systèmes, la nature inconnue de divers glycanes bactériens limite l’identification des glycopeptides, même avec des outils de recherche axés sur la glycosylation maintenant courants pour l’analyse des glycopeptides eucaryotes, tels que O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 et GlycReSoft29. Pour surmonter ce problème, une méthode de recherche alternative est nécessaire, l’utilisation d’outils de recherche ouverts émergeant comme une approche puissante pour l’étude de la glycosylation bactérienne30.

La recherche ouverte, également connue sous le nom de recherche à l’aveugle ou à caractère générique, permet d’identifier des peptides avec des PTM inconnus ou inattendus 21,30,31,32. Les recherches ouvertes utilisent une variété de techniques de calcul, y compris les recherches de modification organisées, les recherches dans les bases de données en plusieurs étapes ou la recherche tolérante à grande masse 33,34,35,36,37. Bien que la recherche ouverte ait un grand potentiel, son utilisation a généralement été entravée par l’augmentation significative des temps d’analyse et la perte de sensibilité de la détection de peptides non modifiés par rapport aux recherches restreintes31,32. La diminution de la détection des correspondances peptide-spectrales (MSP) non modifiées est le résultat de l’augmentation des taux de PSM faussement positifs associés à ces techniques, ce qui nécessite un filtrage rigoureux accru pour maintenir les taux de fausse découverte (FDR) souhaités 33,34,35,36,37 . Récemment, plusieurs outils sont devenus disponibles qui améliorent considérablement l’accessibilité de la recherche ouverte, notamment Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 et MSFragger21,41. Ces outils permettent l’identification robuste des événements de glycosylation en réduisant considérablement les temps d’analyse et en mettant en œuvre des approches pour gérer les compositions de glycanes hétérogènes.

Cet article présente une méthode simplifiée pour l’identification des glycopeptides bactériens par recherche ouverte, en utilisant l’agent pathogène nosocomial à Gram négatif, Acinetobacter baumannii, comme modèle. A. baumannii possède un système de glycosylation lié à l’O conservé responsable de la modification de multiples substrats protéiques, connu sous le nom de système de glycosylation de la protéine PglL 42,43,44. Alors que des protéines similaires sont ciblées pour la glycosylation entre les souches, le système de glycosylation PglL est très variable en raison de la biosynthèse du glycane utilisé pour la glycosylation des protéines dérivé du locus de la capsule (connu sous le nom de K-locus)44,45,46. Il en résulte que divers glycanes (également connus sous le nom d’unité K), dérivés d’unités K polymérisées simples ou limitées, sont ajoutés aux substrats protéiques 30,44,46. Dans ce travail, l’utilisation de l’outil de recherche ouvert, MSfragger, dans le logiciel FragPipe, est utilisée pour identifier les glycanes à travers les souches d’A. baumannii. En combinant la recherche ouverte et la curation manuelle, des « recherches axées sur le glycane » peuvent être entreprises pour améliorer davantage l’identification des glycopeptides bactériens. Ensemble, cette approche d’identification en plusieurs étapes permet l’identification de glycopeptides sans expérience approfondie dans la caractérisation de nouveaux événements de glycosylation.

Protocole

REMARQUE: La préparation et l’analyse des échantillons de glycopeptides bactériens peuvent être divisées en quatre sections (Figure 1). Pour cette étude, la glycosylation de trois souches séquencées d’A. baumannii a été évaluée (tableau 1). Les bases de données Proteome FASTA de chacune de ces souches sont accessibles via Uniprot. Reportez-vous au tableau 2 pour connaître la composition des tampons utilisés dans ce protocole.

1. Préparation d’échantillons de protéines pour l’analyse protéomique

  1. Isolement d’échantillons de protéome d’intérêt
    1. Si vous utilisez des cellules entières, assurez-vous que les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les contaminants protéiques potentiels présents dans le milieu. Congelez les cellules entières après le lavage et conservez-les à -80 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
    2. Si des échantillons fractionnés sont utilisés (comme des préparations membranaires), assurez-vous que les réactifs utilisés n’interféreront pas avec l’analyse MS (LC-MS) par chromatographie liquide en aval50.
    3. Si des détergents, tels que le dodécyl-sulfate de sodium (SDS), le Triton X-100, le NP-40 ou la lauroylsarcosine, ont été utilisés, retirez ces détergents en utilisant la précipitation de l’acétone, les méthodes de préparation d’échantillons SP351 ou les colonnes de nettoyage protéomique commerciales telles que les pièges S52. Alternativement, remplacez les détergents incompatibles par un détergent compatible MS ou amovible tel que le désoxycholate de sodium (SDC) ou l’octyl glucopyranoside.
    4. Assurez-vous que tous les articles en plastique et en verre à utiliser pour la préparation des échantillons n’ont pas été autoclavés. La verrerie et les plastiques autoclavés sont généralement fortement contaminés par des composés de petit poids moléculaire, tels que les polymères, qui sont facilement détectés dans la SEP.
  2. Solubilisation d’échantillons de cellules entières
    1. Remettre en suspension ~10 mg de cellules lavées et surgelées dans 200 μL de tampon de lyse désoxycholate de sodium fraîchement préparé (tampon de lyse SDC: 4% SDC dans 100 mM Tris, pH 8,5).
      REMARQUE: Des inhibiteurs de la protéase peuvent être ajoutés au tampon de lyse SDC pour limiter la dégradation des protéines.
    2. Faire bouillir les échantillons pendant 10 min à 95 °C en agitant (2000 tr/min sur un thermomixeur), puis laisser sur la glace pendant 10 min. Répétez ce processus deux fois pour assurer une lyse et une solubilisation efficaces des échantillons.
      REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à long terme à ce stade à -80 ° C. S’il est stocké, rallumer en chauffant à 95 °C avant la suite du traitement.
  3. Quantifier les concentrations de protéines dans l’échantillon à l’aide d’un test de protéines à l’acide bicinchoninique (ACB)53. Entreposer les échantillons sur de la glace tout en entreprenant une quantification pour limiter la dégradation des protéines.
    REMARQUE: Pour l’analyse du protéome total, 20-100 μg de protéines est plus que suffisant pour le nano LC-MS, qui nécessite généralement moins de 2 μg de digestion des protéines par analyse. La préparation de l’excès de peptide permet une analyse répliquée ou un fractionnement supplémentaire si une couverture protéomique profonde est nécessaire. Pour l’analyse basée sur l’enrichissement en glycopeptides par chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC), 100 à 500 μg de protéines sont nécessaires.
  4. Réduire et alkyler les échantillons.
    1. Ajouter 1/10ème du volume du tampon de réduction/alkylation 10x (100 mM de chlorhydrate de Tris 2-carboxyéthylphosphine ; 400 mM de 2-chloroacétamide dans 1 M Tris, pH 8,5) aux échantillons pour une concentration finale de 1x et incuber les échantillons dans l’obscurité pendant 30 min à 45 °C en agitant à 1 500 tr/min.
      REMARQUE: Vérifiez le pH du tampon de réduction/alkylation 10x pour vous assurer d’un pH d’environ 7,0-8,0 avant d’ajouter aux échantillons, car un pH plus bas entraînera la précipitation du SDC.
  5. Faites tourner brièvement les échantillons et ajoutez les protéases Trypsine/Lys-C (~10 μL, remise en suspension dans 100 mM Tris, pH 8,5) pour un rapport protéase/protéine final de 1:100. Incuber les digestes pendant la nuit à 37 °C en agitant à 1 500 tr/min (jusqu’à 18 h). Pour assurer une digestion complète des protéines, utilisez un rapport trypsine/Lys-C protéase:protéine de 1:50 à 1:200.
  6. Quench digère en ajoutant 1,25 volume d’isopropanol à 100% aux échantillons. Vortex les échantillons pendant 1 min pour les mélanger et les faire tourner brièvement.
    REMARQUE: Les échantillons peuvent être stockés à -20 ° C pour être traités ultérieurement.
  7. Acidifier les échantillons en ajoutant 0,115 volume d’acide trifluoroacétique à 10 % (TFA; concentration finale d’environ 1 % de TFA), vortexer les échantillons et les faire tourner brièvement vers le bas.

2. Traitement des échantillons de protéome

  1. Nettoyage peptidique d’échantillons de protéome
    1. Préparer une pointe d’arrêt et d’extraction (étape) de sulfonate de styrédènevinylbenzène-phase inverse (SDB-RPS) pour chaque échantillon, comme décrit précédemment54.
      1. Empiriquement, pour lier 50 μg de peptide, extraire trois disques SDB-RPS d’une membrane SDB-RPS de 47 mm2 à l’aide d’une aiguille émoussée (14 G). Pour de plus grandes quantités de peptides, augmentez le nombre de disques en conséquence.
    2. Avant d’utiliser SDB-RPS Stage Tips, préparez les embouts en ajoutant séquentiellement au moins dix volumes de lit des tampons suivants et en faisant tourner le tampon à travers la colonne par centrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) ou en poussant le tampon à travers la colonne en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue.
      1. Mouiller les embouts avec 150 μL d’acétonitrile à 100%.
      2. Laver les embouts avec 150 μL de 30% de méthanol, 1% de TFA dans 18,2 MΩ H2O.
      3. Équilibrez les embouts avec 150 μL d’isopropanol à 90 %, 1 % de TFA équilibré avec 18,2 MΩ H2O.
    3. Charger les échantillons (contenant 50 % d’isopropanol, 1 % de TFA) sur les embouts de scène SDB-RPS par centrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) ou en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue.
    4. Lavez les embouts de scène SDB-RPS avec les tampons suivants par centrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) ou en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue.
      REMARQUE: Des lavages supplémentaires ou des tampons alternatifs peuvent être utilisés pour éliminer les contaminants non peptidiques, tels que l’utilisation d’acétate d’éthyle au lieu de l’isopropanol55.
      1. Lavez les embouts avec 150 μL de 90% d’isopropanol, 1% de TFA.
      2. Laver les embouts avec 150 μL de 1% TFA dans 18,2 MΩ H2O.
    5. Éluez les peptides des pointes d’étape SDB-RPS avec 150 μL d’hydroxyde d’ammonium à 5% dans 80% d’acétonitrile par centrifugation ou en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue. Prélever les échantillons dans des tubes individuels.
      REMARQUE: Préparer de l’hydroxyde d’ammonium à 5% dans 80% d’acétonitrile dans un récipient en plastique immédiatement avant de l’utiliser dans une hotte.
    6. Sécher les peptides élués par centrifugation sous vide à 25 °C.
      REMARQUE: Si vous entreprenez un enrichissement HILIC, 1 à 10% des éluats peptidiques peuvent être éliminés à ce stade, séchés et utilisés comme contrôles d’entrée de protéome total.
  2. Enrichissement d’échantillons de glycopeptides
    1. Préparer les embouts de l’étape de la chromatographie liquide d’interaction hydrophile zwitterionique (ZIC-HILIC) comme décrit précédemment54,56.
      1. En bref, retirez un disque C8 d’une membrane de 47 mm2 C8 à l’aide d’une aiguille émoussée (14 G) et emballez le disque dans une pointe P200 pour créer une fritte. Ajouter environ 5 mm de matériau ZIC-HILIC, remis en suspension dans 50% d’acétonitrile, 50% 18,2 MΩ H2O, sur la fritte en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue.
    2. Avant d’utiliser ZIC-HILIC Stage Tips, conditionnez la résine en ajoutant séquentiellement les tampons suivants et en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue.
      REMARQUE: Pour assurer l’intégrité de la couche de pseudo-eau à la surface de la résine ZIC-HILIC (nécessaire pour enrichir les glycopeptides), la résine doit toujours rester humide. Lors du lavage de la résine, laissez toujours environ 10 μL de solvant au-dessus de la résine et assurez-vous que les lavages / échantillons sont pipetés directement dans ce solvant résiduel.
      1. Équilibrer la résine avec 20 volumes de lit (200 μL) de tampon d’élution ZIC-HILIC (0,1% TFA dans 18,2 MΩ H2O).
      2. Laver la résine avec 20 volumes de lit (200 μL) de tampon de préparation ZIC-HILIC (95% d’acétonitrile dans 18,2 MΩ H2O).
      3. Lavez la résine avec 20 volumes de lit (200 μL) de tampon de chargement/lavage ZIC-HILIC (80% d’acétonitrile, 1% de TFA équilibré avec 18,2 MΩ H2O).
    3. Remettre en suspension les échantillons digérés séchés (à partir de l’étape 2.1.6) dans le tampon de chargement/lavage ZIC-HILIC jusqu’à une concentration finale de 4 μg/μL (par exemple, pour 200 μg de peptide, remettre en suspension dans 50 μL de tampon de chargement/lavage ZIC-HILIC). Vortex brièvement pendant 1 min pour s’assurer que les échantillons sont remis en suspension, et rotation pendant 1 min à 2 000 × g à 25 °C.
    4. Chargez l’échantillon de peptide remis en suspension sur une colonne ZIC-HILIC conditionnée.
      1. Lavez trois fois avec 20 volumes de lit (200 μL) de tampon de chargement/lavage ZIC-HILIC (pour un total de lavage de 60 volumes de lit) en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue.
      2. Glycopeptides élués avec 20 volumes de lit (200 μL) de tampon d’élution ZIC-HILIC dans un tube de 1,5 mL en appliquant doucement une pression à l’aide d’une seringue, puis sécher l’éluat par centrifugation sous vide à 25 °C.

3. LC-MS d’échantillons enrichis en protéome/glycopeptide

  1. Remettre en suspension les échantillons dans le tampon A* (2 % d’acétonitrile, 0,1 % de TFA) jusqu’à une concentration finale de 1 μg/μL (par exemple, pour 50 μg de peptide, remettre en suspension dans 50 μL de tampon A*).
  2. Chargez les échantillons sur une CLHP/UPLC couplée à un MS pour permettre la séparation et l’identification des glycopeptides.
    REMARQUE: Les paramètres de la colonne, y compris le diamètre intérieur, la longueur, les débits, le type de résine de chromatographie et les quantités d’injection peptidique requises, doivent être optimisés pour la configuration analytique et la longueur du gradient à utiliser; pour un exemple d’optimisation des configurations analytiques, voir57.
  3. Surveillez la collecte des données MS résultantes en vous assurant que les données sont collectées avec les paramètres souhaités.
    REMARQUE: Pour l’analyse de la composition, la fragmentation CID est suffisante. En raison de l’ajout de glycanes aux glycopeptides, les ions glycopeptides sont généralement observés avec un m/z plus élevé et une densité de charge inférieure à celle des peptides non glycosylés. Pour vous assurer que ces ions sont observables, autorisez une plage de masse MS1 comprise entre 400 et 2 000 m/z.
  4. Fragmenter des ions sélectionnés à l’aide de CID, assurant la collecte d’ions fragmentaires à faible m/z qui contiennent des ions oxonium importants pour la caractérisation des glycanes.
    REMARQUE: La fragmentation des glycopeptides à l’aide de CID est influencée à la fois par les séquences de peptides et de glycanes, ainsi que par l’énergie appliquée lors de la fragmentation 25,58,59. Bien qu’une gamme d’énergies de collision différentes puisse être utilisée, une stratégie optimale pour fragmenter les glycopeptides est l’utilisation d’énergies de collision échelonnées combinant l’utilisation d’énergies de collision multiples 25,59,60.
  5. Utilisez d’autres méthodes de fragmentation, si disponibles, telles que l’ETD pour la localisation du site ou l’IT-CID pour aider à la détermination des compositions de glycanes.
    REMARQUE: Aucune de ces approches de fragmentation n’est essentielle pour l’analyse de la composition, mais peut être collectée pour permettre une interrogation plus approfondie des glycopeptides d’intérêt.

4. Analyse d’échantillons enrichis en protéome/glycopeptide

  1. Préfiltrage des fichiers de données pour permettre la recherche dans FragPipe
    1. Si des analyses ETD ou IT-CID ont été acquises dans des jeux de données, filtrez ces événements d’analyse à partir des fichiers de données à l’aide de MSConvert61 avant de rechercher avec FragPipe.
      REMARQUE: Pour les paramètres de recherche ouverts décrits ci-dessous, seules les données CID de type faisceau sont requises.
  2. Effectuer des recherches ouvertes dans FragPipe
    1. Ouvrez FragPipe et cliquez sur l’onglet Workflow . Dans le menu déroulant du flux de travail, sélectionnez l’option Ouvrir la recherche, puis cliquez sur Ajouter des fichiers pour importer les fichiers de données à rechercher dans FragPipe (Figure 2A).
    2. Cliquez sur l’onglet Base de données et lancez le gestionnaire de téléchargement en cliquant sur Télécharger. Cela permet de télécharger des bases de données de protéome à partir d’Uniprot à l’aide d’un ID de protéome Uniprot. Cliquez sur l’option Ajouter des leurres et des contaminants dans le gestionnaire de téléchargement pour incorporer des protéines leurres et contaminantes dans les bases de données.
    3. Pour des seuils FDR plus stricts, cliquez sur l’onglet Validation et modifiez la valeur filtre et rapport de 0,01 à FDR requis.
      REMARQUE: Les paramètres FragPipe par défaut garantiront un FDR de 1% au niveau de la protéine.
    4. Cliquez sur l’onglet MSfragger . Dans la zone Correspondance des pics , augmentez la tolérance de masse du précurseur de 500 Da par défaut à 2 000 Da pour permettre l’identification des modifications importantes (Figure 2A).
    5. Cliquez sur l’onglet Exécuter et définissez l’emplacement des sorties de FragPipe. Cliquez sur le bouton Exécuter pour lancer la recherche.
  3. À l’aide des MSP identifiés dans les ensembles de données (contenus dans les sorties psm.tsv de FragPipe), identifiez les glycanes potentiels en traçant la fréquence des masses delta observées dans les ensembles de données (Figure 3). Créez des diagrammes de masse delta à partir des sorties MSfragger à l’aide des scripts R accessibles via l’accession PRIDE PXD027820.
    REMARQUE: Un post-traitement minimal des résultats de recherche ouverts est entrepris dans ces scripts, car l’objectif principal de ces scripts est d’aider à la visualisation des profils de masse delta. Il est important de noter que l’observation de masses delta abondantes à elle seule n’est pas une preuve qu’une modification est un glycane potentiel, car l’attribution de masses delta en tant que glycanes nécessite une analyse plus approfondie des événements MS2 correspondants.
  4. Pour permettre la caractérisation des glycopeptides dans les échantillons, concentrez-vous sur les identifications de masse delta à haute confiance, correspondant à des affectations avec des hyperscores élevés.
    1. Pour faciliter l’évaluation des spectres de glycopeptides, utilisez des outils d’annotation peptidique, tels que l’annotateur spectral de peptide interactif63, qui permet l’affectation d’ions associés aux peptides dans les spectres, permettant l’identification manuelle des ions associés au glycane (Figure 4).
      REMARQUE: Dans les ensembles de données présentés ici, les hyperscores de >30 sont considérés comme des scores élevés, car ils correspondent à des scores dans le top 50% de tous les glycopeptides identifiés (Figure 5).
  5. Avec des glycopeptides à haute confiance attribués, identifiez les ions associés aux glycanes couramment observés (Figure 4) pour améliorer l’identification des glycopeptides.
    REMARQUE: En incorporant des ions associés au glycane dans les recherches, connues sous le nom de recherches axées sur les glycanes, la qualité des affectations de glycopeptides peut être améliorée.
    1. Cliquez sur l’onglet MSfragger de FragPipe, incorporez les masses delta déterminées des glycanes observés dans les sections Modifications variables et Décalages de masse . Ajoutez ces masses en tapant des valeurs dans les sections Modifications de variables et Décalages de masse avec des masses individuelles séparées par un /. Ajoutez les masses de fragments associés aux glycanes de ces glycanes dans la section Glyco/Labile mods de MSFragger.
      REMARQUE : La figure 2B présente les informations clés requises pour une recherche axée sur le glycane de la souche AB307-0294 d’A. baumannii .
  6. Téléchargez toutes les données sur la SEP associées aux études protéomiques vers des référentiels protéomiques centralisés tels que les référentiels PRIDE ou MASSIVE.
    REMARQUE: Toutes les données associées à cette étude ont été déposées dans le dépôt protéomique PRIDE et peuvent être consultées via l’accession PRIDE: PXD027820.

Résultats

Pour illustrer l’utilité de la recherche ouverte pour l’analyse des glycopeptides bactériens, la diversité chimique des glycanes liés à l’O dans trois souches d’A. baumannii-AB307-0294, ACICU et D1279779- a été évaluée. Les glycoprotéomes liés à l’O sont très variables entre les souches d’A. baumannii car les glycanes utilisés pour la glycosylation sont dérivés des loci 44,45,46 de la capsule très variable.

Discussion

La recherche ouverte est une méthode efficace et systématique pour identifier les modifications inconnues. Alors que l’identification de glycanes inconnus dans des échantillons de protéome bactérien a toujours été une entreprise longue et techniquement spécialisée, les récents développements d’outils tels que MSfragger21,41 et Byonic31,38 permettent maintenant l’identification rapide et e...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

N.E.S est soutenu par une bourse d’avenir du Conseil australien de la recherche (FT200100270) et une subvention de projet de découverte ARC (DP210100362). Nous remercions le Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility du Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute pour son accès à l’instrumentation MS.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
14 G Kel-F Hub point style 3Hamilton companyhanc90514
2-ChloroacetamideSigma Aldrich Pty LtdC0267-100G
AcetonitrileSigma Aldrich Pty Ltd34851-4L
Ammonium hydroxide (28%)Sigma Aldrich Pty Ltd338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent APierce23228
BCA Protein Assay Reagent BPierce23224
C8 Empore SPESigma Aldrich Pty Ltd66882-UAn alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acidSigma Aldrich Pty Ltd5.33002
IsopropanolSigma Aldrich Pty Ltd650447-2.5L
MethanolFisher ChemicalM/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)Sigma Aldrich Pty Ltd66886-UAn alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium DeoxycholateSigma Aldrich Pty LtdD6750-100G
ThermoMixer CEppendorf2232000083
trifluoroacetic acidSigma Aldrich Pty Ltd302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochlorideSigma Aldrich Pty LtdC4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma Aldrich Pty Ltd252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixturePromegaV5073
Vacuum concentratorLabconco7810040
ZIC-HILIC materialMerck1504580001Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

Références

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