Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Method Article
Nous présentons ici un protocole d’électroporation in vitro reproductible pour la manipulation génétique des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires (GCP) qui est rentable, efficace et viable. De plus, ce protocole démontre également une méthode simple pour l’étude moléculaire des voies de signalisation primaires du hérisson dépendantes du cilium dans les cellules GCP primaires.
Le cil primaire est un organite de signalisation critique trouvé sur presque toutes les cellules qui transduit les stimuli de signalisation Hedgehog (Hh) de la surface cellulaire. Dans le précurseur des cellules granulaires (GCP), le cilium primaire agit comme un centre de signalisation pivot qui orchestre la prolifération des cellules précurseurs en modulant la voie de signalisation Hh. L’étude de la machinerie de signalisation Hh primaire dépendante du cilium est facilitée par la manipulation génétique in vitro des composants de la voie pour visualiser leur localisation dynamique vers le cilium primaire. Cependant, la transfection des transgènes dans les cultures primaires de GPC à l’aide des méthodes d’électroporation actuellement connues est généralement coûteuse et entraîne souvent une faible viabilité cellulaire et une efficacité de transfection indésirable. Cet article présente un protocole d’électroporation efficace, rentable et simple qui démontre une efficacité de transfection élevée d’environ 80 à 90% et une viabilité optimale des cellules. Il s’agit d’une méthode de modification génétique simple, reproductible et efficace qui est applicable à l’étude de la voie de signalisation primaire du hérisson dépendant du cilium dans les cultures primaires de BPC.
Les GCP cérébelleux sont largement utilisés pour étudier la machinerie de la voie de signalisation Hh dans les types de cellules progénitrices neuronales en raison de leur grande abondance et de leur grande sensibilité à la voie de signalisation Hh in vivo1,2,3,4. Dans les GCP, le cilium primaire agit comme un pivot de transduction du signal Hh5 qui orchestre la prolifération des cellules précurseurs6,7,8. La visualisation in vitro des composants de signalisation Hh sur le cil primaire est souvent difficile en raison de leurs faibles niveaux basaux endogènes. Par conséquent, la modification transgénique des niveaux d’expression des protéines et le marquage fluorophore du gène d’intérêt sont des approches utiles pour étudier la voie à résolution moléculaire. Cependant, la manipulation génétique des cultures primaires GCP à l’aide d’approches de transfection à base de liposomes entraîne souvent une faible efficacité de transfection, ce qui entrave la poursuite des investigations moléculaires9. L’électroporation augmente l’efficacité, mais nécessite généralement des réactifs d’électroporation exorbitants spécifiques au fournisseur et au type de cellule10.
Cet article présente une méthode d’électroporation à haute efficacité et rentable pour manipuler les composants de la voie de signalisation Hh dans les cultures primaires GCP. En utilisant ce protocole d’électroporation modifié, un transgène lissé marqué par une protéine fluorescente verte (GFP) (pEGFP-Smo) a été efficacement administré aux GPC et a atteint des taux élevés de survie cellulaire et de transfection (80-90%). En outre, comme en témoigne la coloration immunocytochimique, les GCP transfectés ont montré une grande sensibilité à l’activation de la voie de signalisation Hh induite par les agonistes lissés par le trafic de l’EGFP-Smo vers les cils primaires. Ce protocole est directement applicable et bénéfique pour les expériences qui impliquent une modification génétique in vitro de types cellulaires difficiles à transfecter, tels que les cultures de cellules primaires humaines et de rongeurs, ainsi que les cellules souches pluripotentes induites par l’homme.
Toutes les procédures liées aux animaux ont été effectuées conformément aux directives de manipulation des animaux et au protocole approuvé par le ministère de la Santé de Hong Kong. Les licences d’expérimentation animale conformément à l’ordonnance sur les animaux (contrôle des expériences) (cap. 340) ont été obtenues auprès du ministère de la Santé du gouvernement de Hong Kong. Le travail sur les animaux a été effectué conformément à l’éthique de la sécurité animale approuvée par le bureau de recherche et le comité de sécurité des laboratoires de la HKBU. Reportez-vous à la Table des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole.
1. Préparation préalable à l’expérience
2. Jour expérimental 0
3. DIV 2 : Visualisation des cils primaires et étude de la voie de signalisation Hh
En utilisant l’Opti-MEM (voir le tableau des matériaux) comme réactif universel, cette méthodologie d’électroporation proposée pourrait atteindre une efficacité d’électroporation constamment élevée à ~ 80-90% (Figure 1). L’efficacité d’électroporation du vecteur Smo-EGFP a été déterminée à DIV 2 après l’électroporation par quantification du pourcentage de cellules vertes à fluorescence positive dans toutes les cellules GCP exprimant la protéi...
La transfection de transgènes en culture primaire de BPC par électroporation est généralement associée à une faible viabilité cellulaire et à une faible efficacité de transfection9,10. Cet article présente un protocole d’électroporation rentable et reproductible qui a démontré une efficacité et une viabilité élevées. En outre, nous démontrons également une méthode simple d’étude de la voie de signalisation Hh dépendante du cilium primair...
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Cette étude a été soutenue par le HKBU Seed Fund et la Subvention de démarrage de niveau 2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009), le Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) à C.H.H. Hor.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GCP Culture | |||
B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
IF staining | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Primary antibody mix | |||
Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Secondary antibody mix | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Electroporation | |||
CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon