Production automatisée à grande échelle de sphéroïdes de cellules souches dérivées de cellules adipeuses pour la bioimpression 3D

Résumé

Ici, nous décrivons la production à grande échelle de sphéroïdes stromaux / cellules souches (ASC) dérivés des adipeux à l’aide d’un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Ces sphéroïdes ASC peuvent être utilisés comme blocs de construction pour les approches de bio-impression 3D.

Résumé

Les cellules stromales/souches (ASC) dérivées des adiposes sont une sous-population de cellules présentes dans la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux sous-cutané humain reconnu comme une source classique de cellules stromales/souches mésenchymateuses. De nombreuses études ont été publiées avec des ASC pour des approches d’ingénierie tissulaire basées sur des échafaudages, qui ont principalement exploré le comportement de ces cellules après leur ensemencement sur des échafaudages bioactifs. Cependant, des approches sans échafaudage émergent pour concevoir des tissus in vitro et in vivo, principalement en utilisant des sphéroïdes, afin de surmonter les limites des approches basées sur des échafaudages.

Les sphéroïdes sont des microtissus 3D formés par le processus d’auto-assemblage. Ils peuvent mieux imiter l’architecture et le microenvironnement des tissus natifs, principalement en raison du grossissement des interactions de cellule à cellule et de matrice de cellule à extracellulaire. Récemment, les sphéroïdes sont principalement explorés en tant que modèles de maladies, études de dépistage de médicaments et éléments constitutifs de la bioimpression 3D. Cependant, pour les approches de bio-impression 3D, de nombreux sphéroïdes, de taille et de forme homogènes, sont nécessaires pour biofabriquer des modèles complexes de tissus et d’organes. De plus, lorsque les sphéroïdes sont produits automatiquement, il y a peu de risques de contamination microbiologique, ce qui augmente la reproductibilité de la méthode.

La production à grande échelle de sphéroïdes est considérée comme la première étape obligatoire pour le développement d’une ligne de biofabrication, qui se poursuit dans le processus de bioimpression 3D et se termine par la maturation complète de la construction tissulaire dans les bioréacteurs. Cependant, le nombre d’études qui ont exploré la production de sphéroïdes ASC à grande échelle est encore rare, ainsi que le nombre d’études qui ont utilisé des sphéroïdes ASC comme éléments constitutifs de la bioimpression 3D. Par conséquent, cet article vise à montrer la production à grande échelle de sphéroïdes ASC à l’aide d’une technique d’hydrogel micromoulé non adhésif répandant des sphéroïdes ASC comme éléments constitutifs pour les approches de bioimpression 3D.

Introduction

Les sphéroïdes sont considérés comme une approche sans échafaudage dans l’ingénierie tissulaire. Les ASC sont capables de former des sphéroïdes par le processus d’auto-assemblage. La microarchitecture 3D du sphéroïde augmente le potentiel de régénération des ASC, y compris la capacité de différenciation en plusieurs lignées ^1,2,3. Ce groupe de recherche a travaillé avec des sphéroïdes ASC pour l’ingénierie du cartilage et des tissus osseux ^4,5,6. Plus important encore, les sphéroïdes sont considérés comme des éléments constitutifs de la biofabrication des tissus et des organes, principalement en raison de leur capacité de fusion.

L’utilisation des sphéroïdes pour la formation des tissus dépend de trois points principaux: (1) le développement de méthodes robotiques standardisées et évolutives pour leur biofabrication⁷, (2) le phénotypage systématique des sphéroïdes tissulaires⁸, (3) le développement de méthodes pour l’assemblage de tissus 3D⁹. Ces sphéroïdes peuvent être formés avec différents types de cellules et obtenus par diverses méthodes, y compris la goutte suspendue, la réagrégation, la microfluidique et les micromoules ^8,9,10. Chacune de ces méthodes présente des avantages et des inconvénients liés à l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes, à la récupération des sphéroïdes après leur formation, au nombre de sphéroïdes produits, à l’automatisation des processus, à l’intensité de la main-d’œuvre et aux coûts¹¹.

Dans la méthode du micromoulage, les cellules sont distribuées et déposées au fond du micromoulage en raison de la gravité. L’hydrogel non adhésif ne permet pas aux cellules d’adhérer au fond, et les interactions cellule-à-cellule conduisent à la formation d’un seul sphéroïde par récession ^8,12. Cette méthode de biofabrication génère des sphéroïdes de taille homogène et contrôlée, peut être robotisée pour une production à grande échelle de manière rapide avec un minimum d’effort, et présente de bons facteurs critiques de rentabilité dans la conception d’une biofabrication de sphéroïde tissulaire ^7,8. Cette méthode peut être appliquée pour former des sphéroïdes de n’importe quelle lignée cellulaire afin de préparer un nouveau type de tissu avec des caractéristiques prévisibles, optimales et contrôlables⁸.

La biofabrication est définie comme « la génération automatisée de produits biologiquement fonctionnels avec une organisation structurelle... »¹³. Par conséquent, la production automatisée de sphéroïdes est considérée comme la première étape obligatoire pour le développement d’une ligne de biofabrication, qui se poursuit dans le processus de bio-impression 3D et se termine par la maturation complète du tissu bioimprimé par fusion sphéroïde. Dans cette étude, pour améliorer l’évolutivité de la biofabrication des sphéroïdes ASC, nous utilisons un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Cet article montre qu’il était possible de produire un grand nombre (des milliers) de sphéroïdes nécessaires aux approches de bio-impression 3D pour biofabriquer des modèles tissulaires plus complexes.

Protocole

Les ASC utilisés dans cette étude ont déjà été isolés à partir de donneurs humains en bonne santé et cryoconservés comme décrit¹⁴ selon le Comité d’éthique de la recherche de l’hôpital universitaire Clementino Fraga Filho, Université fédérale de Rio de Janeiro, Brésil (25818719.4.0000.5257). Voir le tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux et équipements utilisés dans cette étude.

1. Trypsinisation de la monocouche ASC au passage trois

1. Ouvrir la culture tissulaire 175 cm² flacon contenant la monocouche d’ASC à 80% de confluence et jeter le surnageant.
2. Ajouter 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 0,01 M) et laver la monocouche deux fois. Ensuite, jetez le liquide.
3. Ajouter 5 mL de trypsine à 0,125 % avec 0,78 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Ensuite, incuber pendant 5 min à 37 °C.
4. Ajouter 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM LOW) à faible teneur en glucose de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) à la fiole de culture tissulaire de 175 cm² et bien mélanger la suspension cellulaire avec une pipette sorologique de 10 mL.
5. Récoltez la suspension cellulaire avec une pipette sérologique de 10 mL et transférez-la dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Ensuite, centrifuger à 400 × g pendant 5 min pour obtenir la pastille d’ASC. Remettez en suspension la pastille de la cellule en utilisant DMEM LOW contenant 10% de FBS.
6. Effectuez un comptage de cellules par exclusion de trypan.
7. Après avoir compté, prenez un total de 1 × 10⁶ ASC dans un tube centrifuge de 15 mL séparé pour ensemencer les 81 récessions micromoulées avec de l’hydrogel non adhérent (un total de 10 000 cellules / mL ensemencées ici). Pour ensemencer 256 récessions d’hydrogel micromoulé non adhérent, prenez un total de 5 × 10⁵ ASC dans un tube centrifuge (un total de 2 500 cellules / mL ensemencées ici).

2. Fabrication d’hydrogel d’agarose non adhérent micromoulé

1. Préparer 50 mL d’une solution stérile d’agarose ultrapure à 2 % dans du NaCl à 0,9 % dans de l’eau ultrapure. Autoclaver la solution pendant 30 min à 121 °C.
2. Ajouter 500 μL de solution stérile d’agarose ultrapure à 2% au centre d’un moule en silicone contenant 81 ou 256 renfoncements circulaires.
3. Après 40 min, démoulez l’agarose ultrapure du moule en silicone et placez-la dans un puits d’une plaque en plastique à 12 puits.
4. Ajouter 2 mL de DMEM LOW dans le puits avec l’agarose micromoulée et incuber dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère de CO_{2 à} 5 % pendant au moins 12 h avant d’ensemencer les ASC.

3. Biofabrication des sphéroïdes ASC à l’aide du système de pipetage automatisé

1. Vérifiez les points suivants :
   1. Vérifiez si le flux laminaire est activé et si le flux d’air de l’armoire fonctionne correctement.
   2. Vérifiez si l’équipement est connecté à la bonne tension.
   3. Vérifiez si la tablette est connectée à l’équipement.
   4. Vérifiez si la hauteur du verre de protection de l’armoire est à la même hauteur que le marquage du capteur de l’équipement.
2. Appuyez sur le bouton Marche/Arrêt sur le côté gauche de l’équipement et attendez que la tablette et l’équipement démarrent.
3. Placez les boîtes de pointe, le rack pour les tubes centrifuges et la plaque contenant l’hydrogel d’agarose micromoulé dans l’espace de travail de l’équipement.
4. Sur la tablette avec le logiciel ouvert, cliquez d’abord sur Labware Editor.
5. Installez une table de travail virtuelle et choisissez les positions des pipettes, des boîtes à embouts, du rack pour les tubes en plastique et des plaques.
   REMARQUE : La table de travail virtuelle doit représenter les positions physiques des accessoires dans l’équipement.
6. Cliquez sur le bouton Passer à la production pour inclure les paramètres (voir étape 3.10) et les commandes que l’équipement exécutera tout au long de l’expérience. Attendez qu’une barre d’outils et une liste de produits s’ouvrent dans le logiciel.
7. Initialement, pour indiquer les commandes, incluez le nombre d’échantillons à pipeter et faites-le glisser vers la liste de production.
   REMARQUE: Le nombre d’échantillons est le nombre de tubes centrifuges en plastique contenant la suspension ASC à ensemencer au centre des micromoules.
8. Après avoir entré le nombre d’échantillons, cliquez sur le bouton de commande Transfert d’échantillons du logiciel pour transférer la suspension ASC vers les puits de la plaque de 12 puits, contenant les micromoules, et faites-la glisser vers la liste des produits.
9. Cliquez sur Propriétés pour définir les positions de début et de fin de l’équipement pour transférer l’échantillon.
10. Attendez que le logiciel revienne à la page Table de travail . Cliquez sur le bouton Options pour configurer les paramètres d’ensemencement automatisé des ASC: i) Vitesse d’aspiration de 15,4 ^s-1; ii) Vitesse de distribution de 1 ^s-1; iii) Délai de soufflage de 0 ms; iv) Vitesse de soufflage de 15,4 ^s-1; v) Avc initial de 100%. Sélectionnez Eau comme type de liquide standard.
11. Configurer les paramètres pour mélanger les ASC afin d’obtenir une suspension homogène : i) Nombre de cycles de 5 ; ii) Vitesse de 6,5 ^s-1; iii) Volume de 300 μL.
12. Après avoir configuré les paramètres, ajoutez le temps de 40 min à la liste des produits.
    REMARQUE: Ce temps est nécessaire pour attendre que la suspension ASC décante au bas du micromoulage.
13. Dans la liste des produits, incluez l’option Transfert de réactif pour transférer le milieu de culture sphéroïde vers les puits correspondants de la plaque.
14. Répétez les étapes 3.9 à 3.11 pour configurer les configurations de position et de paramètres pour transférer le milieu de culture sphéroïde.
15. Cliquez sur le bouton avec un symbole de contrôle sur la barre supérieure du logiciel pour vous assurer qu’il n’y a pas d’erreur de programmation.
16. Cliquez sur le bouton Lecture (avec un symbole triangulaire) dans la barre supérieure du logiciel pour démarrer le programme.
17. Laissez l’équipement démarrer, comme programmé, et attendez qu’il émette un son, indiquant qu’il est terminé.
18. Recueillir la plaque de 12 puits et l’incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant au moins 18 h pour que les sphéroïdes soient complètement formés et compacts.
19. Récoltez manuellement les sphéroïdes après 1, 3 et 7 jours de culture pour analyse. Rincer manuellement le milieu avec une micropipette pour libérer les sphéroïdes de l’hydrogel d’agarose micromoulé non adhérent.
20. Après 5 min, vérifiez au microscope si les sphéroïdes sont complètement libérés de l’hydrogel d’agarose non adhérent micromoulé.
21. Collectez les sphéroïdes manuellement à l’aide d’une micropipette et transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
22. Lavez les sphéroïdes au moins deux fois avec 0,01 M PBS. Évaluer la viabilité et effectuer des analyses biomécaniques sur les échantillons de sphéroïdes frais. Pour l’analyse morphologique (histologie), incuber les échantillons de sphéroïdes dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant au moins 18 h à 2-8 °C.

Résultats

Le système de pipette automatique peut ensemencer la suspension de la cellule ASC dans 12 puits d’une plaque de 12 puits en 15 min. L’utilisation des 81 hydrogels micromoulés non adhérents produira 972 sphéroïdes à la fin du protocole. L’utilisation des 256 hydrogels micromoulés non adhérents produira 3 072 sphéroïdes à la fin du protocole. Les sphéroïdes ASC ont été analysés pour l’homogénéité de leur taille et de leur forme. Les sphéroïdes ASC des micromoules avec 81 récessions ont montré...

Discussion

Cet article présente la génération à grande échelle de sphéroïdes ASC à l’aide d’un système de pipette automatisé. L’étape critique du protocole consiste à configurer avec précision le logiciel pour assurer le volume correct de suspension de cellule, la vitesse et la distance pour le pipetage. Les paramètres décrits dans le protocole ont été déterminés après un certain nombre d’essais afin d’optimiser la distribution de la suspension de cellules ASC dans les puits de plaques de 12 puits cont...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plastic plate	Corning	3512
50 mL centrifuge tube	Corning	CLS430828
EpMotion 5070	Eppendorf	5070000282
epT.I.P.S. Motion	Eppendorf	30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	15576028
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)	Gibco	31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array	Sigma	Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array	Sigma	Z764019
phosphate saline buffer (PBS)	Sigma	806552
sodium chloride (NaCl)	Sigma	S8776
tissue culture flask	Corning	430720U
trypan	Lonza	17-942E
trypsin	Gibco	27250018
ultrapure agarose	Invitrogen	16500100