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Résumé

La lacune de Phormidium est une cyanobactérie filamenteuse qui a été isolée à partir de bassins rocheux marins. Cet article décrit l’isolement des filaments à partir de sources naturelles, l’extraction de l’ADN, le séquençage du génome, la transformation naturelle, l’expression du sfGFP, la cryoconservation et les méthodes de motilité.

Résumé

Les cyanobactéries font l’objet de recherches fondamentales et de projets biotechnologiques dans lesquels l’énergie solaire est utilisée pour la production de biomasse. La lacune de Phormidium est une cyanobactérie filamenteuse nouvellement isolée. Cet article décrit comment de nouvelles cyanobactéries filamenteuses peuvent être isolées à partir de bassins rocheux marins. Il décrit également comment l’ADN peut être extrait des filaments et comment les génomes peuvent être séquencés. Bien que la transformation soit établie pour de nombreuses espèces unicellulaires, elle est moins fréquemment rapportée pour les cyanobactéries filamenteuses. Une méthode simplifiée pour la transformation naturelle de P. lacuna est décrite ici. P. lacuna est le seul membre de l’ordre des Oscillatoriales pour lequel une transformation naturelle est établie. Cet article montre également comment la transformation naturelle est utilisée pour exprimer la protéine fluorescente verte superdosseuse (sfGFP). Un promoteur cpcB endogène a induit une expression environ 5 fois plus forte que les promoteurs cpc560, A2813 ou psbA2 de Synechocystis sp. PCC6803. En outre, une méthode de cryoconservation de P. lacuna et de Synechocystis sp.CPP 6803 a été établie, et des méthodes d’évaluation de la motilité dans un milieu liquide et sur des surfaces en gélose et en plastique sont décrites.

Introduction

Les cyanobactéries sont des organismes procaryotes qui utilisent la photosynthèse comme source d’énergie 1,2. La recherche se concentre de plus en plus sur les espèces cyanobactériennes. Plusieurs cyanobactéries peuvent être transformées avec de l’ADN3. Les gènes peuvent être assommés ou surexprimés chez ces espèces. Cependant, la transformation est limitée à quelques espèces 4,5,6,7,8,9,10,11, et il peut être difficile d’établir une transformation dans les souches des collections de culture ou de la nature 8. Des souches de l’espèce filamenteuse Phormidium lacuna (Figure 1) ont été isolées dans des bassins rocheux marins, dans lesquels les conditions environnementales, telles que les concentrations de sel ou la température, fluctuent au fil du temps. Ces cyanobactéries filamenteuses peuvent être utilisées comme organismes modèles pour l’ordreoscillatoriales 12 auquel elles appartiennent.

Au cours d’essais testant le transfert de gènes par électroporation 13,14, il a été constaté que P. lacuna peut être transformé par transformation naturelle15. Dans ce processus, l’ADN est absorbé naturellement par certaines cellules. Par rapport à d’autres méthodes de transformation16,17, la transformation naturelle a l’avantage de ne pas nécessiter d’outils supplémentaires qui pourraient compliquer la procédure. Par exemple, l’électroporation nécessite des cuvettes appropriées, des fils intacts et la sélection de la tension appropriée. P. lacuna est actuellement le seul membre d’Oscillatoriales sensible à la transformation naturelle. Étant donné que le protocole d’origine est basé sur des protocoles d’électroporation, il comprenait toujours plusieurs étapes de lavage qui pourraient être inutiles. Différentes approches ont été testées pour simplifier le protocole, ce qui a conduit au protocole de transformation présenté ici.

La séquence du génome est essentielle pour d’autres études moléculaires basées sur l’élimination ou la surexpression des gènes. Bien que les séquences du génome puissent être obtenues avec des machines de séquençage de nouvelle génération en peu de temps, l’extraction de l’ADN peut être difficile et dépend de l’espèce. Avec P. lacuna, plusieurs protocoles ont été testés. Une méthode modifiée à base de bromure de cétyle triméthylammonium (CTAB) a ensuite été établie, ce qui a permis d’obtenir une pureté acceptable des rendements en ADN et en ADN de chaque cycle de purification pour la poursuite des travaux en laboratoire. Le génome de cinq souches pourrait être séquencé avec ce protocole. L’étape de transformation logique suivante consistait à établir l’expression des protéines dans P. lacuna.

Le sfGFP utilisé comme protéine marqueur dans ce protocole peut être détecté avec n’importe quel microscope à fluorescence. Tous les promoteurs testés ont pu être utilisés pour l’expression de P. lacuna sfGFP. Le nombre croissant de souches résultant de la transformation a entraîné la nécessité d’une méthode de stockage des cultures. De telles méthodes sont établies pour Escherichia coli et de nombreuses autres bactéries18. Dans les protocoles standard, les cultures de glycérol sont préparées, transférées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C. Cette méthode ne nécessite que quelques étapes et est très fiable pour les espèces pour lesquelles elle est établie. Le protocole standard n’était pas réalisable pour P. lacuna parce que les cellules vivantes ne pouvaient pas être récupérées dans tous les cas. Cependant, lorsque le glycérol a été retiré après la décongélation, les cellules de tous les essais ont survécu. Des méthodes simples sont présentées pour l’analyse de la motilité de P. lacuna, qui peuvent être combinées avec la mutagénèse knockout pour étudier le pili de type IV ou le rôle des photorécepteurs. Ces tests sont différents de ceux des cyanobactéries unicellulaires 19,20,21 et peuvent également être utiles pour d’autres oscillatoriums.

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Protocole

1. Isolement de l’environnement naturel

REMARQUE: Les algues vertes, les diatomées, les cyanobactéries filamenteuses et d’autres microalgues peuvent être isolées. Le protocole peut être utilisé pour toutes les espèces de microalgues provenant de bassins rocheux poussant dans des conditions de laboratoire. Les cyanobactéries filamenteuses qui appartiennent aux oscillatoriales peuvent être facilement reconnues par leur mouvement et leur forme filamenteuse. L’espèce peut être identifiée dans un état semi-pur par séquençage du génome ou séquençage de l’ARNr 16S.

  1. Transférer des échantillons d’eau de mer liquide provenant de bassins rocheux marins (c.-à-d. cavités de la côte rocheuse) dans des flacons de 50 ml. Pour chaque flacon, notez l’emplacement exact ou les coordonnées de la source naturelle. Si possible, filtrez le contenu à travers des filets de 50 μm pour réduire les quantités de zooplancton. Conservez les échantillons à 4 °C jusqu’à ce qu’ils puissent être sous-cultivés.
  2. Transférer des cultures de 1 mL dans des boîtes de Petri de 10 cm contenant 3% de bacto-agar en milieu f/222,23 (voir le Tableau des matériaux). Préparez jusqu’à 20 assiettes. Cultiver sous une lumière blanche de 50 μmol m-2 s-1.
    REMARQUE: Des intensités lumineuses plus élevées peuvent être utilisées pour la culture. Une intensité allant jusqu’à 400 μmol m-2 s-1 peut être utilisée pour P. lacuna, bien que d’autres espèces puissent être plus sensibles à la lumière.
  3. Après une semaine, transférez les cellules souhaitées sur des plaques de gélose fraîches à l’aide de pinces stériles. Isolez les cellules sous un microscope binoculaire dans des conditions stériles. Conservez l’ancienne plaque d’agar à 4 °C jusqu’à ce que les cellules apparaissent et se développent sur la nouvelle plaque d’agar.
  4. Répétez cette étape de transfert chaque semaine pour éliminer la contamination. Utilisez l’œil nu pour détecter une contamination lourde et un microscope avec un grossissement de 400x pour des contrôles supplémentaires de contamination.
  5. Si un échantillon semble exempt de contamination, tester la contamination bactérienne ou fongique sur les plaques de gélose. Transférer une fraction de la culture avec une boucle d’inoculation sur une plaque de gélose LB24 (10 cm de diamètre), maintenir la plaque à température ambiante et vérifier la croissance des contaminants pendant 1 à 3 jours.
  6. Si une espèce cyanobactérienne filamenteuse stérile est obtenue, utilisez-la pour d’autres travaux de culture. Cultiver P. lacuna dans un liquide ou sur des plaques de bacto-agar. Utilisez des flacons de 250 mL avec 50 mL de milieu f/2 ou f/2+ pour la culture liquide.

2. Extraction de l’ADN

NOTE: Cette méthode est adoptée à partir de 25 26

  1. Préparer deux flacons avec 50 mL de f/2 de milieu. Inoculez chacun avec ~ 1 mL de filaments de P. lacuna provenant d’autres cultures en croissance. Conserver les cultures pendant 7 jours ou plus sous agitation (rotation horizontale) à 50 tr/min sous lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) à 25 °C.
  2. Traiter la culture avec des ultrasons (voir le tableau des matériaux) pendant 2 min avec toute l’énergie. Mesurer la DO à 750 nm; vérifiez qu’il est ~0,5. Continuez à cultiver les cultures si le DO est trop bas.
  3. Recueillir les filaments par 5 000 × g, 20 min de centrifugation. Retirez le surnageant. Transférer les filaments avec le liquide résiduel dans la chambre d’un Français Press27. Réglez la pression de la presse Français à 20 000 psi et extrayez les cellules.
    REMARQUE: La presse Français va lyser toutes les cellules et libérer l’ADN; de fortes forces de cisaillement produiront des fragments d’ADN de 1 500 bp.
  4. Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 10 000 × g et retirer le surnageant.
  5. Ajouter 400 μL de tampon de lyse (4 M d’urée, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) et 50 μL de protéinase K (10 mg/mL) à la pastille. Chauffer l’échantillon à 55 °C pendant 60 min en agitant à 550 tr/min.
  6. Ajouter 1 mL de tampon d’extraction d’ADN (3 % CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1 % Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) et incuber pendant 60 min à 55 °C et 550 tr/min. Transférer les solutions dans des tubes de centrifugation et ajouter deux volumes de chloroforme/isoamylalcool (24/1).
  7. Après agitation, centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 9 000 × g. Transférer la phase aqueuse supérieure dans des flacons de réaction et ajouter 1 mL d’éthanol glacé et 50 μL d’acétate de sodium 3 M.
  8. Vortex l’échantillon et placez-le à -20 °C pendant 1 h ou plus.
  9. Centrifuger pendant 5 min à 10 000 × g (4 °C) et jeter le surnageant. Lavez la pastille avec de l’éthanol à 70 %.
  10. Centrifuger à nouveau l’échantillon. Retirez le surnageant et séchez la pastille pendant la nuit. Dissoudre l’ADN dans de l’eau sans nucléase. Mesurer le spectre de l’ADN pour vérifier si la DO 260 nm/OD 280 nm est comprise entre 1,6 et 1,9.
  11. Analyser la taille de l’ADN sur un gel d’électrophorèse d’agarose28.
  12. Séquencez l’ADN génomique par séquençage de nouvelle génération pendant 300 cycles, avec un réglage d’extrémité appariée et une longueur de lecture de 150 bases (voir les tables des matériaux).
  13. Effectuez l’assemblage avec le programme informatique approprié; voir l’exemple donné dans la Table des matières.
  14. Soumettez le brouillon du génome au serveur RAST pour annotation.
    REMARQUE: Téléchargez des séquences d’ADN pour obtenir une annotation complète en quelques minutes.

3. Transformation naturelle et expression des GFP

REMARQUE: La transformation est basée sur un vecteur plasmidique propagé chez E. coli; pGEM-T ou pUC19 peuvent être utilisés comme vecteurs dorsaux. Des techniques de clonage sont établies dans de nombreux laboratoires; voir aussi les protocoles standard28 et les articles sur les vecteurs de transformation pour P. lacuna15,29. Des exemples de vecteurs pour l’expression sfGFP sont décrits dans la section des résultats représentatifs. Les détails de quatre vecteurs non encore publiés sont fournis dans le fichier supplémentaire 1.

  1. Effectuez toutes les étapes en utilisant un matériau stérile dans des conditions de laboratoire stériles (banc propre, verrerie stérile).
  2. Inoculer 2 x 50 mL de milieu liquide f/2 dans deux flacons de 250 mL avec 2 x 1 mL de filaments P. lacuna provenant d’une culture en cours d’exécution. Cultiver à la lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) sous agitation (rotation horizontale, 50 tr/min) pendant environ 5 jours à 25 °C.
  3. Préparez environ 200 μg d’ADN vecteur de transformation à l’aide d’un kit de préparation midi (voir le tableau des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
  4. Homogénéiser 100 mL de suspension de cellules P. lacuna (voir le tableau des matériaux) à 10 000 tr/min pendant 3 min. Mesurer la DO à 750 nm (valeur souhaitée = 0,35).
  5. Centrifuger la suspension de la cellule pendant 15 min à 6 000 × g. Retirez le surnageant et suspendez la pastille dans 800 μL (volume total, y compris le liquide résiduel et les filaments) du liquide restant et du milieu f/2+ supplémentaire.
  6. Prendre huit plaques de bacto-agar f/2+ (10 cm de diamètre) contenant 120 μg/mL de kanamycine. Pipette 10 μg d’ADN au milieu de chaque plaque de gélose. Pipeter immédiatement 100 μL de suspension cellulaire au milieu de chaque plaque de gélose (au-dessus de l’ADN).
  7. Gardez la plaque de gélose sans couvercle sur le banc propre pour permettre à l’excès de liquide de s’évaporer. Fermez la plaque et cultivez-la à la lumière blanche à 25 °C pendant 2 jours.
  8. Répartir les filaments de chaque plaque de gélose avec une boucle d’inoculation sur plusieurs plaques de bacto-agar f/2+ fraîches contenant 120 μg/mL de kanamycine. Cultivez les plaques à la lumière blanche à 25 °C et vérifiez régulièrement les cultures au microscope.
  9. Identifiez les filaments vivants et transformés après 7 à 28 jours au microscope. Recherchez des filaments verts sains (Figure 2) qui sont différents des autres filaments. Si ces filaments verts peuvent être identifiés, passez à l’étape suivante; sinon, conservez l’assiette pendant encore 7 jours.
  10. Utilisez des pinces pour transférer ces filaments vivants identifiés dans 50 mL de milieu liquide f/2+ avec 250 μg/mL de kanamycine. Cultiver à la lumière blanche à 25 °C sur un agitateur (rotation horizontale, 50 tr/min). Observez la croissance jusqu’à quatre semaines.
  11. Transférer les filaments dans un milieu agar contenant 250 μg/mL de kanamycine et attendre que les filaments se développent. Après plusieurs jours, transférer des filaments simples sur une plaque de gélose fraîche avec une concentration plus élevée de kanamycine, par exemple 500 μg / mL. Conservez la plaque d’origine.
  12. S’assurer que les filaments se propagent à une concentration élevée de kanamycine en culture liquide ou sur une gélose. Augmentez à nouveau la concentration de kanamycine pour accélérer la ségrégation.
    REMARQUE : P . lacuna transformé se développe jusqu’à 10 000 μg/mL de kanamycine. D’autres espèces pourraient ne pas tolérer de telles concentrations élevées.
  13. Si des cellules résistantes sont cultivées et réparties largement sur une plaque, testez l’intégration de l’insert dans le génome de P. lacuna en effectuant une PCR avec des amorces externes et internes.
    1. Utilisez des amorces conçues pour le clonage de l’insertion en tant qu’amorces internes.
    2. Pour la conception des amorces externes, sélectionnez des séquences qui sont 5' et 3' du site d’insertion proposé sur le génome de P. lacuna mais en dehors de l’insertion.
    3. Pour les réactions pcR, utilisez des amorces internes et des amorces externes. Utilisez la ou les souches résistantes et le type sauvage.
      REMARQUE: Les amorces internes indiquent que l’insert est présent; les amorces extérieures montrent que l’insert est inséré au bon emplacement.
  14. Pour chaque réaction de PCR, placez ~10 mg de filaments directement dans les tubes de PCR et effectuez la PCR selon les protocoles standard24. Si aucun produit n’est obtenu, faire varier la température de recuit et laver les filaments à l’eau.
    REMARQUE: De nombreuses polymérases différentes peuvent être utilisées dans la PCR. Les polymérases standard, telles que la Taq polymérase, ont un taux d’erreur plus élevé que les polymérases de vérification des erreurs, qui sont plus chères. Cette PCR analytique ne nécessite aucune polymérase de vérification des erreurs. Cependant, la polymérase de vérification des erreurs doit être testée si aucun produit PCR n’est obtenu avec une polymérase standard.
  15. Analyser les produits PCR de la ligne résistante sur l’électrophorèse de l’agarose24.
    1. Comparez les positions des bandes avec le marqueur et comparez le type sauvage et le transformant. Avec les amorces intérieures et extérieures, recherchez une bande plus grande pour le transformant que le type sauvage (en raison de l’insertion de la cassette de résistance) ou deux bandes pour le transformant: une avec la taille de la bande de type sauvage et une plus grande. Comme ce dernier cas indique une ségrégation incomplète, continuer la culture avec des concentrations élevées de kanamycine.
      REMARQUE: Pour plus de détails sur la PCR et l’électrophorèse, voir15,24 ou d’autres documents standard.
  16. Pour l’expression GFP : observez des filaments simples avec un microscope à fluorescence (voir la Table des matériaux) à un grossissement de l’objectif fixé à 40x ou 63x. Capturez une image de transmission en champ clair et une image de fluorescence. Utilisez les paramètres suivants pour GFP : passe-bande de 470 nm pour l’excitation, bande passante de 525 nm pour l’émission et séparateur de faisceau de 495 nm, temps d’exposition initial de 500 ms.
  17. Ajustez le temps d’exposition pour des signaux de fluorescence clairs, en évitant les intensités saturantes. Essayez d’utiliser le même paramètre pour tous les échantillons.
  18. Comme les filaments de type sauvage afficheront également la fluorescence, capturez des images avec les mêmes paramètres que ci-dessus pour cette fluorescence d’arrière-plan.
    REMARQUE: La déformation exprimant GFP doit avoir un signal plus élevé; sinon, il n’exprime pas la GFP.
  19. En fonction des temps d’exposition et de l’intensité en pixels des images de fluorescence, calculez et comparez la teneur en GFP des différents filaments.

4. Cryoconservation

NOTE: P. lacuna et la cyanobactérie unicellulaire Synechocystis sp. PCC 6803 sont utilisés. La méthode actuelle fonctionne mieux pour P. lacuna.

  1. Cultiver P. lacuna ou Synechocystissp PCC 6803 pendant au moins 10 jours dans 10 mL de milieu f/2+ ou BG-11, respectivement, sous lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) à 25 °C sous agitation (rotations horizontales, 50 tr/min).
  2. Homogénéiser la culture de P. lacuna (voir le Tableau des matériaux) à 10 000 tr/min pendant 3 min ou avec un appareil à ultrasons (voir le Tableau des matériaux) pendant 2 min à pleine énergie. Déterminez OD 750 nm de l’une ou l’autre culture pour vérifier si la valeur est comprise entre 1 et 7.
  3. Prélever les cellules par centrifugation à 6 000 × g pendant 15 min. Retirez le surnageant.
  4. Suspendre la pastille cellulaire dans 800 μL de milieu f/2+ ou BG-11 (volume final) et transférer dans un milieu cryovial de 2 mL. Ajouter 800 μL d’une solution de glycérol à 50 % à la suspension cellulaire. Fermer le flacon et mélanger en inversant à plusieurs reprises.
  5. Transférer le cryoviral dans l’azote liquide et le stocker dans une cryobox dans un congélateur à -80 °C. Notez la position de la boîte dans le congélateur et les coordonnées de l’échantillon dans la boîte.
  6. Pour la récupération des cellules, retirez le cryovial et décongelez le contenu à température ambiante. Transférer le contenu dans un tube de réaction de 2 mL.
  7. Lavez l’échantillon deux fois. Pour le1er lavage, centrifuger à 6 000 × g pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettez la pastille dans 2 mL de milieu f/2+ ou BG-11. Pour le 2e lavage, la récenteurière à 6 000 × g pendant 5 min, retirer le surnageant et suspendre la pastille dans 2 mL de milieu f/2+ ou BG-11.
  8. Pour vérifier l’intégrité de ces cellules prêtes à être cultivées, transférer la pastille dans 9 mL de milieu et les cultiver à la lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) sous agitation (55 tr/min). Comparez l’OD 750 nm de la culture le premier jour et après 1 semaine.

5. Motilité de la lacune de Phormidium

REMARQUE: Trois essais différents seront décrits. La même culture est utilisée dans tous les cas.

  1. Cultiver P. lacuna dans un milieu f/2 sous agitation horizontale (50 tr/min) en lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) pendant environ 5 jours jusqu’à ce que la DO estimée à 750 nm soit de 0,35. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Homogénéiser les filaments (voir le Tableau des Matériaux) à 10 000 tr/min pendant 3 min ou avec des ultrasons (voir le Tableau des Matériaux) pendant 1 min à puissance maximale et cycle de 1. Mesure OD 750 nm. Si elle est supérieure à 0,35, diluer la fraction avec un milieu f/2. Utilisez cette solution dans les tests de motilité des étapes 5.3, 5.4 et 5.5.
  3. Dosage pour le mouvement en milieu liquide
    1. Pour l’observation directe de la motilité, transférer 8 mL de milieu contenant P. lacuna (à partir de l’étape 5.2) dans une boîte de Petri de 6 cm. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que l’échantillon atteigne la température ambiante. Couvrir la boîte de Petri avec du papier d’aluminium en cellophane.
    2. Placez une lame de microscope sur la table x-y d’un microscope standard avec une caméra. Allumez la lumière du microscope. Idéalement, utilisez toujours les mêmes réglages électriques et optiques pour l’éclairage. Déplacez un objectif 4x ou 10x dans le chemin de la lumière.
    3. Placez la boîte de Petri sur le dessus de la diapositive. Ajustez les filaments simples ou les faisceaux de filaments par x, y et z mouvements de la table.
      REMARQUE: En raison de la disposition tridimensionnelle, seule une partie de la section pertinente peut être mise au point. La feuille de cellophane permet d’ajuster la mise au point sans restriction.
    4. Observez les mouvements de filaments simples ou de faisceaux. Assurez-vous que l’objectif ne touche pas le liquide. Enregistrez les mouvements des filaments avec une caméra de microscope standard (voir Vidéo supplémentaire S1).
  4. Essai de mouvement sur la surface
    1. Pour l’observation de la motilité du filament sur les surfaces de gélose, préparez des boîtes de Petri de 6 cm avec f/2 bacto-agar. Assurez-vous que la gélose est suffisamment haute pour que l’objectif se rapproche de la surface de la gélose. Alternativement, préparez une couche d’agar d’environ 3 mm d’épaisseur et enregistrez les filaments à travers la gélose (gardez la plaque à l’envers ou utilisez un microscope inversé).
    2. Pipette 0,5 mL d’une solution contenant P. lacuna (à partir de l’étape 5.2) sur la surface bacto-agar d’une boîte de Petri de 6 cm. Laissez le liquide pénétrer dans la surface. Fermez la boîte de Petri et observez le mouvement des filaments sur la surface à l’aide d’un objectif 4x ou 10x.
    3. Assurez-vous que les mêmes réglages électriques et optiques du microscope sont utilisés tout au long de l’enregistrement et dans les enregistrements ultérieurs.
    4. Capturez des enregistrements en accéléré à l’aide d’une caméra oculaire et d’un système de mini-ordinateur. Assurez-vous que l’intervalle de temps entre les images suivantes est de 5 s-1 min. Programmez le script Linux du mini-ordinateur pour contrôler l’enregistrement en accéléré. Voir Fichier supplémentaire 2 pour un exemple de script et Vidéo supplémentaire S2 à titre d’exemple.
  5. Dosage pour phototaxis
    1. Pour les expériences de phototaxie, préparez des supports de diodes électroluminescentes (LED) (ici, avec une imprimante 3D) dans lesquels les LED de 5 mm sélectionnées sont montées pour irradier une zone de 20 mm2 du bas vers le haut (Figure 3). Si nécessaire, utilisez de nombreux supports led en parallèle, en connectant chaque LED électriquement via une résistance et un potentiomètre à une alimentation réglable. Mesurez et ajustez les intensités des LED, en fonction de l’expérience. Assurez-vous que l’ensemble du décor se trouve dans une pièce sombre ou un récipient sombre fermé.
    2. Placer 8 mL du milieu contenant P. lacuna (à partir de l’étape 5.2) dans une boîte de Petri de 6 cm. Ajustez l’intensité lumineuse de la LED. Fermez la boîte de Petri avec le couvercle et placez-la sur un support LED afin que la LED soit au centre de la boîte de Petri.
    3. Après la durée souhaitée (généralement 2 jours), capturez une image de la boîte de Petri avec un appareil photo de smartphone visant directement la position du traitement par la lumière. Utilisez un panneau LED blanc pour l’irradiation de l’échantillon. Utilisez les réglages manuels de l’appareil photo; éviter les reflets de lumière; ajustez toujours pour obtenir la même distance entre l’objectif de l’appareil photo et l’échantillon. Assurez-vous que les paramètres d’exposition donnent une image adaptée aux analyses ultérieures à l’aide d’ImageJ.
    4. Quantifiez le diamètre du cercle central des filaments à l’aide du logiciel ImageJ.
      1. Ouvrez ImageJ, cliquez sur Fichier | Ouvrez, sélectionnez le fichier souhaité, puis cliquez sur Entrée.
      2. Sélectionnez le bouton Droit (avec une ligne droite). Appuyez sur le bouton gauche de la souris pour tracer une ligne d’une extrémité de la boîte de Pétri à l’extrémité opposée. Assurez-vous que la ligne passe par le centre du cercle de filaments.
      3. Appuyez sur Ctrl-K sur le clavier ou cliquez sur Analyser | Profil de tracé dans le menu ImageJ. Recherchez une fenêtre x-y avec des intensités de pixels tracées par rapport à la distance - un profil 1D de la boîte de Petri. Assurez-vous que l’intensité de pixel la plus faible est légèrement supérieure à 0 et la valeur la plus élevée inférieure à 255.
      4. Estimez une valeur moyenne pour l’intensité des pixels à l’extérieur du cercle et une autre valeur moyenne pour l’intensité des pixels dans le cercle. À la position y- entre ces valeurs, estimez les valeurs x des deux côtés du cercle en pointant avec la souris sur ces positions. Notez les deux valeurs et calculez la différence.
      5. Obtenez la valeur x la plus élevée en pointant la souris sur l’axe des y à droite. Notez que cette valeur e représente le diamètre de la boîte de Pétri. Si ce diamètre est de 5 cm, calculez le diamètre du cercle central du filament comme d/e × 5 cm.

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Résultats

Selon les méthodes susmentionnées, 5 souches différentes de P. lacuna ont été isolées dans des bassins rocheux et séquencées (figure 1 et tableau 1). Toutes les cultures étaient stériles après environ 1 an de sous-culture, à l’exception de P. lacuna HE10JO. Cette souche est toujours contaminée par Marivirga atlantica, une bactérie marine. Au cours des excursions ultérieures à Helgoland, d’autres cyanobactéries filamenteuses ont...

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Discussion

Bien que de nombreuses souches de cyanobactéries soient disponibles dans les collections de culture 32,33,34,35,36, il existe toujours une demande de nouvelles cyanobactéries de la nature car ces espèces sont adaptées à des propriétés spécifiques. P. lacuna a été prélevé dans des bassins rocheux et est adapté aux variations des concentrat...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le travail a été soutenu par l’Institut de technologie de Karlsruher.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Freshwater SolutionSigma AldrichC3061
BG-11 mediumMerck73816-250ML
Boric acidMerck10043-35-3H3BO3
Calcium chloride dihydrateCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mLGreiner658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mLGreiner601975
Centrifuge LYNX 4000Thermo Scientific75006580and rotor
Centrifuge microstar 17VWR InternationalN/Afor up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrateMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrateMerck7758-99-8 CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotinCarl Roth58-85-5 C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kbNew England BiolabsN3232
DNA ladder 100 bpNew England BiolabsN3231
Electrical pipetting help accujet-pro SBrand GmbH26360for pipetting 1-25 mL
EthanolVWR64-17-5C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrateCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTomeZeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2Zeiss
French Pressure Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
Gel documation System Saffe ImageInvitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exuADVANCED
Glassware, different
GlycerolCarl Roth56-81-5C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrateMerck10025-77-1 FeCl3 · 6 H2O
KanamycinSigma-Aldrich25389-94-0
Kanamycin sulphateCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox)Carl RothX964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylightOSRAMcultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 WBloom StarN/Acultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrateCarl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrateServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kitMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDfor time-lapse recording
Ocular camera EC3Leicafor continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HDBresserfor time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µLGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µLGilsonSKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterileGreiner607107
Plastic tube, sterile, 15 mLGreiner188271
Plastic tube, sterile, 50 mLGreiner227261
Potassium bromideCarl Roth7758-02-3KBr
Potassium chlorideCarl Roth7447-40-7KCl
Power supply Statron 3252-1Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicsfor LED
Proteinase KPromegaMC500Cfrom Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymeraseNew England BiolabsM0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Instrumentsfor cultivation
Sodium acetateCarl Roth127-09-3NaCH3COO
Sodium chlorideCarl Roth7647-14-5NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
Sodium fluorideCarl Roth7681-49-4NaF
Sodium hydrogen carbonateCarl Roth144-55-8NaHCO3
Sodium molybdate dihydrateServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrateMerck7631-99-4NaNO3
Sodium sulphateCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Strontium chloride hexahydrateCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochlorideMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3Hielscher Ultrasound TechnologyUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instrumentshomogenizer
UreaCarl Roth57-13-6CH4N2O
Vitamin B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Vitamin solution0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatmentVEOLIA water technologiesELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrateSigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assemblyhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelinemakes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJsoftware for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation serverhttps://rast.nmpdr.orginput: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid mediumartificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid mediumf/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

Références

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