Détection et capture en temps réel de sous-populations cellulaires invasives provenant de co-cultures

Résumé

Nous décrivons une approche pour détecter et capturer des sous-populations cellulaires invasives en temps réel. La conception expérimentale utilise l’analyse cellulaire en temps réel en surveillant les changements dans l’impédance électrique des cellules. Le cancer invasif, les cellules immunitaires, endothéliales ou stromales dans les tissus complexes peuvent être capturés et l’impact des co-cultures peut être évalué.

Résumé

L’invasion et la propagation métastatique des cellules cancéreuses sont la principale cause de décès par cancer. Les tests développés très tôt pour mesurer le potentiel invasif des populations de cellules cancéreuses génèrent généralement une mesure à un seul critère d’évaluation qui ne fait pas la distinction entre les sous-populations de cellules cancéreuses ayant un potentiel invasif différent. En outre, le microenvironnement tumoral se compose de différentes cellules stromales et immunitaires résidentes qui modifient et participent au comportement invasif des cellules cancéreuses. L’invasion dans les tissus joue également un rôle dans les sous-populations de cellules immunitaires repoussant les micro-organismes ou éliminant les cellules malades du parenchyme et des cellules endothéliales pendant le remodelage des tissus et l’angiogenèse. L’analyse cellulaire en temps réel (RTCA) qui utilise des biocapteurs d’impédance pour surveiller l’invasion cellulaire a été un grand pas en avant au-delà de la mesure de l’invasion par le point final : elle fournit des mesures continues au fil du temps et peut donc révéler des différences dans les taux d’invasion perdus dans le test du point final. En utilisant la technologie RTCA actuelle, nous avons élargi les réseaux à double chambre en ajoutant une chambre supplémentaire qui peut contenir des cellules stromales et / ou immunitaires et permet de mesurer le taux d’invasion sous l’influence de facteurs sécrétés par des cellules stromales ou immunitaires en co-culture au fil du temps. Au-delà de cela, la conception unique permet de détacher des chambres à tout moment et d’isoler la cellule cancéreuse la plus invasive ou d’autres sous-populations cellulaires présentes dans des mélanges hétérogènes d’isolats tumoraux testés. Ces cellules cancéreuses les plus invasives et d’autres sous-populations cellulaires entraînent une progression maligne vers une maladie métastatique, et leurs caractéristiques moléculaires sont importantes pour les études mécanistes approfondies, le développement de sondes diagnostiques pour leur détection et l’évaluation des vulnérabilités. Ainsi, l’inclusion de médicaments à petites ou grandes molécules peut être utilisée pour tester le potentiel de thérapies qui ciblent le cancer et / ou les sous-populations de cellules stromales dans le but d’inhiber (par exemple, les cellules cancéreuses) ou d’améliorer (par exemple, les cellules immunitaires) comportement invasif.

Introduction

L’invasion cellulaire est un processus important qui permet aux cellules de traverser les barrières de la membrane basale en réponse aux signaux environnementaux fournis par les cellules stromales. C’est une étape cruciale à plusieurs stades de développement pour les réponses immunitaires, la cicatrisation des plaies, la réparation des tissus et les tumeurs malignes qui peuvent passer de lésions locales à des cancers invasifs et métastatiques¹. Les tests développés très tôt pour mesurer le potentiel invasif des populations cellulaires génèrent généralement une mesure à un seul point final ou nécessitent un pré-marquage des cellules invasives². L’intégration des techniques de microélectronique et de microfluidique est maintenant développée pour détecter différents aspects de la biologie cellulaire tels que la viabilité, le mouvement et l’attachement en utilisant l’impédance électrique des cellules vivantes sur les microélectrodes ^3,4. La mesure de l’impédance permet une évaluation quantitative, non invasive et sans étiquette de l’état cellulaire³. Nous décrivons ici un réseau à trois chambres basé sur la conception du système d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA) développé par Abassi et ^al.5. Le réseau à trois chambres permet d’évaluer les cellules co-cultivées sur l’invasion cellulaire et la récupération des cellules invasives pour des analyses supplémentaires ou une expansion.

Dans le système d’analyseur cellulaire, les cellules envahissent à travers une matrice extracellulaire recouverte d’une membrane poreuse et atteignent un réseau d’électrodes interdigitées positionné de l’autre côté de la barrière. Au fur et à mesure que les cellules invasives continuent de se fixer et d’occuper ce réseau d’électrodes au fil du temps, l’impédance électrique change en parallèle. Le système actuel comprend une plaque d’invasion et de migration cellulaire (CIM) de 16 puits avec deux chambres. L’instrument RTCA-DP (dual purpose) (appelé désormais analyseur de cellules à double usage) contient des capteurs pour la mesure d’impédance et un logiciel intégré pour analyser et traiter les données d’impédance. Les valeurs d’impédance au départ dépendent de la force ionique des milieux dans les puits et sont modifiées à mesure que les cellules se fixent aux électrodes. Les changements d’impédance dépendent du nombre de cellules, de leur morphologie et de la mesure dans laquelle les cellules se fixent aux électrodes. Une mesure des puits avec des milieux avant l’ajout des cellules est considérée comme le signal de fond. L’arrière-plan est soustrait des mesures d’impédance après avoir atteint l’équilibre avec des cellules se fixant et se propageant sur les électrodes. Un paramètre sans unité de l’état des cellules sur une électrode appelé indice de cellule (IC) est calculé comme suit: CI = (impédance après équilibre - impédance en l’absence de cellules) / valeur d’impédance nominale⁶. Lorsque les taux de migration de différentes lignées cellulaires sont comparés, l’IC Delta peut être utilisé pour comparer l’état des cellules, quelle que soit la différence d’attachement représentée dans les premières mesures.

Le nouveau réseau à trois chambres s’appuie sur la conception existante et utilise la chambre supérieure du système d’analyseur de cellules à double usage qui contient les électrodes. Les chambres intermédiaires et inférieures modifiées sont adaptées pour s’adapter à l’ensemble dans l’analyseur de cellules à double usage pour la mesure et l’analyse d’impédance à l’aide du logiciel intégré. Les deux avancées majeures que la nouvelle conception apporte par rapport à la plaque CIM à double chambre existante (appelée désormais plaque d’analyseur cellulaire) sont: i) la capacité de récupérer, puis d’analyser les sous-populations cellulaires invasives présentes dans les mélanges cellulaires hétérogènes et ii) la possibilité d’évaluer l’impact des facteurs sécrétés par les cellules stromales ou immunitaires co-cultivées sur l’invasion cellulaire (Figure 1).

Cette technologie peut être utile pour étudier les sous-populations de cellules ayant différentes capacités invasives. Cela comprend (a) les cellules cancéreuses invasives qui envahissent les tissus environnants ou les vaisseaux sanguins et lymphatiques ou extravasent sur les sites d’ensemencement métastatiques dans des organes distants, (b) les cellules du système immunitaire qui envahissent les tissus pour lutter contre les agents pathogènes ou les cellules malades, (c) les cellules endothéliales qui envahissent les tissus pour former de nouveaux vaisseaux sanguins lors de la réorganisation tissulaire ou de la cicatrisation des plaies, ainsi que (d) les cellules stromales du microenvironnement tumoral qui soutiennent et envahissent avec les cellules cancéreuses. L’approche permet l’inclusion de la diaphonie stromale qui peut moduler la motilité et l’invasion cellulaires. Les études de faisabilité présentées ici utilisent ce réseau modifié axé sur l’invasion des cellules cancéreuses et l’interaction avec le stroma comme système modèle, y compris l’invasion endothéliale en réponse aux signaux différentiels des cellules cancéreuses. L’approche peut être extrapolée pour isoler les cellules cancéreuses et d’autres types de cellules telles que les sous-populations de cellules immunitaires, les fibroblastes ou les cellules endothéliales. Nous avons testé des lignées cellulaires de cancer du sein établies invasives et non invasives comme preuve de principe. Nous avons également utilisé des cellules issues de l’invasion de xénogreffes dérivées de patients (PDX) en réponse à des cellules immunitaires de la moelle osseuse humaine afin de démontrer la faisabilité d’une utilisation future également dans des contextes de diagnostic clinique. Les PDX sont des tissus tumoraux de patients qui sont implantés dans un modèle de souris immunodéprimé ou humanisé pour permettre l’étude de la croissance, de la progression et des options de traitement pour le patient ^{d’origine 7,8}.

Protocole

L’étude a été examinée et considérée comme « exemptée » par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Georgetown (CISR no 2002-022). Des tissus de moelle osseuse fraîchement prélevés ont été prélevés à partir de filtres de collecte de moelle osseuse humaine sains mis au rebut qui avaient été anonymisés.

1. Nouvelle conception de la chambre (Figure 2)

1. Ouvrez une nouvelle plaque d’analyse de cellule à double chambre. Mettez de côté la chambre supérieure avec des électrodes.
2. À l’aide d’une fraiseuse, rasez 2 mm des puits inférieurs en forme de U de la plaque d’analyse de cellules.
3. Fixez une membrane en polyéthersulfone (PES) de 2 cm x 7 cm avec une taille de pore de 0,2 μm au fond des puits rasés à l’aide d’un adhésif uv. Prévoyez un temps de curation de 30 minutes pour vous assurer que la colle est complètement durcie et inerte.
4. À l’aide d’une fraiseuse, découpez deux fentes longitudinales (1,5 mm x 5,6 mm) le long des côtés pour s’enclencher dans les crêtes de la troisième chambre nouvellement fabriquée.
5. À l’aide d’une fraiseuse, créez une troisième chambre en polycarbonate qui reproduit les dimensions globales de la plaque d’analyse de cellule; 72 mm x 18 mm (Table des matériaux).
6. Créez des puits de 4,8 mm de profondeur et de 4,75 mm de diamètre pour reproduire la conception à 16 puits de la plaque d’analyse de cellules. Cela permet 90 μL de volume par puits.
7. Sur les côtés, créez deux crêtes triangulaires afin que la chambre se verrouille dans les fentes d’origine créées à l’étape 1.4. La partie horizontale du triangle mesure 1,5 mm, la verticale 1,4 mm et l’hypoténuse 2,052 mm.
8. Créez un bouton sur le côté court de 50,8 mm de diamètre et de 1,397 mm de hauteur pour l’insérer dans l’encoche de la plaque d’origine (Figure 2, milieu).
9. Utilisez une rondelle en caoutchouc de 0,9 mm d’épaisseur pour chaque puits afin de fournir un ajustement étanche.

2. Culture cellulaire (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblastes)

1. Lavez les cultures cellulaires adhérentes (~ 70% de confluence) avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Ajouter une solution de trypsine-EDTA à 0,05% pour enlever les cellules.
3. Neutraliser la solution de trypsine avec des milieux de culture cellulaire contenant du sérum et compter les cellules à l’aide d’une aliquote de la suspension cellulaire.
   REMARQUE : Les milieux de culture cellulaire spécifiques se trouvent dans le tableau 1.

3. Dissociation par xénogreffe dérivée du patient

1. Hacher un morceau de tumeur frais (1 cm²) en bouillie fine à l’aide d’un scalpel stérile.
2. Placer dans un tube conique de 50 mL avec 20 mL de milieu DMEM F12 complété par 3 mg/mL de trypsine et 2 mg/mL de collagénase.
3. Incuber dans un agitateur thermique (150 RPM) à 37 °C pendant 20 min.
4. Faire tourner le tube à 500 x g pendant 5 min; retirez le surnageant.
5. Ajouter 20 μL de DMEM F12 + 2% FBS pour laver les cellules; tourner à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Répétez le lavage deux fois de plus.
6. Remettez en suspension dans 1 mL de support PDX (tableau 1) pour compter les cellules.

4. Extraction des cellules de la moelle osseuse

1. Rincer le filtre de collecte de la moelle osseuse (BM) avec 25 mL de 1x PBS.
   REMARQUE: Dans cette étude, le PBS a été ajouté à un filtre de collecte BM usagé de l’hôpital pour collecter le BM restant dans le filtre.
2. Ajouter lentement le BM rincé à un tube conique de 50 mL avec 25 mL de milieu de gradient de densité, en prenant soin de garder les couches aussi séparées que possible.
3. Tourner à 800 x g pendant 20 min à 18 °C
4. Siphonnez les couches supérieures après centrifugation (graisse/plasma) et transférez 5 mL de la couche blanche au-dessus du milieu de gradient de densité qui contient les cellules BM dans un tube conique de 15 mL.
   REMARQUE: Alternativement, trempez une pipette de 5 mL dans la couche supérieure jusqu’à ce qu’elle touche la couche intermédiaire (BM) et pipettez la couche intermédiaire très lentement sans déplacer la pipette.
5. Remplissez le tube conique de 15 mL avec 1x PBS (~10 mL) et faites tourner à 300 x g pendant 15 min.
6. Retirez le surnageant; la pastille blanche restante est le BM.
7. Si des globules rouges sont observés dans la pastille, ajouter 5 mL de solution de lyse RBC (Table des matières) et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante (RT). Tourner à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
8. Ajouter 10 mL de 1x PBS pour laver les cellules, tourner à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Répétez la lyse RBC (étape 4.7) jusqu’à ce que la pastille soit blanche.

5. Ensemencement et assemblage des cellules

1. Placez les trois chambres stériles dans la hotte de culture tissulaire.
2. Placez le bouton sur le côté court de la chambre inférieure. Orientez la chambre inférieure de sorte que le bouton soit orienté vers l’expérimentateur.
3. Ajouter 30 000 à 50 000 cellules dans 90 μL de milieu à chaque puits de la chambre inférieure. Évitez de former des bulles. Ce sont les cellules stromales qui fourniront des facteurs sécrétés mais ne seront pas détectées par les électrodes de la chambre supérieure.
4. Utiliser des milieux supplémentés en sérum bovin fœtal à 5 % dans deux puits de chambre inférieure comme témoin positif de la motilité cellulaire. Utilisez un milieu supplémenté en sérum à 0 % comme témoin négatif.
5. Laissez la chambre inférieure avec les cellules reposer pendant 10-15 minutes dans le capot pour s’installer.
   REMARQUE: Cette étape est recommandée si les cellules adhèrent ou se développent en suspension.
6. Faites pivoter la chambre inférieure à 90° et placez la chambre moyenne sur le dessus de sorte que le bouton de la chambre inférieure glisse dans l’encoche de la chambre moyenne.
   REMARQUE: Le bouton de la chambre inférieure et le point bleu de la chambre centrale se trouvent aux extrémités opposées de l’assemblage.
7. Poussez verticalement vers le bas jusqu’à ce qu’un cliquetis se fasse entendre sur chacun des côtés longs de l’assemblage.
8. Ajouter 160 μL de milieu sans sérum à tous les puits de la chambre moyenne.
9. Assurez-vous qu’un ménisque en forme de dôme est visible après le remplissage des puits; sinon, ajustez le volume final en fonction de l’étalonnage de la pipette. Évitez de former des bulles.
10. Placez la chambre supérieure avec des électrodes tournées vers le bas sur la chambre du milieu en veillant à aligner les points bleus sur les chambres du milieu et du haut.
11. Poussez verticalement vers le bas jusqu’à ce qu’un cliquetis se fasse entendre sur chacun des côtés longs de l’assemblage.
12. Ajouter 25 à 50 μL de milieu sans sérum dans la chambre supérieure.
13. Montez l’ensemble sur l’analyseur de cellules à double usage dans l’incubateur de culture tissulaire et attendez 30 minutes avant de mesurer l’arrière-plan.
    REMARQUE: Ce temps est nécessaire pour équilibrer le tableau et peut être utilisé pour préparer les lignées cellulaires à ajouter à la chambre supérieure.
14. Mesurez l’arrière-plan (voir rubrique 6) et replacez l’assemblage dans la cagoule de culture tissulaire.
15. Ajouter 30 000 à 50 000 cellules dans 100 μL de milieux sans sérum à chaque puits de la chambre supérieure. Ce sont les cellules que l’électrode détectera une fois qu’elles migreront avec succès à travers la membrane.
    REMARQUE: Pour obtenir une réponse maximale, il est recommandé de cultiver des cellules dans des milieux sans sérum ou à faible teneur en sérum pendant 6 à 18 heures avant d’effectuer le test.
16. Laissez l’ensemble reposer dans le capot pendant 30 minutes avant de le monter sur l’analyseur de cellules à double usage pour la mesure de l’impédance.

6. Mesure de fond et d’impédance

1. Placez la matrice dans le berceau de l’analyseur de cellules à double usage.
2. Ouvrez le logiciel d’analyse de cellules et sélectionnez la station d’accueil à utiliser.
3. Cliquez sur l’onglet Message et assurez-vous qu’il indique Connexions OK pour vous assurer que le réseau est bien placé dans le berceau et que les électrodes sont bien alignées avec les capteurs.
4. Cliquez sur l’onglet Notes d’expérience et remplissez autant d’informations que possible sur l’expérience.
5. Cliquez sur l’onglet Mise en page et remplissez la description de la disposition du tableau.
6. Cliquez sur l’onglet Planification et ajoutez deux étapes dans le menu Étapes ; une étape d’arrière-plan (un balayage) et une étape de test avec 100 balayages - un balayage toutes les 15 minutes, totalisant 25 h.
7. Une fois que la matrice a été dans l’incubateur de l’analyseur de cellules à double usage pendant 30 minutes, cliquez sur le bouton Lecture pour démarrer la mesure en arrière-plan. Une fenêtre demandant de choisir le dossier pour enregistrer les données apparaîtra.
8. Une fois la mesure de fond effectuée, retirez le réseau du berceau et replacez-le dans la hotte de culture cellulaire.
9. Ajoutez des cellules à la chambre supérieure comme décrit à l’étape 5.13 et conservez l’assemblage dans la hotte de culture tissulaire pendant 30 minutes pour que les cellules se déposent.
10. Replacez le tableau dans l’analyseur de cellules à double usage et vérifiez l’onglet Message pour le message Connexions OK .
11. Cliquez sur le bouton Lecture pour lancer la mesure de l’impédance.
12. Cliquez sur l’onglet Tracé pour surveiller la progression du signal.
13. Si le point de terminaison est atteint avant 25 h, cliquez sur l’étape Abandonner dans le menu déroulant Exécuter .
14. Pour exporter des données, cliquez avec le bouton droit sur le graphique, choisissez Copier dans le format de liste, puis collez les données dans une feuille de calcul.
    Remarque : Les données peuvent être exportées en tant qu’index de cellule ou index de cellule delta. Les informations de graphique et/ou de mise en page peuvent également être choisies pour l’exportation.

7. Détachement et collecte de cellules

1. Surveillez le taux de migration en temps réel sur l’analyseur de cellules à double usage pour déterminer le point d’arrêt d’intérêt (6-18 h).
   REMARQUE: Le point d’arrêt dépend du taux d’invasion de la cellule et du moment où un signal d’invasion distinct du témoin négatif est atteint.
2. Une fois réalisé, démontez l’ensemble de l’analyseur de cellules à double usage et placez-le dans la hotte de culture tissulaire.
3. Préparer un nombre approprié de tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pour prélever les cellules dans les puits d’intérêt.
4. Placez l’assemblage dans un plat de 10 cm pour contenir les liquides lorsque les chambres se détachent.
5. Poussez les extrémités flexibles du côté long de la chambre centrale vers l’intérieur jusqu’à ce qu’un bruit de clic se fasse entendre.
6. Démontez la chambre supérieure et inversez-la dans un nouveau plat de 10 cm.
7. Utilisez un élévateur de cellules avec une lame de 13 mm pour recueillir les cellules de tous les puits présentant la même condition expérimentale (c.-à-d. type de cellule, traitement médicamenteux, etc.).
   REMARQUE : Concevez la configuration de manière à avoir au moins deux puits pour chaque condition expérimentale afin d’obtenir un changement statistiquement significatif par rapport aux témoins négatifs.
8. Rincez ou trempez la lame dans 1x solution saline tamponnée au phosphate pour recueillir les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
9. Faites tourner les cellules à 500 x g pendant 5 min.
10. Propager les cellules collectées (voir rubrique 8) ou effectuer une analyse du point final telle qu’un arn unicellulaire seq.
    REMARQUE: Pour les séquences d’ARN en vrac, utilisez un kit d’extraction d’ARN à faible nombre de cellules.

8.3D propagation et récupération des cellules

REMARQUE: En raison du petit nombre de cellules collectées, ensemencez les cellules en 3D à l’aide d’une matrice extracellulaire (ECM) pour améliorer la viabilité. Cela dit, la culture 2D est également une option à ce stade, surtout si les cellules utilisées proviennent de lignées cellulaires établies.

1. Décongeler une aliquote de la matrice de la membrane basale à 4 °C pendant la nuit. Gardez la matrice de la membrane basale sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
2. Ajouter 25 μL de matrice de membrane basale froide à la pastille de cellules vivantes recueillies et pipeter doucement de haut en bas pour mélanger. Évitez de former des bulles.
3. Ajouter le mélange de matrice de membrane cellulaire-basale au fond d’un petit puits de culture tissulaire (c.-à-d. dans une plaque de 96 puits), formant ainsi un dôme. Essayez de ne pas toucher les parois du puits. Incuber à 37 °C pendant 20 min avant d’ajouter doucement 100 μL de fluide goutte à goutte.
4. Pour récupérer les cellules, aspirez le milieu et ajoutez 100 μL de dispase à chaque puits.
5. Incuber à RT pendant 10 min, en pipetant de haut en bas de temps en temps.
6. Transférer les cellules et la matrice de la membrane basale dissoute dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Ajouter 1 mL de 1x PBS, tourner à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Répétez le lavage une fois.
7. Aspirer le surnageant. Divisez les cellules de la pastille ou effectuez une analyse des points de terminaison.

Résultats

En utilisant le réseau à trois chambres nouvellement conçu, l’invasion des cellules a été testée en présence ou en l’absence de cellules stromales telles que les fibroblastes. L’invasion cellulaire MDA-MB-231 a été renforcée lorsque des fibroblastes suisses 3T3 irradiés (souche J2) ont été ensemencés dans la chambre inférieure, permettant l’échange de facteurs entre les deux lignées cellulaires. Fait intéressant, l’invasion de MDA-MB-231 a augmenté lorsque le nombre de cellules 3T3-J2 a été...

Discussion

Nous avons modifié la conception d’un réseau à double chambre pour inclure une troisième chambre pour surveiller l’invasion cellulaire en temps réel en présence de cellules stromales. Nous avons observé des effets distincts des fibroblastes co-cultivés sur les cellules cancéreuses invasives et non invasives, ce qui indique que le réseau peut être utilisé pour distinguer les sous-populations de cellules cancéreuses qui répondent différemment aux facteurs produits par les cellules stromales co-cultivées...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25300-054
Adhesive	Norland Optical Adhesive	NOA63
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell lifter	Sarstedt	83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Thermofisher	12585-014
CIM-plate	Agilent	5665817001	Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130
Dispase	StemCell	7913
DMEM	Thermofisher	11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
HEPES	Thermofisher	15630106
Horse serum (HS)	Gibco	16050-122
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC)	LONZA (RRID:CVCL_2959)	C-2517A
HUVEC media	LONZA	CC-3162
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x)	Thermofisher	51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution	Sigma	C8052
J2 Fibroblasts	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel	Corning	354230	Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS)	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells	RRID:CVCL_0062
Milling machine			Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x)	Thermofisher	10010049
Polyethersulfone (PES) membrane	Sterlitech	PCTF029030
RBC lysis solution	Stemcell	7800
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004
RTCA DP analyzer	Agilent	3X16	Dual purpose cell analyzer
Trypsin	Sigma	T4799