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Résumé

Le protocole démontre ici que les vésicules extracellulaires peuvent être séparées de manière adéquate des milieux de culture cellulaire conditionnés en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures liées à la membrane lipidique de taille nanométrique qui sont libérées par toutes les cellules, sont présentes dans tous les biofluides et contiennent des protéines, des acides nucléiques et des lipides qui reflètent la cellule mère dont elles sont dérivées. La séparation appropriée des véhicules électriques des autres composants d’un échantillon permet de caractériser leur cargaison associée et donne un aperçu de leur potentiel en tant que communicateurs intercellulaires et biomarqueurs non invasifs pour de nombreuses maladies. Dans la présente étude, des VE dérivés d’oligodendrocytes ont été isolés à partir de milieux de culture cellulaire à l’aide d’une combinaison de techniques de pointe, y compris l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) pour séparer les VE des autres protéines extracellulaires et complexes protéiques. À l’aide de colonnes SEC disponibles dans le commerce, les VE ont été séparés des protéines extracellulaires libérées par les cellules d’oligodendrogliome humain dans des conditions de stress de contrôle et de réticulum endoplasmique (RE). Les marqueurs EV canoniques CD9, CD63 et CD81 ont été observés dans les fractions 1-4, mais pas dans les fractions 5-8. GM130, une protéine de l’appareil de Golgi, et la calnexine, une protéine intégrale du RE, ont été utilisés comme marqueurs EV négatifs, et n’ont été observés dans aucune fraction. De plus, en regroupant et en concentrant les fractions 1 à 4 en tant que fraction EV et les fractions 5 à 8 en tant que fraction protéique, l’expression de CD63, CD81 et CD9 dans la fraction EV a été observée. L’expression de GM130 ou de calnexine n’a été observée dans aucun des types de fraction. Les fractions regroupées des conditions de contrôle et de stress ER ont été visualisées par microscopie électronique à transmission et des vésicules ont été observées dans les fractions EV, mais pas dans les fractions protéiques. Les particules dans l’EV et les fractions protéiques des deux conditions ont également été quantifiées avec une analyse de suivi des nanoparticules. Ensemble, ces données démontrent que la SEC est une méthode efficace pour séparer les VE des milieux de culture cellulaire conditionnés.

Introduction

L’explosion de l’intérêt pour l’étude des vésicules extracellulaires (VE) s’est accompagnée de progrès majeurs dans les technologies et les techniques utilisées pour séparer et étudier ces particules hétérogènes de taille nanométrique. Depuis leur découverte il y a près de quatre décennies1,2, ces petites structures membraneuses contiennent des lipides, des acides nucléiques et des protéines bioactifs et jouent un rôle majeur dans la communication intercellulaire 3,4. Les VE sont libérés par tous les types de cellules et sont donc présents dans tous les liquides biologiques, y compris le plasma sanguin et le sérum, la salive et l’urine. Les VE dans ces fluides sont très prometteurs pour servir de biomarqueurs non invasifs pour diverses maladies, y compris les maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives, les cancers et les maladies auto-immunes 5,6,7. De plus, des études mécanistes in vitro peuvent être réalisées au moyen de techniques de culture cellulaire en séparant les VE libérés dans le milieu de culture 3,8,9.

Pour comprendre le rôle des VE dans la physiopathologie de la maladie, une séparation adéquate du liquide dans lequel ils se trouvent est primordiale. L’étalon-or pour la séparation des véhicules électriques a longtemps été l’ultracentrifugation différentielle (dUC)10, mais des techniques plus sophistiquées ont vu le jour pour obtenir une meilleure séparation des véhicules électriques des autres composants extracellulaires. Certaines de ces techniques comprennent les gradients de densité, la fraction d’écoulement en champ à flux asymétrique (A4F), la cytométrie en flux, l’immunocapture, la précipitation au polyéthylèneglycol et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC)11,12,13. Chaque technique a son propre ensemble d’avantages et d’inconvénients; cependant, il a été démontré que la SEC en particulier sépare assez efficacement les VE des fluides biologiques et des surnageants de culture cellulaire 8,14,15. SEC a également l’avantage supplémentaire d’être relativement simple et convivial.

La SEC est une méthode qui sépare les composants d’un fluide en fonction de leur taille. Avec cette technique, une colonne de résine (fabriquée en interne ou achetée dans le commerce) est utilisée pour fractionner un échantillon. Les petites particules dans l’échantillon sont piégées entre les billes dans la résine, tandis que les particules plus grosses sont capables de passer à travers la résine plus librement, et donc éluer plus tôt dans le processus. Parce que les VE sont plus grands en taille que de nombreuses protéines extracellulaires et agrégats de protéines, les VE traversent la colonne plus rapidement et éluent dans des fractions plus précoces que les protéines extracellulaires14.

Dans cet article sur les méthodes, l’utilisation de la SEC pour la séparation des VE des milieux de culture cellulaire (CCM) des oligodendrocytes humains dans des conditions de contrôle et de stress du réticulum endoplasmique (RE) est décrite. À l’aide de ce protocole, il est démontré que les VE séparés par cette technique se trouvent dans des fractions spécifiques qui peuvent être regroupées et concentrées pour la caractérisation en aval, et que les VE séparés sont dérivés de cellules et non d’une source exogène telle que le sérum bovin fœtal (FBS) utilisé pour compléter la CCM. La présence des marqueurs EV canoniques, CD63, CD81 et CD916,17,18,19 dans les fractions EV, et leur absence dans les fractions protéiques est démontrée par le Western blotting. En utilisant la microscopie électronique à transmission (MET), les VE sont visualisés et affichent la morphologie attendue et ne sont observés que dans la fraction EV. Les particules sont également comptées dans les fractions EV et protéique des conditions de contrainte témoin et ER, et un grand nombre de particules dans la plage de taille prévue de 50 à 200 nm de diamètre sont observées dans les échantillons EV. Ensemble, ces données appuient l’idée que la SEC est une méthode efficiente et efficace pour séparer les VE des milieux de culture cellulaire.

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Protocole

1. Préparation des tampons et des réactifs

REMARQUE: Fabriquez des réactifs de culture cellulaire dans la hotte de culture cellulaire pour maintenir la stérilité.

  1. Préparation de réactifs de culture cellulaire
    1. Préparer une glycémie DMEM normale à haute teneur en glucose en ajoutant 50 mL de FBS et 5 mL de pénicilline-streptocoque (Pen-Strep) dans 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose et conserver à 4 °C. Utilisez ce milieu pour cultiver et dilater des cellules.
    2. Préparer le DMEM à haute teneur en glucose appauvri en exosomes en ajoutant 50 mL de FBS appauvri en exosomes et 5 mL de Pen-Strep dans 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose et conserver à 4 °C. Utilisez ce milieu pour les traitements cellulaires avant l’isolement de la VE.
    3. Préparer la tunicamycine en ajoutant 10 mg de tunicamycine à 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Fabriquer des aliquotes de 50 μL dans des tubes de 0,2 mL et les conserver à -20 °C.
  2. Préparation des réactifs de séparation EV
    1. Préparer 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en ajoutant 9,89 g de poudre de PBS à 1 L d’eau désionisée (DI) dans une bouteille graduée de 1 L. Remuer la solution sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que le PBS se dissolve.
    2. Utilisez l’autoclave pour stériliser la verrerie avant d’ajouter du PBS. Mettez la verrerie dans une poubelle, fermez la porte et stérilisez pendant 30 min à 121 °C.
    3. À l’intérieur d’une armoire à flux laminaire, connectez un aspirateur au filtre de 0,22 μm et placez le filtre sur le dessus de la bouteille autoclavée. Versez lentement le PBS sur le filtre et recueillez le PBS filtré dans la bouteille autoclavée.
    4. Préparer de l’hydroxyde de sodium 0,5 M en ajoutant 9,99 g d’hydroxyde de sodium à 500 mL de 1x PBS dans une bouteille graduée de 500 mL. Remuer la solution sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que l’hydroxyde de sodium se dissolve dans le PBS, puis filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans une bouteille de 500 ml autoclavée.
    5. Préparer l’azoture de sodium à 0,05 % en ajoutant 0,25 g d’azoture de sodium à 500 mL de 1x PBS dans une bouteille graduée de 500 mL. Remuer la solution sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que l’azoture de sodium se dissolve dans le PBS, puis filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans une bouteille de 500 ml autoclavée.
  3. Préparation de réactifs d’isolement, de quantification et d’identification des protéines
    1. Préparer 100 mL de tampon de lyse RIPA en combinant 1 mL de 1 M Tris (pH 7,4), 1 mL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 %, 1 g de désoxycholate, 1 mL de NP-40 et 0,89 g de chlorure de sodium (NaCl). Porter le volume à 100 mL avec leH2Odistillé et conserver à 4 °C. Pour fabriquer la solution de RIPA plus phosphatase et inhibiteur de protéase, ajouter 10 μL de phosphatase et d’inhibiteur de protéase pour chaque 1 mL de tampon RIPA dans un tube de 15 mL et conserver la solution à 4 °C.
    2. Immédiatement avant utilisation, préparer le réactif de travail BCA en ajoutant 10 mL de réactif A et 200 μL de réactif B fournis par la trousse de dosage BCA dans un tube de 15 mL. Immédiatement avant utilisation, préparer le réactif de travail du dosage microBCA en ajoutant 25 parties de réactif A, 24 parties de réactif B et 1 partie de réactif C dans un tube de 15 mL.
    3. Préparer 10x tampon d’électrophorèse sur gel en ajoutant 30,3 g de Tris base, 144 g de glycine et 10 g de SDS dans 1 L d’eau DI. Conserver le tampon courant à 4 °C. Préparer 1x tampon de transfert en ajoutant 3,03 g de Tris base, 14,4 g de glycine et 200 ml de méthanol et ajuster le volume à 1 L avec de l’eau DI. Conserver le tampon de transfert à 4 °C.
    4. Préparer une solution saline tamponnée Tris avec Tween-20 (TBS-Tween) en ajoutant 2,4 g de Tris base, 8 g de NaCl et 1 mL de Tween-20 dans 1 L d’eau DI. Conservez l’interpolation TBS à 4 °C.
    5. Préparer une solution bloquante à 5 % en ajoutant 5 g de lait écrémé en poudre à 100 mL de TBS-Tween. Stockez le tampon de blocage à 4 °C.
    6. Immédiatement avant utilisation, préparer le substrat chimioluminescent en ajoutant 4 mL de solution de peroxyde et 4 mL de solution de luminol/amplificateur dans un tube de 15 mL et retourner doucement pour mélanger.

2. Culture et traitement des cellules

  1. Ensemencez deux flacons de culture cellulaire T175 contenant chacun 2,3 x 106 cellules d’oligodendrogliome humain (HOG). Porter le volume final de DMEM normal à haute teneur en glucose à 25 mL et incuber à 37 °C avec 5% de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire pendant 48 h.
  2. À la fin des 48 h, réchauffer le DMEM à haute teneur en glucose appauvri en exosomes dans un bain-marie à 37 °C. Pour le traitement, ajouter 25 μL de 10 mg/mL de tunicamycine à 25 mL de milieu appauvri en exosomes, concentration finale de 10 μg/mL de tunicamycine pour induire un stress ER. Pour le contrôle, ajouter 25 μL de DMSO à 25 mL de milieux appauvris en exosomes.
  3. Retirer et éliminer le DMEM normal à haute teneur en glucose des cellules et rincer doucement les cellules et la fiole avec 10 ml de 1x PBS. Aspirer et jeter PBS.
  4. Ajouter 25 mL de milieu témoin dans le témoin étiqueté et 25 mL de 10 μg/mL de tunicamycine dans le milieu dans le traitement étiqueté en flacon. Remettre les flacons dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 h.

3. Collecte et concentration de la CCM conditionnée (Figure 1)

  1. Placer le PBS dans un bain-marie à 37 °C. Observez les flacons sous un microscope composé avec objectif 10x et 100x. Prendre note de toute différence entre les flacons. Effectuer les étapes suivantes pour les flacons témoins et les flacons traités.
  2. Retirer le média de la fiole et le placer dans un tube de 50 mL. Centrifuger le tube à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL.
  3. Centrifuger le tube à 2 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 ml et le placer sur de la glace.
  4. Procurez-vous quatre unités d’ultrafiltration de coupure de 3 kDa de 15 mL et ajoutez 5 mL de PBS à chaque tube. Amorcez le filtre en centrifugeant les unités d’ultrafiltration à 4 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE: Des unités d’ultrafiltration de seuil de poids moléculaire de 3 kDa ont été utilisées dans le protocole actuel pour retenir toutes les protéines extracellulaires libérées par les cellules. Des unités d’ultrafiltration de coupure de plus grand poids moléculaire (p. ex. 30 kDa) fonctionneraient également avec ce protocole, mais les protéines extracellulaires inférieures à 30 kDa seraient filtrées et retirées des échantillons20,21.
  5. Retirez le PBS des unités d’ultrafiltration. Diviser le surnageant de chaque affection (témoin et tunicamycine traitée) en deux unités d’ultrafiltration chacune, soit environ 12,5 mL de milieu dans chacune.
  6. Centrifuger les tubes à 4 000 x g pendant 1 h 45 min à 4 °C, ou jusqu’à ce que le milieu concentré (appelé rétentat) de chaque unité d’ultrafiltration soit concentré à 250 μL ou moins.
  7. Transférer le rétentat des deux unités d’ultrafiltration de contrôle dans un tube microcentrifuge marqué de 1,5 mL. Transférer le rétentat des deux unités d’ultrafiltration traitées dans un autre tube microcentrifuge marqué de 1,5 mL.
  8. Mesurer le volume total du rétentat dans chaque tube de microcentrifugation à 500 μL. Si la teneur de l’échantillon est inférieure à 500 μL, ajouter 0,22 μm filtré 1x PBS jusqu’à ce que le volume final atteigne 500 μL. Placer les tubes dans un congélateur à -80 °C.

4. Collecte de cellules

  1. Placer la trypsine, le PBS et le DMEM appauvri en exosomes dans un bain-marie à 37 °C. Ajouter 7 ml de trypsine aux flacons témoins et traités et placer dans l’incubateur pendant 5 minutes.
  2. Voir au microscope pour voir si les cellules sont soulevées. Si les cellules ne sont pas soulevées, tapoter fermement la fiole contre la paume de la main pour déloger les cellules.
  3. Laver la fiole avec 7 ml de DMEM appauvri en exosomes. Recueillir la suspension cellulaire dans le ballon et la placer dans des tubes de 15 mL.
  4. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 500 x g à 4 °C. Retirer le surnageant et ajouter 5 mL de 1x PBS à la pastille de cellule. Mélanger doucement à pipette pour briser la pastille.
  5. Centrifuger les tubes à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et ajouter 200 μL de RIPA plus phosphatase et solution inhibitrice de protéase à la pastille cellulaire, pipette à mélanger.
  6. Transférer les cellules de la solution RIPA dans des tubes de 1,5 mL. Laissez les tubes reposer sur la glace pendant 5 min. Centrifuger les tubes à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  7. Transférer le surnageant dans de nouveaux tubes de 1,5 mL. Étiqueter les tubes avec l’état de traitement et la date. Placer les tubes dans un congélateur à -80 °C.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

5. Séparation des véhicules électriques par chromatographie d’exclusion de taille (figure 2)

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes deux fois, une fois pour le rétentat témoin et une fois pour le rétentat traité à la tunicamycine.
REMARQUE: Le PBS utilisé dans cette section est 0,22 μm filtré 1x PBS.

  1. Activez le collecteur automatique de fractions (AFC) et réglez les paramètres pour collecter huit fractions, 0,5 ml par fraction et le volume tampon (vide) par défaut.
    REMARQUE : Les conditions de fonctionnement de l’AFC sont les suivantes : volume colonne/lit = 10 mL; volume de vide = 2,70 mL; volume de rinçage = 15 mL; taille optimale de la fraction = 500 μL; tampon requis par essai = 65 mL; débit à 20 °C = 1,0 mL/min; Réutilisabilité de la colonne = cinq utilisations.
  2. Retirer la colonne (voir le tableau des matières) à 4 °C et laisser la colonne se réchauffer à température ambiante avant de commencer (généralement ~30 min).
  3. Retirer les échantillons de rétention du congélateur à -80 °C et les déposer sur de la glace pour les décongeler. En attendant, placez huit tubes étiquetés de 1,5 ml dans le carrousel AFC avec les couvercles orientés vers l’intérieur.
  4. Insérez la colonne dans l’AFC avec le code-barres face au lecteur. Démarrez la collecte en suivant les instructions à l’écran pour vérifier qu’il y a des tubes dans le carrousel et que le collecteur de déchets fonctionne correctement.
  5. Commencez à vider la colonne en ajoutant 15 ml de 1x PBS à la colonne une fois que le tampon de stockage est complètement absorbé dans la partie supérieure de la matrice de colonne. N’ajoutez pas de PBS trop tôt car cela diluerait le tampon de stockage et empêcherait un rinçage adéquat.
  6. Juste avant que la totalité des 15 mL de PBS ne soit absorbée par la matrice, cliquez sur OK pour arrêter le rinçage et retirer tout PBS résiduel du haut de la matrice colonne à l’aide d’une micropipette. Ne touchez pas à la matrice.
  7. Ajouter 500 μL d’échantillon au centre de la colonne. Cliquez sur OK pour commencer l’exécution. Regardez l’échantillon absorber dans la matrice et ajoutez rapidement 8 mL de PBS à la colonne immédiatement après l’absorption complète de l’échantillon.
  8. AFC dissipera automatiquement le volume de vide au centre du carrousel, puis collectera les huit fractions de 500 μL chacune. À la fin de la course, retirez les fractions du carrousel et placez-les sur la glace. Les fractions 1 à 4 contiennent des VE tandis que les fractions 5 à 8 contiennent des protéines extracellulaires. Supprimez le volume vide du centre du carrousel.
  9. Ajouter 10 mL de PBS à la colonne après le prélèvement des huit fractions pour laver tout échantillon résiduel de la colonne. Une fois que l’échantillon de rétention a été complètement rincé à travers la colonne, ajouter 15 mL de 1x PBS dans la colonne.
  10. Au fur et à mesure que le PBS final est absorbé par la matrice, ajouter 500 μL d’hydroxyde de sodium 0,5 M au centre de la matrice de la colonne. Au fur et à mesure que l’hydroxyde de sodium est absorbé, ajoutez 30 mL de 1x PBS à la colonne et laissez-la rincer.
  11. Si vous exécutez un autre échantillon, ajoutez huit tubes microcentrifugeuses étiquetés de 1,5 ml au carrousel et répétez les étapes 5.7 à 5.10.
  12. Une fois tous les exemples terminés, procédez comme suit pour conserver la colonne en vue d’une utilisation ultérieure. Après avoir rincé 30 mL de PBS dans la colonne comme indiqué à l’étape 5.10, ajouter 15 mL d’azoture de sodium à 0,05 % dans la colonne.
  13. Laisser environ 5 mL d’azoture de sodium sur le dessus de la matrice de colonne. Retirez la colonne de l’AFC et fixez les capuchons supérieur et inférieur. Replacez la colonne à 4 °C pour la stocker (la colonne peut être utilisée jusqu’à cinq fois).

6. Ultrafiltration des fractions EV et protéiques

  1. Obtenir deux unités d’ultrafiltration de coupure de 2 mL, 3 kDa par échantillon. Utilisez une unité pour concentrer les fractions EV (fractions 1-4), et l’autre pour concentrer les fractions protéiques (fractions 5-8). Chaque unité est composée de trois parties: cône, filtre et cylindre à écoulement; Étiquetez chaque partie correctement.
  2. Construire l’unité d’ultrafiltration et ajouter 1 mL de 0,22 μm filtré 1x PBS à la partie filtrante et le bouchon avec la pièce conique. Centrifuger l’unité d’ultrafiltration, côté cône vers le haut à 3 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
  3. Retirez le PBS filtré du cylindre à écoulement. Retournez l’unité d’ultrafiltration (côté cône vers le bas) et centrifugez pendant 2 min à 1 000 x g à 4 °C. Retirez tout PBS restant du cône.
  4. Ajouter les fractions appropriées (le volume total de 500 μL) à chaque unité d’ultrafiltration (le volume total sera de 2 mL). Colonnes de centrifugeuses coniques vers le haut pendant 1 h 45 min à 3 500 x g à 4 °C, ou jusqu’à ce que le taux de rétention soit à 100 μL.
  5. Retirez le cylindre à écoulement continu et jetez l’écoulement à travers. Retournez l’unité d’ultrafiltration (côté cône vers le bas) et centrifugez pendant 2 min à 1 000 x g à 4 °C.
  6. Transférer le rétentat dans le cône dans un tube microcentrifuge marqué de 1,5 mL et porter chaque volume d’échantillon à 150 μL avec 0,22 μm filtré 1x PBS. Placer les tubes dans un congélateur à -80 °C.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

7. Contrôle des médias

  1. Procurez-vous deux flacons de culture cellulaire T175. Étiqueter un témoin de fiole et l’autre traitement. DMEM chaud appauvri en exosomes à haute teneur en glucose dans un bain-marie à 37 °C.
  2. Ajouter 25 μL de solution mère de tunicamycine (10 mg/mL) à 25 mL de milieu et mettre dans le traitement étiqueté en flacon. Ajouter 25 μL de DMSO à 25 mL de milieu et mettre dans le témoin étiqueté en flacon. Conservez les flacons dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 h.
  3. Recueillir les milieux et les traiter pour séparer les véhicules électriques comme indiqué aux étapes 3.2 à 3.8. Par la suite, effectuez toutes les étapes décrites aux sections 5 et 6.

8. Western blot

  1. Quantification des protéines à partir de lysats cellulaires et de fractions protéiques avec le dosage BCA
    REMARQUE : La quantification des protéines à partir d’échantillons témoins et d’échantillons traités à la tunicamycine est effectuée selon les étapes suivantes.
    1. Décongeler les cellules lysées et les fractions protéiques sur la glace. Faire trois tubes de dilution pour chaque échantillon; 1:2, 1:10 et 1:100.
    2. Charger en triple sur une plaque d’essai à fond clair de 96 puits, 25 μL d’étalons protéiques d’albumine sérique bovine (BSA) et 25 μL de chaque dilution de l’échantillon. Ajouter 200 μL de réactif fonctionnel à chaque puits contenant l’étalon ou l’échantillon, à l’aide d’une pipette multicanal.
    3. Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min, puis lire la plaque avec un lecteur de plaque à une absorbance de 562 nm. Calculer la concentration en protéines dans chaque échantillon et déterminer le volume d’échantillon nécessaire pour obtenir 20 μg de protéines pour les lysats cellulaires et 15 μg de protéines pour les fractions protéiques.
  2. Quantification des protéines à partir de fractions EV avec dosage microBCA
    1. Décongeler des échantillons de VE sur la glace. Faire deux dilutions pour chaque échantillon : 1:50 et 1:100.
    2. Charger en trois exemplaires sur une plaque d’essai à fond clair de 96 puits, 100 μL d’étalons de protéines BSA et 100 μL de chaque dilution d’échantillon. Ajouter 100 μL de réactif de travail microBCA à chaque puits contenant un étalon ou un échantillon, à l’aide d’une pipette multicanal.
    3. Incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h, puis lire la plaque avec un lecteur de plaque à une absorbance de 562 nm. Calculer la concentration en protéines dans chaque échantillon et déterminer le volume d’échantillon nécessaire pour obtenir 15 μg de protéines pour les fractions EV.
  3. Western blotting
    REMARQUE : Le protocole de transfert Western a été exécuté de la même manière que celui décrit aupoint 22 et modifié comme indiqué ci-dessous.
    1. Fabriquez des gels de polyacrylamide à 10 % avec un kit de fabrication de gel, en suivant les instructions du fabricant.
    2. Pour l’électrophorèse sur gel, préparer des échantillons de lysat cellulaire en combinant dans un tube de 1,5 mL, le volume de lysat cellulaire nécessaire pour 20 μg de protéines, 5 μL de tampon Laemmli 4x et le volume de tampon RIPA nécessaire pour porter le volume total à 20 μL.
    3. Préparer les échantillons de VE et de fraction protéique en combinant dans un tube de 1,5 mL le volume d’échantillon nécessaire pour 15 μg de protéines, 5 μL de tampon Laemmli 4x et tampon RIPA jusqu’à un volume de 20 μL.
    4. Préparer les échantillons de contrôle du milieu en combinant dans un tube de 1,5 mL 15 μL d’échantillon et 5 μL de tampon Laemmli 4x.
      REMARQUE: Selon les anticorps à utiliser, le tampon Laemmli peut ou non avoir besoin de contenir un agent réducteur, tel que 50 mM dithiothréitol (DTT).
    5. Faire bouillir tous les échantillons à 95 °C pendant 5 min, transférer les échantillons dans de la glace pour refroidir et centrifuger brièvement pendant 30 s à 10 000 x g, puis remettre les échantillons dans de la glace.
    6. Ajouter des gels au réservoir d’électrophorèse et ajouter 1x tampon d’électrophorèse sur gel. Charge 15 μL d’échelle protéique et 20 μL d’échantillon. Faites fonctionner le gel à 200 V pendant 30-50 minutes, ou jusqu’à ce que les échantillons aient atteint le fond du gel, juste avant l’écoulement.
    7. Transférer la protéine sur une membrane PVDF avec 1x tampon de transfert à 4 °C pendant 30 min à 100 V, ou jusqu’à ce que le transfert soit terminé. La figure supplémentaire 1, la figure supplémentaire 2 et la figure supplémentaire 3 montrent des images sans taches de chaque transfert une fois le transfert terminé.
    8. Bloquer la membrane dans du lait 5 %, TBS-Tween pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur. Incuber la membrane dans une solution d’anticorps primaires pendant une nuit sur un agitateur à 4 °C. Voir le tableau 1 pour obtenir des renseignements sur la dilution des anticorps.
    9. Le lendemain, retirez l’anticorps primaire et lavez la membrane 3x avec TBS-Tween pendant 5 min chacun à température ambiante sur un agitateur.
    10. Préparer les anticorps secondaires appropriés dans le lait à 5 % et le TBS-Tween. Voir le tableau 1 pour les informations sur la dilution. Ajouter l’anticorps secondaire à la membrane et incuber sur un agitateur à température ambiante pendant 1 h, puis laver 3x avec TBS-Tween pendant 5 min chacun à température ambiante sur un agitateur.
    11. Ajouter le substrat chimioluminescent à la membrane et incuber pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur. Tache d’image en utilisant l’analyse colorimétrique et chimiluminescente. La figure supplémentaire 4, la figure supplémentaire 5 et la figure supplémentaire 6 montrent des images non recadrées de chaque transfert.

9. Imagerie TEM

  1. Décharge luminescente23 grilles revêtues de carbone / formvar à maille pour éliminer les hydrocarbures et rendre les grilles hydrophiles.
  2. Ajouter 5 μL d’échantillon de VE ou de fraction protéique aux grilles. Incuber les grilles à température ambiante pendant 3-5 min.
  3. Éliminer l’excès de solution en évacuant avec du papier filtre. Lavez les grilles avec 5 μL d’eau nanopure et enlevez l’excès par évacuation.
  4. Appliquer 5 μL d’acétate d’uranyle aqueux à 1% et évacuer immédiatement. Laissez les grilles sécher. Grilles d’images à 120 kV sur un microscope électronique à transmission et capture des images avec une caméra à couple chargé.

10. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)

  1. Obtenir des échantillons de VE et de fraction protéique à partir de -80 °C et décongeler sur de la glace.
  2. Allumez l’ordinateur et l’instrument NTA. Ouvrez le logiciel NTA et il commencera à s’initialiser automatiquement.
  3. Sélectionnez la pompe appropriée qui contient de l’eau exempte de particules et cliquez sur Rincer l’instrument pour rincer la cellule. Pendant le rinçage, injecter 10 à 20 ml d’eau exempte de particules dans l’orifice d’injection situé à l’avant de l’instrument à l’aide d’une seringue et éviter les bulles d’air.
  4. L’écran de vérification de la qualité des cellules apparaîtra; cliquez sur OK et la vérification de la qualité de la cellule commencera. Une fois la vérification réussie, l’écran contextuel d’alignement automatique apparaîtra indiquant : Veuillez remplir la cellule avec une suspension d’alignement de 100 nm (dilution 1:250 000).
    1. Préparer la dilution 1 de la suspension d’alignement en ajoutant 10 mL d’eau exempte de particules et 10 μL de billes de polystyrène de 100 nm dans un tube (dilution 1:1 000). Retourner doucement pour mélanger. La dilution 1 a une durée de conservation de 2-3 jours à 4 °C.
    2. Créer la dilution 2 de la suspension d’alignement en ajoutant 20 mL d’eau exempte de particules et 80 μL de dilution 1 (1:1 000) dans un tube pour créer une dilution de 1:250 000. Retourner doucement le tube pour mélanger. La dilution 2 a une durée de conservation de 30 à 60 min à température ambiante.
  5. Remplir la cellule avec 2 mL de dilution 2 (1:250 000). Cliquez sur OK et le programme terminera l’alignement automatique (focus) et l’optimisation de la mise au point. L’onglet d’analyse s’ouvre en créant un profil qui fournit des résultats de la propreté et de la symétrie de la cellule de mesure dans une parabole. Un écran pop-up indiquant: View Video Microscope est maintenant prêt pour les expériences, apparaîtra; cliquez sur OK et le programme retournera à l’onglet de vérification de cellule.
  6. Rincez les billes de polystyrène de la cellule en injectant de l’eau sans particules dans l’orifice d’injection pour laver la cellule. Continuez à laver jusqu’à ce que le nombre de particules détectées se situe entre 0 et 10 (généralement entre 5 et 10 mL). Ajouter 1 mL de PBS filtré de 0,22 μm pour amorcer la cellule pour le premier échantillon.
  7. Diluer le premier échantillon avec du PBS filtré à 0,22 μm (commencer par une dilution de 1:1000) et entrer le facteur de dilution dans le programme. Insérez 1 mL d’échantillon dans la cellule et attendez 5 minutes que le mouvement des particules ralentisse, car elles se déplaceront initialement très rapidement sur l’écran. Réglez la sensibilité et l’obturateur sur 75,0 et 100, respectivement.
  8. Le nombre de particules détectées pour une dilution idéale de l’échantillon est de 50 à 200 particules. Si moins de 50 ou plus de 200 particules sont déclarées, ajuster la dilution de l’échantillon. Si une nouvelle dilution est nécessaire, laver la cellule avec de l’eau exempte de particules jusqu’à ce qu’il y ait 0-10 particules détectées. Répéter l’ajout de l’échantillon dilué et le lavage jusqu’à ce que la dilution idéale soit trouvée.
  9. Vérifiez les 11 positions de caméra pour visualiser que le mouvement des particules a ralenti et assurez-vous que le nombre de particules détectées est similaire entre toutes les positions de la caméra. Si le nombre de particules varie considérablement d’une position de caméra à l’autre, ajoutez un échantillon supplémentaire.
  10. Cliquez sur l’onglet Mesure et exécutez l’acquisition vidéo. Sous l’onglet Acquisition vidéo, entrez un nom personnalisé pour l’échantillon et identifiez un emplacement sûr. Cochez les cases d’enregistrement automatique.txt et d’enregistrement automatique.pdf pour enregistrer les données.
  11. Réglez la température à 25 °C, cliquez sur 488 nm pour régler le laser, puis cliquez sur 11 pour les positions de la caméra. Cliquez sur OK pour exécuter la collecte de données. Le programme commencera à analyser le nombre et la taille des particules dans les 11 positions. Sous l’onglet Analyse, un graphique à barres apparaîtra avec le diamètre/nm sur l’axe des x et les particules/ml sur l’axe des y.
  12. Une fois les données collectées, un écran contextuel intitulé Vue d’ensemble des positions apparaîtra fournissant des données pour chacune des 11 positions. Si plus de deux positions sont retirées de l’analyse, répétez la procédure avec plus d’échantillon. Sinon, cliquez sur le bouton Continuer . Un fichier PDF et txt contenant les résultats s’ouvrira. Enregistrez les fichiers dans un emplacement sûr.
  13. Pour exécuter un autre exemple, accédez à l’onglet Vérification de cellule et répétez les étapes 10.6 à 10.12. Si c’est fait, laver la cellule avec de l’eau exempte de particules jusqu’à ce que le nombre de particules détectées soit de 0 à 10 (environ 5 à 10 mL). Rincez la cellule avec 1 mL de PBS filtré de 0,22 μm, fermez le programme et éteignez l’ordinateur.

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Résultats

Le transfert Western révèle une séparation adéquate des véhicules électriques et de la moelle caustique calcinée
Pour évaluer l’efficacité de la SEC pour séparer les VE des milieux de culture cellulaire, un transfert Western a été effectué en utilisant chaque fraction individuelle des échantillons témoins pour sonder l’expression des trois marqueurs VE canoniques, CD9, CD63 et CD81, ainsi que GM130 et calnexine18, qui ont été utilisés comme témoins négat...

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Discussion

SEC est une méthode conviviale pour séparer adéquatement les véhicules électriques des CCM conditionnés. Afin d’isoler spécifiquement les VE dérivés de cellules, il faut tenir compte d’un examen attentif du type de CCM et de ses suppléments. De nombreux milieux de culture cellulaire doivent être complétés par du FBS, qui contient des VE dérivés de l’animal chez lequel le sérum a été récolté. Ces VE sériques peuvent saturer et masquer tout signal produit par les VE dérivés de cellules en cultu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Penn State Behrend et la Hamot Health Foundation pour leur financement, ainsi que le Penn State Microscopy Facility à University Park, en Pennsylvanie.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolVWR97064-588
4X Laemmli Sample BufferBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membraneSigma-AldrichUFC2003243 kDa cutoff
Ammonium PersulfateSigma-AldrichA3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked AntibodyCell Signaling Technology7074V1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibodyAbcam ab225951:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal AntibodyBioLegend3121021:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi MarkerAbcamab526491:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7076V1:1000 Dilution
Automatic Fraction CollectorIzon Science
BCA assay KitBio-Rad
CCD cameraGatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti HumanBD5560191:1000 Dilution
CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture FlasksGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
dithiothreitolSigma3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodiumCytivaSH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium gradeVWR97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depletedThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Great Value Nonfat Dry MilkAmazonB076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell LineSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass platesBioRad1653310with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short platesBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicillin-Streptomycin,SolutionSigma-AldrichP4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and ReagentsThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranesThermo Scientific88518
Pierce Western Blotting Filter PaperThermo Scientific84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 dilution
Slodium hydroxideSigma-AldrichSX0603
Sodium azideFisher ScientificBP922I-500
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pelletsSigma-Aldrich75746-1KG
TetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%BioRad1610183
Transmission Electron MicroscopeFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesiumCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View softwareAnalytikNTA software

Références

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