Imagerie biomoléculaire de l’absorption cellulaire de nanoparticules à l’aide de la microscopie optique multimodale non linéaire

Résumé

Cet article présente l’intégration d’un module de focalisation spectrale et d’un laser à impulsions à double sortie, permettant une imagerie hyperspectrale rapide des nanoparticules d’or et des cellules cancéreuses. Ce travail vise à démontrer les détails des techniques optiques non linéaires multimodales sur un microscope à balayage laser standard.

Résumé

Il est essentiel de sonder les nanoparticules d’or (AuNP) dans les systèmes vivants pour révéler l’interaction entre les AuNP et les tissus biologiques. De plus, en intégrant des signaux optiques non linéaires tels que la diffusion Raman stimulée (SRS), la fluorescence excitée à deux photons (TPEF) et l’absorption transitoire (TA) dans une plate-forme d’imagerie, il peut être utilisé pour révéler le contraste biomoléculaire des structures cellulaires et des AuNP de manière multimodale. Cet article présente une microscopie optique multimodale non linéaire et l’applique pour effectuer une imagerie chimiquement spécifique des AuNP dans les cellules cancéreuses. Cette plate-forme d’imagerie fournit une nouvelle approche pour développer des AuNP fonctionnalisés plus efficaces et déterminer s’ils se trouvent dans les systèmes vasculaires entourant les espaces tumoraux, péricellulaires ou cellulaires.

Introduction

Les nanoparticules d’or (AuNP) ont montré un grand potentiel en tant que sondes d’imagerie biocompatibles, par exemple, en tant que substrats efficaces de spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS) dans diverses applications biomédicales. Les principales applications comprennent des domaines tels que la biodétection, la bioimagerie, les spectroscopies améliorées en surface et la thérapie photothermique pour le traitement du cancer¹. En outre, l’étude des AuNP dans les systèmes vivants est cruciale pour évaluer et comprendre l’interaction entre les AuNP et les systèmes biologiques. Il existe diverses techniques analytiques, y compris la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)², la spectrométrie de masse à couplage inductif par ablation laser (LA-ICP-MS⁾³ et l’imagerie par résonance magnétique (IRM)⁴ qui ont été utilisées avec succès pour étudier la distribution des AuNP dans les tissus. Néanmoins, ces méthodes présentent plusieurs inconvénients tels que le fait d’être chronophages et impliquant une préparation d’échantillons complexe³, nécessitant de longs temps d’acquisition, ou l’absence de résolution spatiale submicronique ^2,4.

Par rapport aux techniques d’imagerie conventionnelles, la microscopie optique non linéaire offre plusieurs avantages pour sonder les cellules vivantes et les AuNP : La microscopie optique non linéaire atteint une profondeur d’imagerie plus profonde et offre une capacité intrinsèque de section optique 3D avec l’utilisation de lasers ultrarapides proches de l’IR. Grâce à l’amélioration significative de la vitesse d’imagerie et de la sensibilité de détection, il a été démontré que la fluorescence excitée à deux photons (TPEF)^5,6,7 et la microscopie de deuxième génération harmonique (SHG)8,9,10 améliorent encore l’imagerie non invasive des biomolécules endogènes dans les cellules et les tissus vivants. De plus, en utilisant de nouvelles techniques optiques non linéaires pompe-sonde telles que l’absorption transitoire (TA)11,12,13,14 et la diffusion Raman stimulée (SRS)^15,16,17,18, il est possible d’obtenir un contraste biochimique sans marquage des structures cellulaires et des AuNP. La visualisation des AuNP sans l’utilisation d’étiquettes extrinsèques est d’une grande importance car les perturbations chimiques des nanoparticules modifieront leurs propriétés physiques et donc leur absorption dans les cellules.

Ce protocole présente la mise en œuvre d’un module SF-TRU (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) pour un laser à impulsions à double longueur d’onde, permettant une imagerie multimodale rapide des AuNP et des cellules cancéreuses. Ce travail vise à démontrer les détails des techniques intégrées TPEF, TA et SRS sur un microscope à balayage laser.

Protocole

1. Mise en marche du système laser

1. Allumez le système de verrouillage et sélectionnez le laser à bras avant de démarrer le système.
2. Allumez le PC avec le logiciel pour contrôler le laser femtoseconde à double sortie.
3. Charger le logiciel pour le laser femtoseconde à double sortie; Ce logiciel permet d’allumer et d’éteindre le laser et contrôle directement la longueur d’onde du faisceau de pompe.
4. Activez l’émission laser en maintenant l’icône d’alimentation enfoncée pour un compte de 3.
5. Attendez que le laser se soit réchauffé et que la lumière prête pour le laser soit allumée en vert dans le logiciel.
6. La longueur d’onde du faisceau de pompe est directement contrôlée par le logiciel; Cela peut aller de 680 à 1 300 nm. Pour l’imagerie cellulaire dans la région vibratoire Raman C-H, sélectionnez 802 nm.
7. Ouvrez les volets du faisceau de pompe accordable et du faisceau de Stokes de 1 045 nm en maintenant les images d’ouverture enfoncées pendant 3 s.
   ATTENTION: Guide de sécurité laser Le laser femtoseconde à double sortie est un laser infrarouge pulsé de classe IV et peut causer des dommages permanents à la vue. Par conséquent, toutes les règles locales de sécurité laser doivent être suivies lors de l’exécution de cette procédure: (i) Seuls les utilisateurs autorisés qui ont reçu une formation sur la sécurité laser peuvent effectuer la procédure. (ii) L’accès au laboratoire se fait par carte magnétique munie d’un verrouillage sur la porte de la salle. (iii) Pendant la majeure partie de l’opération, les faisceaux laser sont entièrement fermés. (iv) Lorsque le faisceau laser est exposé, des lunettes de sécurité laser doivent être portées (utilisez les lunettes de sécurité laser LG9, qui bloquent OD 7+ de la pompe et des faisceaux de Stokes).

2. Activation de l’unité de synchronisation et de recombinaison de focalisation spectrale (SF-TRU)

1. Chargez le logiciel ATM sur le même PC avec le logiciel laser, qui contrôle les étages de retard et les atténuateurs laser dans l’unité SF-TRU.
   REMARQUE : Cette unité est chargée de s’assurer que la pompe et les poutres de Stokes se chevauchent spatialement, de contrôler la dispersion dans la pompe et les poutres de Stokes et de contrôler le délai entre la pompe et les poutres de Stokes. La polarisation des faisceaux de pompe et de Stokes est verticale. Notez que chaque faisceau est équipé d’une plaque demi-onde pour contrôler indépendamment les polarisations avant de quitter le SF-TRU.
2. Assurez-vous que la pompe et les lasers Stokes sont atténués à <10 % (pompe) et <15 % (faisceaux Stokes). Si les faisceaux ne sont pas atténués, la puissance du laser peut endommager le système et brûler des échantillons biologiques.
3. Pour l’imagerie cellulaire, réglez les réglages laser optimaux sur 6 % (pompe) et 10 % (Stokes), ce qui correspond à 12 mW et 30 mW à l’échantillon.
4. Le SF-TRU dispose de deux réglages : le mode femtoseconde (fs) et le mode picoseconde (ps).
5. Pour le mode fs, appuyez sur les boutons de chaque côté de la boîte (cela supprime les réseaux de dispersion du trajet du faisceau).
6. Pour le mode ps, retirez les boutons de chaque côté de la boîte (cela place les réseaux de dispersion dans le trajet du faisceau).
7. Pour l’imagerie hyperspectrale, sélectionnez le mode ps.
8. Assurez-vous que l’étage de retard est dans la bonne position pour que la pompe et les faisceaux de Stokes soient chevauchés temporellement pour l’imagerie C-H sur ce système.
9. S’assurer que les paramètres de dispersion de la pompe et du faisceau de Stokes sont corrects; pour une pompe de 802 nm, c’est 5 mm pour le faisceau de pompe et 30 mm pour le faisceau de Stokes.

3. Modulation du faisceau de Stokes pour l’imagerie SRS

1. Pour la détection SRS, modulez l’intensité du faisceau de Stokes.
2. Allumez le générateur de signaux pour la modulation du faisceau.
3. Rappelez les paramètres précédents, qui sont les suivants :
   SORTIE 1: Onde carrée: Fréquence = 19,5 MHz, Amplitude = 1,4 V.
   SORTIE 2: Onde carrée: Fréquence = 19,5 MHz, Amplitude = 300 mV.
4. Activez les sorties 1 et 2.
5. Connectez la sortie 1 à un amplificateur pour l’EOM dans le boîtier SF-TRU via un câble BNC.
6. Connectez la sortie 2 à l’amplificateur de verrouillage utilisé pour la détection SRS via un câble BNC.
7. Allumez l’alimentation de l’amplificateur sur le portique.

4. Allumage de l’amplificateur de verrouillage

1. Pour l’imagerie SRS, utilisez le module de détection SRS qui comprend une photodiode de grande surface et un amplificateur de verrouillage spécialement conçu.
2. Allumez l’alimentation de l’amplificateur de verrouillage sur le portique.
3. Chargez le logiciel de l’amplificateur de verrouillage « Module de détection SRS » sur le PC.
4. Dans le logiciel, choisissez les paramètres suivants : Phase = 0°, Décalage = -80 mW, Gain = 58 dB.
5. Sélectionnez la constante de temps d’intégration de l’amplificateur de verrouillage dans le logiciel : pour l’imagerie cellulaire, la constante de temps de 2 μs donne des images de bonne qualité.

5. Fonctionnement du microscope à balayage laser

1. Allumez les prises de tous les équipements à l’exception du boîtier de télécommande. Attendez que la veille soit allumée sur le boîtier de commande situé sur le dessus du portique.
2. Allumez le boîtier de télécommande sur le portique et allumez à l’arrière du boîtier. Attendez que le voyant de la télécommande devienne bleu (sur le boîtier de commande) et appuyez sur Démarrer l’opération.
3. Allumez le PC du microscope à balayage laser.
4. Exécutez le logiciel du microscope confocal.
5. Vérifiez le trajet lumineux du microscope via le logiciel informatique.
   NOTE: Certaines modifications ont été apportées au microscope pour le rendre adapté à l’imagerie SRS: (i) Dans le trajet du faisceau, un passage court de 775 nm a été ajouté à la roue à filtre où les faisceaux laser pénètrent dans l’unité de balayage, cela peut être sélectionné dans l’onglet Lightpath du logiciel informatique. ii) Au lieu d’utiliser les PMT intégrés du microscope confocal pour la détection, un détecteur sur mesure a été ajouté au trajet de la lumière transmise, ce qui permet à la fois la détection SRS et CARS. (iii) Les sorties de ces détecteurs sont connectées au boîtier analogique sur le portique. Le signal CARS du PMT est connecté via un câble BNC au CD1 et le signal SRS de l’amplificateur de verrouillage est connecté via un câble BNC au CD2.
6. Contrôlez la mise au point via l’écran tactile ou les boutons de la télécommande ou le logiciel informatique.
7. Sélectionnez les paramètres d’image souhaités dans le logiciel; Cela inclut le zoom, la taille de l’image en pixels et le temps d’arrêt des pixels.
8. Assurez-vous que la vitesse d’imagerie (temps de séjour des pixels) est supérieure au temps d’intégration défini dans le logiciel d’amplificateur de verrouillage.
   REMARQUE : Un objectif d’immersion dans l’eau NA 1.2 a été utilisé pour l’imagerie.

6. Montage d’un échantillon au microscope

1. Préparer les échantillons de cellules pour l’imagerie comme suit.
   1. Culture de cellules de carcinome mammaire de souris 4T1 dans RPMI-1640 supplémentée avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Changez le milieu tous les 2 jours et faites passer les cellules à 70%-80% de confluence.
      NOTE: Les passages 8 à 10 ont été utilisés tout au long des expériences décrites ici.
   2. Pour les expériences d’imagerie, incuber 1 x 10 5 cellules sur des lamelles de couverture carrées pendant 24 h à 37 °C,⁵ % de CO₂. Ensuite, laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée et incuber avec des nanoparticules d’or (dilution 1:100 dans un milieu de culture cellulaire, concentration mère: 2,3 x 10 10 particules / mL, diamètre:⁶⁰ nm) pendant 4 h.
   3. Avant l’imagerie, laver les cellules avec du PBS glacé et les fixer avec 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante (RT). Lavez les cellules avec PBS 3x, puis montez-les entre deux lamelles de couverture pour l’imagerie.
2. Placez une gouttelette d’eau distillée sur l’objectif d’immersion dans l’eau qui concentre les faisceaux laser sur l’échantillon entre l’objectif et l’échantillon. Ensuite, placez l’échantillon sur la platine du microscope.
3. Un condenseur avec NA 1.4 recueille la lumière propagée vers l’avant. Appliquez une gouttelette d’eau entre le condenseur et l’échantillon pour l’imagerie. Ajustez la hauteur du condenseur à environ 1 mm au-dessus de l’échantillon pour recueillir le maximum de lumière.
4. Le détecteur SRS est sur un support mobile, ce qui lui permet d’entrer et de sortir de la voie optique de collecte. Afin de se concentrer sur l’échantillon à l’aide de la lumière blanche, déplacez le détecteur SRS hors du trajet du faisceau.
5. Replacez le détecteur sur le trajet du faisceau, prêt pour l’imagerie SRS.

7. Modification du décalage Raman et collecte d’une pile de données hyperspectrales

REMARQUE: Le décalage Raman auquel l’imagerie a lieu dépend de la position de l’étage de retard dans le boîtier SF-TRU et de la longueur d’onde du faisceau de pompe du système laser.

1. Pour les changements importants dans le décalage Raman, modifiez la longueur d’onde du laser. Par exemple, pour l’imagerie des vibrations CH comprises entre 2 800 et 3 100 cm-1, sélectionnez 802 nm, tandis que, pour l’imagerie autour de 1 600 ^cm-1 pour le pic amide I, sélectionnez le faisceau de pompe à 898 nm. Ajustez cela via le logiciel.
2. Pour obtenir de petits ajustements dans le changement Raman, scannez l’étage de retard dans l’unité SF-TRU.
3. Le SF-TRU donne les positions de l’étage de retard en millimètres (mm). Pour convertir la position de l’étage de retard de mm à ^cm-1, effectuez le balayage hyperspectral d’étalonnage à l’aide d’un échantillon de billes de polystyrène et comparez les positions des pics trouvées dans le balayage d’étalonnage avec celles prises sur une configuration Raman spontanée. Cela fournira une équation linéaire, qui convertit la position de l’étage de retard en mm en décalage Raman en ^cm-1.
4. Pour générer un balayage hyperspectral, prenez une série chronologique d’images à différentes positions d’étape de retard.
5. Pour synchroniser l’acquisition d’images et le mouvement de l’étage de retard, utilisez l’unité analogique pour envoyer et recevoir des signaux TTL vers et depuis le système SF-TRU.
   REMARQUE: Pour ce faire, le boîtier analogique dispose des connexions suivantes: (i) TRIG OUT VD1 - il est connecté au SF-TRU via un BNC et envoie un signal TTL pour indiquer à l’étage de retard de se déplacer par incrément +1. (ii) TRIG In 1 : ici, un signal est reçu via BNC lorsque l’étage de retard a terminé son mouvement, et il est utilisé pour déclencher l’image suivante dans la série chronologique.
6. Pour l’ensemble de données hyperspectrales, sélectionnez les paramètres suivants dans le logiciel de microscope confocal :
   1. Dans l’onglet Déclencheur, sélectionnez Démarrer par déclencheur TTL (activé) et Déclencheur (chaque image).
   2. Dans l’onglet Série , définissez la série chronologique ON et la série z OFF.
   3. Définissez le nombre d’images dans la série chronologique pour qu’il corresponde au nombre d’étapes dans le logiciel ATM (101 étapes sont utilisées ici).
7. Dans le logiciel ATM, accédez à l’onglet Exécuter .
   1. Réglez les positions de l’étage de retard en millimètres pour le début et l’arrêt du balayage hyperspectral. Pour la région CH à nombre d’onde élevé, utilisez la position de départ = 90,25 mm et la position d’arrêt = 92,25 mm.
   2. Assurez-vous que le nombre d’étapes correspond au nombre d’images dans le logiciel du microscope confocal.
8. Après avoir vérifié les paramètres corrects, démarrez d’abord la pile hyperspectrale dans le logiciel de microscope confocal. Allez dans Acquérir et cliquez sur Démarrer l’analyse. Ensuite, dans le logiciel ATM, cliquez sur Démarrer. Cela lance la collecte d’une série d’images, avec des augmentations incrémentielles de la position de l’étage de retard entre les positions de départ et d’arrêt sélectionnées
9. Exportez la série d’images hyperspectrales sous forme de fichier .tif multi-images et utilisez un logiciel approprié pour effectuer l’étalonnage.
10. Une fois l’étalonnage terminé, utilisez l’équation d’étalonnage linéaire pour convertir la position de l’étage de retard en décalages Raman.
11. Pour passer de l’imagerie dans la région vibratoire CH (2 800–3 100 cm-1) à la région vibratoire amide I 1 500–1 700 ^cm-1), procédez comme suit.
    1. Changez la longueur d’onde de la pompe dans le logiciel laser de 802 nm à 898 nm.
    2. Modifiez le paramètre de dispersion de Stokes dans le logiciel ATM de 30 mm à 5 mm.
    3. Effectuez un petit réglage du miroir dans la voie de dispersion du faisceau de pompe à l’intérieur du boîtier SF-TRU. Cela se fait en ajustant le bouton inférieur sur le support de miroir, ce qui modifie l’angle du miroir d’une quantité incrémentielle.
    4. Lors de l’exécution d’un balayage hyperspectral sur la région amide I, réglez les positions de départ et d’arrêt dans le logiciel ATM sur 89 et 91 mm, respectivement
       ATTENTION: Des lunettes de sécurité laser doivent être portées pour cette étape car le faisceau laser sera exposé.

Résultats

Le module SF-TRU (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) est introduit entre le laser femtoseconde à double sortie et le microscope à balayage laser modifié. Le système laser ultrarapide accordable utilisé dans cette étude dispose de deux ports de sortie délivrant un faisceau à une longueur d’onde fixe de 1 045 nm et l’autre faisceau accordable dans la plage de 680 à 1 300 nm. Un schéma détaillé du module SF-TRU et de la plateforme d’imagerie multimodale est illustré à la

Discussion

Cette étude a présenté la combinaison du module SF-TRU et du système laser ultrarapide à double sortie démontrée ses applications pour la microspectroscopie multimodale. Grâce à sa capacité à étudier l’absorption des nanoparticules d’or (AuNPs) par les cellules cancéreuses, la plateforme d’imagerie multimodale peut visualiser les réponses cellulaires aux traitements hyperthermiques du cancer lorsque les faisceaux laser sont absorbés par les AuNP.

De plus, une imagerie chim...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
APE SRS Detection Unit	APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)	APE Lock-in Module	Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning Unit	Olympus	FV 3000	Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm	Invitrogen	C37483	Polystyrene microspheres
Coverslips	Thorlabs	CG15CH2	22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBS	Gibco	10500-064	Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
Flouview	Olympus	FV31S-SW	Laser scanning microscope control software
Function Generator	BX precision	40543	Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
Gold Nanoparticles	Nanopartz	A11-60	Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output Interface	Olympus	FV30 ANALOG	This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3	Newport	Spectra-Physics	Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope Frame	Olympus	IX83	Inverted microscope
Mouse 4T1 cells	ATCC	CRL-2539	Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion Objective	Olympus	UPLSAPO60XW/IR	The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 Condenser	Nikon	CSC1003	Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMT	Hamamatsu	R3896	PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT Connector	Hamamatsu	C13654-01-Y002	Connector for PMT
Power Supply	RS	RSPD-3303 C	Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640	Gibco	A10491-01	Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRU	Newport Spectra Physics	SF-TRU	System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS