La génétique inverse pour concevoir des variants du virus à ARN à sens positif

Résumé

Le protocole décrit une méthode permettant d’introduire une diversité génétique contrôlable dans le génome du virus de l’hépatite C en combinant la synthèse d’ARN mutant sur toute la longueur à l’aide de la PCR sujette aux erreurs et de la génétique inverse. La méthode fournit un modèle pour la sélection phénotypique et peut être utilisée pour les génomes de virus à ARN à sens positif de 10 kb de long.

Résumé

L’absence d’une méthode pratique pour la génération itérative de divers variants viraux pleine longueur a entravé l’étude de l’évolution dirigée dans les virus à ARN. En intégrant une PCR complète du génome de l’ARN sujette aux erreurs et une génétique inverse, une mutagénèse de substitution aléatoire à l’échelle du génome peut être induite. Nous avons développé une méthode utilisant cette technique pour synthétiser diverses banques afin d’identifier des mutants viraux avec des phénotypes d’intérêt. Cette méthode, appelée synthèse d’ARN mutant pleine longueur (FL-MRS), offre les avantages suivants : (i) la possibilité de créer une grande bibliothèque via une PCR très efficace en une seule étape sujette aux erreurs ; (ii) la capacité de créer des groupes de banques avec différents niveaux de diversité génétique en manipulant la fidélité de l’ADN polymérase ; (iii) la création d’un produit de PCR complet pouvant directement servir de modèle pour la synthèse d’ARN mutant ; et (iv) la capacité de créer de l’ARN qui peut être délivré dans les cellules hôtes en tant que pool d’entrée non sélectionné pour dépister les mutants viraux du phénotype souhaité. Nous avons constaté, à l’aide d’une approche de génétique inverse, que la FL-MRS est un outil fiable pour étudier l’évolution dirigée par le virus à tous les stades du cycle de vie de l’isolat JFH1 du virus de l’hépatite C. Cette technique semble être un outil inestimable pour utiliser l’évolution dirigée afin de comprendre l’adaptation, la réplication et le rôle des gènes viraux dans la pathogenèse et la résistance aux antiviraux chez les virus à ARN de sens positif.

Introduction

Le criblage génétique direct commence par un phénotype viral d’intérêt, puis, en séquençant son génome et en le comparant à celui de la souche d’origine, tente d’identifier la ou les mutations à l’origine de ce phénotype. En revanche, dans les criblages génétiques inversés, des mutations aléatoires sont introduites dans un gène cible, suivies d’un examen du ou des phénotypes résultants1^. Pour l’approche de la génétique inverse, la mutagénèse in vitro est la technique la plus largement utilisée pour créer un pool de variants qui sont ensuite criblés pour les phénotypes d’intérêt. Divers outils génétiques ont été rapportés pour réaliser la mutagénèse aléatoire à l’échelle du génome des virus à ARN, y compris la PCR sujette aux erreurs (ep-PCR)^2,3, l’extension circulaire de la polymérase⁴ et la mutagénèse par insertion de mu-transposons 5,6,7. Ces deux dernières méthodes permettent d’obtenir des bibliothèques abritant une diversité de séquences limitée et sont sujettes à l’introduction d’insertions et de délétions importantes, qui sont hautement létales pour les virus et limitent considérablement la récupération des variants viraux infectieux.

L’ep-PCR est une technique de mutagenèse puissante bien connue largement utilisée dans l’ingénierie des protéines pour générer des enzymes mutantes pour la sélection de phénotypes ayant les propriétés souhaitées, telles qu’une stabilité thermique améliorée, une spécificité du substrat et une activité catalytique 8,9,10. Cette technique est facile à réaliser car elle nécessite un équipement simple, n’implique pas de manipulations fastidieuses, utilise des réactifs disponibles dans le commerce et est rapide ; De plus, il génère des bibliothèques de haute qualité.

Ici, nous avons développé une nouvelle méthode de synthèse d’ARN mutant pleine longueur (FL-MRS) pour générer des génomes complets du virus de l’hépatite C (VHC) en intégrant l’ep-PCR, qui induit une mutagenèse de substitution aléatoire à l’échelle du génome et une génétique inverse. Même l’insertion ou la délétion d’un seul nucléotide est très délétère pour les virus à ARN à sens positif ([+]ssRNA) ; par conséquent, la mutagenèse de substitution basée sur la PCR est la méthode préférée pour la génération itérative de grandes banques diversifiées de génomes complets de virus à ARN (+)ss avec une bonne viabilité.

FL-MRS est une approche simple qui peut être appliquée à n’importe quel virus à ARN de sens positif avec une longueur de génome de ~10 kb grâce à la conception méticuleuse d’un ensemble d’amorces qui se lie au clone d’ADNc viral. pJFH1 est un clone d’ADNc infectieux qui code pour le génotype 2a du VHC et peut récapituler toutes les étapes du cycle de vie du virus. En utilisant l’approche FL-MRS, nous avons démontré la synthèse de banques de génomes complets mutagènes aléatoirement (banques de mutants [MLs]) pour produire des variants de JFH1 compétents pour la réplication pour lesquels il n’y avait aucune connaissance préalable des propriétés associées aux mutations. Lors de l’exposition à un antiviral, certaines des variantes virales ont rapidement surmonté la pression du médicament avec le changement phénotypique souhaité. En utilisant le protocole décrit ici, une pléthore de variants viraux peuvent être générés, créant des opportunités pour étudier l’évolution des virus à (+)ARNss.

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Protocole

REMARQUE : La souche JFH1 (WT) utilisée ici est un cadeau de Takaji Wakita, de l’Institut national des maladies infectieuses. La lignée cellulaire de l’hépatome humain, Huh7.5, était un cadeau de Charles Rice, de l’Université Rockefeller. Un schéma de la méthode est présenté à la figure 1.

1. Mutagénèse par substitution pangénomique de JFH1 à l’aide de la PCR sujette aux erreurs

1. Pour réaliser l’ep-PCR, préparer le mélange maître pour quatre séries d’expériences avec les amorces J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTTGAAAACGACGGC-3' et J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACTACCACTCTC -3' (Figure 1A), ainsi que les composants de réaction décrits dans le tableau 1 sans le modèle pJFH1 (plasmide isolé de la souche JFH1).
2. Aliquotez le mélange maître dans quatre tubes, ajoutez 100 ng, 50 ng, 25 ng et 10 ng de matrice dans les tubes individuels et ajustez le volume total de la réaction à 50 μL. Appliquer les conditions de cyclage décrites dans le tableau 2 pour amplifier un fragment de 9736 paires de bases (pb) comprenant le promoteur T7 et le génome complet du VHC (Figure 2).
   REMARQUE : Le produit ep-PCR doit contenir la séquence du promoteur T7 pour faciliter la transcription in vitro du génome viral. Par conséquent, l’amorce directe doit être située en amont du promoteur T7 du clone d’ADNc viral, et la séquence d’amorce inverse doit se terminer à l’extrémité 3' du génome du virus pour faciliter l’écoulement de la transcription. Optimisez chaque composant de la réaction ep-PCR dans la plage recommandée par le fabricant de l’ADN polymérase Taq pour obtenir une amplification à haut rendement. En plus des quantités variées de matrices, des dNTP déséquilibrés (en particulier une faible concentration de dATP et/ou de dGTP) peuvent également être utilisés pour augmenter la diversité de la longueur des génomes viraux de 6 à 8 kb de long³.
3. Estimez le produit ep-PCR amplifié en chargeant des volumes égaux de produits PCR (5 μL) et en les comparant à des quantités connues d’échelle d’ADN de 1 kilobase (kb) en exécutant une électrophorèse sur gel d’agarose à base de tris-acétate-EDTA (TAE) à 0,8 %¹¹. Purifiez le produit à l’aide d’un kit de purification à colonne selon les directives du fabricant.
4. Estimer la concentration du produit purifié en mesurant l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume¹². Concentrez le produit ep-PCR sous vide si nécessaire pour obtenir une concentration de produit ≥100 ng/μL.
   REMARQUE : Une estimation plus précise peut être faite en chargeant des dilutions en série de deux fois du produit ep-PCR et en comparant leurs intensités aux quantités connues de l’échelle d’ADN de 1 kb.

2. Synthèse de l’ARN viral

1. Mise en place d’une réaction de 40 μL pour digérer 5 μg de clonal-pJFH1 avec 4 U d’enzyme XbaI à 37 °C pendant 2 h, suivie d’une purification en colonne et d’une mesure de l’absorbance à 260 nm dans un spectrophotomètre à microvolume¹². Mettre en place une réaction de transcription in vitro de 20 μL du produit ep-PCR purifié en colonne ou clonal-pJFH1 (WT) à l’aide d’un système de production d’ARN à grande échelle disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
2. Dans un tube de microcentrifugation de 200 μL, mélanger environ 1 μg du produit ep-PCR purifié (banques mutantes) ou de la pJFH1 clonale digérée par XbaI , 10 μL de tampon 2x contenant des ribonucléotides et 2 μL de mélange enzymatique T7. Mélangez tous les composants et essorez brièvement les composants. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C pendant 45 min, suivi de l’ajout de 1 enzyme DNase sans RNase U et de l’incubation à 37 °C pendant 30 min (Figure 1C).
3. Purifier l’ARN synthétisé in vitro à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ARN selon les instructions du fabricant, éluer dans 40 μL d’eau exempte de RNase et de DNase, et estimer la concentration de l’ARN purifié en mesurant l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume¹². Préparez les aliquotes au besoin (5 μg ou 2 μg) pour éviter le gel-dégel et conservez-les à −80 °C. Vérifier l’intégrité et la taille des transcrits viraux en utilisant 2 μg d’ARN pour une électrophorèse sur gel d’agarose MOPS formaldéhyde^{0,8 % 13} (Figure 3).

3. Estimation de la proportion de mutations dans les produits ep-PCR (banques mutantes)

NOTA : Dans cette étape, la proportion de nucléotides mutés par sous-clonage du produit obtenu à l’étape 2. a été estimé pour démontrer l’avantage de l’utilisation de l’ep-PCR pour créer une hétérogénéité génétique en utilisant deux banques de mutants du génome complet (ML50 et ML25) et des ARN viraux clonaux dérivés de pJFH1. La proportion de mutations a été estimée dans le gène NS5A du VHC, qui était également le gène phénotypique de lecture (résistance aux médicaments) dans cette étude.

1. Mettre en place une réaction de synthèse d’ADNc de 20 μL en ajoutant environ 1 μg de l’ARN viral synthétisé à l’étape 2., 5 μM d’amorce inverse 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' et 200 U de transcriptase inverse selon les recommandations du fabricant.
2. À l’aide de l’ADNc, amplifier un fragment de 2571 pb qui comprend le gène NS5A complet. Pour ce faire, préparer un mélange réactionnel contenant 0,5 μM pour les amorces 5272F et 7848R (concentration finale ; Tableau 3), 1,5 mM de MgCl₂, 1 tampon PCR et 1 U de polymérase Taq haute fidélité dans un volume total de 50 μL et exécuter un cycle d’amplification en utilisant les conditions décrites dans le tableau 4.
3. Exécutez le produit sur un gel d’agarose à base de TAE à 0,8 % pour confirmer la taille du produit de 2571 pb, puis purifiez le produit à l’aide d’un kit de purification en colonne selon les instructions du fabricant. Éluer le produit purifié en colonne dans 40 μL d’eau stérile.
4. Pour ajouter un porte-à-faux de 3' A au produit, ajoutez 0,5 μM de dATP et 1 U d’ADN polymérase Taq basse fidélité et incubez l’ensemble du produit PCR à 70 °C pendant 30 min avec 1x tampon PCR et 1,5 mM MgCl₂ (concentration finale). Purifier le mélange à l’aide d’un kit de purification à colonne selon les directives du fabricant
   REMARQUE : Vous pouvez également retirer le produit long de ~9,7 ko du gel à partir de l’étape 1.4. et effectuer le clonage à l’aide d’un kit disponible dans le commerce pour le clonage d’un produit à PCR longue conformément aux instructions du fabricant ou effectuer le NGS du produit ep-PCR à l’aide d’une plate-forme Illumina².
5. Mettre en place une réaction de ligature en ajoutant 5 μL de tampon de ligature 2x, 50 ng d’ADN vecteur T, environ 3 fois l’excès molaire de l’ADN inséré synthétisé à l’étape 3.4., 3 unités Weiss d’ADN ligase T4 et de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume total de 10 μL. Incuber cette réaction à température ambiante pendant 3 h, puis ajouter 100 μL d’Escherichia coli DH5α avec l’ADN ligaturé ; choc thermique des cellules à 42 °C pendant 35 s (Figure 1B).
6. Ajouter 1 mL de milieu Luria-Bertani (LB) (sans antibiotique) et incuber en agitant doucement pendant 1 h à 37 °C pour la récupération. Centrifuger la suspension cellulaire à 13 800 x g, jeter le surnageant et remettre en suspension dans 200 μL de milieu LB frais.
7. Plaquer 100 μL de cellules d’E. coli DH5α transformées sur une plaque LB contenant 50 μg/mL d’ampicilline et incuber à 37 °C pendant 16 h. Mettre en place des minipréparations de 25 à 30 colonies dans 5 mL de milieu LB + 50 μg/mL d’ampicilline et cultiver pendant la nuit à 37 °C.
8. Le lendemain, extrayez les plasmides à l’aide d’un kit de purification de plasmides selon les instructions du fabricant et effectuez une digestion enzymatique de restriction dans un volume de 10 μL avec 200 ng de plasmides isolés, 2 U d’EcoR1 et 1x tampon de restriction pour toutes les colonies.
9. Après avoir incubé les mélanges de digestion à 37 °C pendant 3 h, résolvez les produits sur un gel d’agarose à base de TAE à 0,8 % pour confirmer l’insertion de l’ADN plasmidique.
10. Effectuer le séquençage de Sanger des plasmides de 25 clones positifs à l’aide des amorces M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF et 6748-SPF (Tableau 3) pour déterminer la proportion de mutations (exprimée en proportion de nucléotides mutés) dans les ARN viraux dérivés des banques et de la pJFH1 clonale (Figure 1B et Figure 4).

4. Transfection de l’ARN viral de la lignée cellulaire Huh7.5

REMARQUE : Utiliser du matériel de culture tissulaire exempt de RNase/DNase et travailler dans une enceinte de sécurité biologique stérile de classe II. Travailler dans l’installation de confinement recommandée conformément aux lignes directrices de l’organisation en matière de biosécurité.

1. Maintenir les cellules Huh7,5 en incubant dans un incubateur à 5 % de CO 2 à 37 °C dans un flacon de culture tissulaire T75 cm₂ contenant 15 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) complet de Dulbecco complété par du sérum de veau fœtal à 10 % (vol/vol), de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (100 μg/mL ; Graphique 1D).
2. Divisez les cellules dans un rapport de 1 :3 lorsque la confluence atteint 90 %. Lavez les cellules avec 1x solution saline tamponnée au phosphate préchauffée (PBS ; pH 7,4). Ajouter 5 mL de solution 1x trypsine-EDTA pour recouvrir complètement la couche cellulaire, agiter doucement le flacon, puis incuber le flacon à 37 °C pendant 5 min.
   REMARQUE : Le temps d’incubation peut varier ; incuber les cellules jusqu’à ce que la couche cellulaire soit complètement détachée de la surface du flacon de culture cellulaire.
3. Ajouter 10 mL de 1x DMEM complet préchauffé, disperser les cellules par pipetage répété et recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL ou 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire à 252 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 6 mL de DMEM complet et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂.
4. Pour un maintien continu des cellules Huh7.5 naïves, transfectées ou infectées par un virus, répétez l’étape 4.2. et l’étape 4.3.
5. 1 jour avant la transfection, diviser les cellules comme décrit aux étapes 4.1.-4.3., compter le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre, ensemencer les cellules Huh7.5 à une densité de 0,6 x 10⁶ dans des boîtes de 35 mm dans 2 mL de DMEM complet, et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO₂.
6. Le lendemain, préparez le complexe transcription-lipide. Pour ce faire, diluer 10 μL de réactif de transfection dans 50 μL de milieu essentiel minimal, et diluer séparément 5 μg de transcrits viraux dans 50 μL de milieu essentiel minimal.
7. Incubez les deux mélanges à température ambiante pendant 10 minutes, puis mélangez-les dans un seul tube de microcentrifugation stérile et incubez à nouveau le mélange à température ambiante pendant 30 minutes pour former le complexe transcription-lipide.
8. Après 16 h d’incubation cellulaire, retirez le milieu de culture de la boîte de culture, lavez les cellules 2 fois avec du PBS 1x préchauffé et ajoutez 1,5 mL de milieu essentiel minimal. Ajoutez lentement le complexe transcrit-lipide dans le plat et remuez doucement avec les mains pour assurer une répartition uniforme des complexes.
9. Incuber les cellules dans un incubateur à 5% de CO₂ à 37 °C pendant 10 h. Ensuite, retirez le milieu, lavez les cellules transfectées 2 fois avec 1 mL de PBS 1x préchauffé et ajoutez 2 mL de DMEM complet.

5. Production de virus

1. Divisez les cellules Huh7,5 transfectées tous les 2 jours ou 3 jours lorsqu’elles atteignent 90% de confluence. Collectez les surnageants de virus à chaque fractionnement et stockez-les à −80 °C pour une analyse plus approfondie.
2. À chaque fractionnement, surveillez la propagation du virus à l’aide d’un test de formation de foyer (FFA) tel que décrit à l’étape 6.2. Récoltez le virus jusqu’à ce que la propagation du virus atteigne >80 % des cellules transfectées (Figure 1D).
   REMARQUE : Divisez les cellules transfectées dans un rapport de 1 :1 pour les premiers passages afin de sauver le plus grand nombre de variants viraux. La propagation du virus ralentit et la viabilité diminue avec l’augmentation des proportions de mutations dans les ML du génome complet².

6. Quantification des titres viraux

1. Quantification de l’ARN viral
   1. Isolez l’ARN viral de 140 μL de surnageants de culture à l’aide d’une trousse d’isolement d’ARN viral selon les instructions du fabricant.
   2. Mettez en place une réaction qRT-PCR de 10 μL à l’aide d’un kit qRT-PCR commercial selon les instructions du fabricant. Utiliser l’amorce directe R6-130-S17, l’amorce inverse R6-290-R19 (concentration finale de 0,2 μM chacune) et la sonde R9-148-S21FT (concentration finale de 0,3 μM) pour la quantification de l’ARN du VHC (tableau 3). Réglez les conditions de fonctionnement sur 48 °C pendant 20 min, 95 °C pendant 10 min, puis 45 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min.
      REMARQUE : La sonde doit contenir le colorant rapporteur fluorescent 6-carboxyfluorescéine (FAM) et le colorant de trempe 6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine (TAMRA) aux extrémités 5' et 3', respectivement.
   3. Exécutez des réactions dans une machine de PCR en temps réel. Mettre en place simultanément des témoins négatifs, c’est-à-dire de l’ARN extrait des surnageants de cellules infectées fictives et de l’eau exempte de nucléase pour garantir l’absence de contamination croisée.
   4. En parallèle, générer une courbe standard à l’aide d’un nombre de copies connu dilué en série de 10 fois des transcrits du VHC (1 x 10,⁸ à 0) pour la quantification de l’ARN viral. Effectuez la quantification en trois exemplaires (Figure 1D).
2. Quantification du titre du virus infectieux à l’aide d’une dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID₅₀)
   1. Environ 16 h avant l’ajout du virus, plaquer 6,5 x 10³ Huh7,5 cellules/puits dans une plaque de 96 puits et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ .
   2. Dans une armoire de classe de biosécurité II, effectuer 10 dilutions en série (1 mL chacune) couvrant 1 x 10⁻¹ à 1 x 10⁻⁶ dilutions (huit dilutions) du virus récolté (obtenues lorsque la propagation du virus atteint >80 % des cellules, comme décrit à l’étape 5). Ajouter 100 μL/puits (avec huit répétitions) du virus dilué pour infecter les cellules Huh7,5 et conserver la plaque dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 3 jours.
   3. Après 3 jours, lavez les cellules infectées 3 fois avec 0,1 mL de PBS à chaque fois, et fixez et perméabilisez les cellules avec 0,1 mL de méthanol glacé à −20 °C pendant 20 min. Lavez les puits avec 1x PBS 3x puis 1x avec PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
   4. Après avoir retiré le PBS-T, bloquez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante avec 0,1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % contenant du lait écrémé à 0,2 % dans du PBST. Retirer la solution bloquante et traiter les cellules pendant 5 min avec 0,1 mL de H 2 O₂à 3 % préparé dans 1x PBS.
   5. Encore une fois, lavez les cellules 2 fois avec 1 x PBS et 1 x avec du PBS-T, puis ajoutez 50 μL/puits d’anticorps monoclonaux anti-NS5A 9E10 (1 :10000, stock 1 mg/mL ; un cadeau aimable de Charles Rice, de l’Université Rockefeller), et incubez à température ambiante pendant 1 h. Lavez à nouveau les puits 3x avec 1x PBS et 1x avec PBS-T.
   6. Ajouter 50 μL/puits d’IgG secondaires anti-souris de chèvre conjuguées HRP (1 :4000), incuber pendant 30 min à température ambiante, puis retirer l’anticorps non lié en lavant les puits avec 0,1 mL de PBS 1x.
   7. Ajouter 30 μL de substrat de couleur DAB (tétrachlorhydrate de diaminobenzidine) et incuber la plaque en la balançant doucement pendant 10 min à température ambiante. Le substrat développe un précipité brun à la surface du puits qui indique l’antigène NS5A du VHC. Retirez la solution DAB et lavez les puits 2x avec 1x PBS et 1x avec de l’eau distillée. Ajouter 100 μL de PBS contenant 0,03 % d’azoture de sodium.
   8. Examinez chaque puits au microscope à lumière inversée à l’aide d’un objectif 10x. Comptez le nombre de puits positifs. Si le puits contient une ou plusieurs cellules NS5A positives, alors il est positif ; si le puits montre une absence de cellules NS5A positives, alors il est négatif. Utiliser un calculateur de Reed et Muench pour estimer la dilution finale qui infecte 50 % des puits (TCID₅₀)^14,15. Une inverse de la dilution nécessaire pour obtenir le TCID₅₀ est le titre d’infectivité du virus (unités formant foyers) par unité de volume.
      REMARQUE : Les titres d’infectiosité virale varient selon les banques mutantes.

7. Sélection des variants viraux résistants aux médicaments

1. Dissoudre le pibrentasvir (PIB), un inhibiteur de la NS5A, dans du DMSO à 100 % jusqu’à une concentration de 1 mM et le diluer davantage dans du DMEM complet jusqu’à une concentration de 10 nM.
2. Pour déterminer la concentration efficace de 50 % de PIB, ensemencer des cellules Huh7,5 à une densité de 0,6 x 10 6/puits dans une plaque à⁶ puits et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ . Après 16 h d’incubation cellulaire, ajouter une dose virale de ML50 ou de virus clonal JFH1 pour infecter 50 % des cellules, puis, 12 h après l’infection (h p.i.), traiter les cellules avec une série de dilution double de PIB allant de 0,5 à 100 pM. Mesurez l’AGL et quantifiez l’UFE comme à l’étape 6.2. après 3 jours d’incubation.
3. Tracez les courbes dose-réponse à l’aide des valeurs de dosage de réduction FFU dans un logiciel d’analyse statistique. À partir de la courbe sigmoïdale, obtenir la concentration efficace de 50 % (EC₅₀ ; Graphique 5).
   REMARQUE : La plage de concentration efficace peut varier selon la classe, entre les antiviraux anti-VHC de la même classe et selon la bibliothèque de mutants.
4. Pour l’expérience, infecter des cellules Huh7.5 naïves à 70 % de confluence avec une dose de virus ML50 (variants dérivés de l’ARN ML50) pour infecter 50 % des cellules pendant 12 h, puis transférer les cellules infectées sur des plaques à 6 puits 24 h après l’infection.
5. Ajouter 1x EC₅₀ PIB (47,3 pM) aux cellules infectées après 16 h de fractionnement cellulaire. Faites-le après chaque division cellulaire pendant six passages consécutifs (18 jours), suivis de trois cycles de passage sans médicament, et surveillez la propagation du virus à l’aide d’AGL comme décrit à l’étape 6.2. Mise à l’échelle des réactifs FFA en fonction de la zone de croissance. Récoltez les surnageants viraux à chaque passage et conservez-les à −80 °C jusqu’à leur utilisation.
   REMARQUE : La propagation virale à plus de 50 % des cellules pendant le suivi du traitement peut être définie comme une percée, et la propagation virale pendant la période d’arrêt du médicament peut être définie comme une rechute virale¹⁶.
6. Extraire l’ARN viral du surnageant au jour 18, comme décrit à l’étape 6.1.1., puis synthétiser l’ADNc, comme indiqué à l’étape 3.1. Amplifier le gène NS5A à l’aide de 5 μL d’ADNc dilué 1 :5 et des composants PCR décrits à l’étape 3.2. Ensuite, suivez les étapes 3.3.-3.5. pour déterminer les mutations de résistance aux médicaments NS5A dans 6 à 8 plasmides bactériens positifs à l’aide des amorces de séquençage NS5A 6186F, 6862F et 6460R (Tableau 3 et Tableau 4).
   REMARQUE : Ici, dans cette étude, nous avons rapporté des substitutions dans NS5A de variants sélectionnés pendant le traitement PIB à 1x EC₅₀. Cela permettra d’exclure la contribution des substitutions autres que NS5A à la réduction de la sensibilité au PIB.

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Résultats

Une pléthore de variants complets du VHC peuvent être générés et dépistés pour les phénotypes résistants aux médicaments d’intérêt en suivant les procédures décrites à la figure 1. Des banques de mutants du génome complet ont été synthétisées à l’aide de clonal-pJFH1 en quantités décroissantes (100-10 ng), comme le montre la figure 2. Les rendements moyens des produits ep-PCR (banques de mutants) variaient de 3,8 à 12,5 ng/μL.

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Discussion

Dans cette étude, nous avons détaillé une procédure simple et rapide de FL-MRS qui intègre l’ep-PCR¹⁸ et la génétique inverse pour synthétiser des banques de génomes complets du VHC, qui peuvent ensuite être utilisées dans un système de culture cellulaire pour générer des variants compétents en réplication pour le criblage de phénotypes résistants aux médicaments. L’utilisation de l’ADN polymérase Taq basse fidélité est une condition préalable à l’ep-PCR qui permet ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 - 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S