Un modèle hépatocytaire compétent examinant l’entrée du virus de l’hépatite B par le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium comme cible thérapeutique

Résumé

Nous présentons un protocole pour dépister les composés anti-virus de l’hépatite B (VHB) ciblant les étapes du cycle de vie d’entrée pré et post-virale, en utilisant la calorimétrie de titrage isotherme pour mesurer l’affinité de liaison (K_D) avec le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium de l’hôte. L’efficacité antivirale a été déterminée par la suppression des marqueurs du cycle de vie viral (formation d’ADNcc, transcription et assemblage viral).

Résumé

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) a été considérée comme un facteur de risque crucial pour le carcinome hépatocellulaire. Le traitement actuel ne peut que réduire la charge virale, mais n’entraîne pas de rémission complète. Un modèle hépatocytes efficace pour l’infection par le VHB offrirait un cycle de vie viral réaliste qui serait crucial pour le dépistage des agents thérapeutiques. La plupart des agents anti-VHB disponibles ciblent les étapes du cycle de vie après l’entrée virale, mais pas avant l’entrée virale. Ce protocole détaille la génération d’un modèle d’hépatocytes compétent capable de dépister des agents thérapeutiques ciblant les étapes du cycle de vie de l’entrée prévirale et post-entrée virale. Cela comprend le ciblage de la liaison au polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium (NTCP), la formation d’ADNCC, la transcription et l’assemblage viral basés sur l’imHC ou l’HepaRG en tant que cellules hôtes. Ici, le test d’inhibition de l’entrée du VHB a utilisé la curcumine pour inhiber les fonctions de liaison et de transport du VHB via NTCP. L’affinité de liaison (K_D) avec le PNCB avec le PNCB a été évaluée à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), un outil universel pour le dépistage des médicaments contre le VHB basé sur des paramètres thermodynamiques.

Introduction

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est considérée comme une maladie potentiellement mortelle dans le monde entier. L’infection chronique par le VHB est chargée d’un risque de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire¹. Le traitement anti-VHB actuel se concentre principalement sur l’entrée post-virale à l’aide d’analogues nucléos(t)ide (NA) et d’interféron alpha (IFN-α)^2,3. La découverte d’un inhibiteur de l’entrée du VHB, Myrcludex B, a permis d’identifier une nouvelle cible pour les agents anti-VHB⁴. La combinaison d’inhibiteurs d’entrée et d’AN dans le VHB chronique a considérablement réduit la charge virale par rapport à ceux ciblant uniquement la réplication virale ^5,6. Cependant, le modèle classique d’hépatocytes pour le dépistage des inhibiteurs de l’entrée du VHB est limité par de faibles niveaux de récepteurs viraux (polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium, NTCP). La surexpression du PCNh dans les cellules d’hépatome (c.-à-d. HepG2 et Huh7) améliore l’infectiosité^du VHB ^7,8. Néanmoins, ces lignées cellulaires expriment de faibles niveaux d’enzymes métabolisant les médicaments de phase I et II et présentent une instabilité génétique⁹. Les modèles hépatocytes qui peuvent aider à cibler des mécanismes distincts des composés anti-VHB candidats tels que l’entrée prévirale, la liaison au PNCP et l’entrée virale accéléreraient l’identification et le développement de schémas thérapeutiques combinés efficaces. L’étude sur l’activité anti-VHB de la curcumine a élucidé l’inhibition de l’entrée virale en tant que nouveau mécanisme en plus de l’interruption post-entrée virale. Ce protocole détaille un modèle hôte pour le criblage des molécules d’entrée anti-VHB¹⁰.

L’objectif de cette méthode est d’explorer des composés anti-VHB candidats pour l’inhibition de l’entrée virale, en particulier le blocage de la liaison et du transport du NTCP. Comme l’expression du PNCP est un facteur critique pour l’entrée et l’infection du VHB, nous avons optimisé le protocole de maturation des hépatocytes pour maximiser les niveaux de NTCP¹¹. En outre, ce protocole peut différencier l’effet inhibiteur sur l’entrée du VHB comme inhibition de l’attachement du VHB par rapport à l’inhibition de l’internalisation. Le test d’absorption de l’acide taurocholique (TCA) a également été modifié à l’aide d’une méthode basée sur ELISA au lieu d’un radio-isotope pour représenter le transport du PNCC^12,13. L’interaction récepteur et ligand a été confirmée par leurs structures 3D^14,15. L’inhibition de la fonction du PNCC peut être évaluée en mesurant l’activité d’absorption du TCA¹⁶. Cependant, cette technique n’a pas fourni de preuve directe de la liaison du PNCC aux inhibiteurs candidats. Par conséquent, la liaison peut être étudiée à l’aide de diverses techniques, telles que la résonance plasmonique^{de surface 17}, ELISA, le test de décalage thermique basé sur la fluorescence (FTSA)18, FRET ¹⁹, AlphaScreen et diverses autres méthodes²⁰. Parmi ces techniques, l’ITC est un standard d’objectif dans l’analyse de liaison car il permet d’observer l’absorption ou l’émission de chaleur dans presque toutes les réactions²¹. L’affinité de liaison (K_D) du PNCC et des composés candidats a été directement évaluée à l’aide de l’ITC; Ces valeurs d’affinité étaient plus précises que celles obtenues à l’aide du modèle de prédiction in silico ²².

Ce protocole couvre les techniques de maturation des hépatocytes, d’infection par le VHB et de dépistage des inhibiteurs d’entrée du VHB. En bref, un modèle d’hépatocytes a été développé à partir de lignées cellulaires imHC et HepaRG. Les cellules en culture ont été différenciées en hépatocytes matures en 2 semaines. La régulation positive des niveaux de NTCP a été détectée à l’aide de la PCR en temps réel, du transfert Western et de la cytométrie^{en flux 11}. Le virion de l’hépatite B (VHB) a été produit et recueilli à partir de l’hépatite HepG2.2.15. L’icHC différencié ou HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) a été traité de manière prophylactique avec les candidats anti-VHB 2 h avant l’inoculation avec le virion du VHB. Le résultat attendu de l’expérience était l’identification des agents qui diminuent le VHB cellulaire et l’infectiosité. L’activité anti-PNCC a été évaluée à l’aide du test d’absorption du TCA. L’activité du PNCP pouvait être supprimée par les agents qui liaient spécifiquement le PNCP. La technique ITC a été utilisée pour étudier la faisabilité d’une liaison interactive qui pourrait prédire les inhibiteurs et leurs protéines cibles, en déterminant l’affinité de liaison (K_D) du ligand pour le récepteur via des interactions non covalentes du complexe biomoléculaire^23,24. Par exemple, K D ≥ 1 × 10³ mM représente une liaison faible, K D ≥ 1 × 10⁶ μM représente une liaison modérée et K _D ≤ 1 × 10⁹ nM représente une liaison forte. Le ΔG est directement corrélé avec les interactions de liaison. En particulier, une réaction avec ΔG négatif est une réaction exergonique, indiquant que la liaison est un processus spontané. Une réaction avec un ΔH négatif indique que les processus de liaison dépendent de la liaison hydrogène et des forces de Van der Waals. L’absorption du TCA et les données de l’ITC pourraient être utilisées pour dépister les agents anti-VHB. Les résultats de ces protocoles peuvent fournir une base non seulement pour le dépistage anti-VHB, mais aussi pour l’interaction avec le PNCP telle qu’évaluée par affinité de liaison et fonction de transport. Cet article décrit la préparation et la caractérisation des cellules hôtes, la conception expérimentale et l’évaluation de l’entrée anti-VHB ainsi que l’affinité de liaison NTCP.

Protocole

NOTA: Les procédures suivantes doivent être effectuées dans une hotte à écoulement à risque biologique de classe II ou une hotte à écoulement laminaire. La manipulation du VHB a été approuvée sur le plan éthique par la CISR (MURA2020/1545). Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur toutes les solutions, réactifs, équipements et lignées cellulaires utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des cellules hôtes (hépatocytes matures)

1. Cultiver les hépatocytes (3,75 × 10⁵ cellules HepaRG ou imHC) et conserver dans une fiole de culture de 75 cm² avec 10 mL de milieu DMEM/F12 complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Attendez que les cellules atteignent 80%-90% de confluence (dans 1 semaine).
2. Jeter l’ancien milieu de la fiole et laver les cellules avec 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Aspirer le PBS et ajouter 4 mL de trypsine-EDTA à 0,05%.
4. Incuber la fiole dans l’incubateur à 37 °C pendant 2-3 min, et vérifier les cellules adhérentes à l’aide d’un microscope inversé avec une lentille d’objectif 10x. Assurez-vous que la monocouche s’est détachée de la surface de culture.
5. Inhiber la trypsine en ajoutant 4 mL du milieu de culture supplémenté avec 10% de FBS dans le ballon et remettre soigneusement en suspension les cellules récoltées. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et centrifuger pendant 3 min à 300 × g, 25 °C.
6. Aspirer le surnageant de la pastille cellulaire et remettre en suspension avec 1-2 mL du milieu de culture préchauffé complété avec 10% FBS et antibiotiques.
7. Mélanger 10 μL de la suspension cellulaire et du bleu de trypan et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Assurez-vous que la viabilité de la cellule est supérieure à 90% avant de passer à l’étape suivante.
8. Ensemencer 1 × 10⁶ cellules par 2 mL dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et maintenir dans un milieu complet DME/F12 jusqu’à ce que les cellules atteignent 100 % de confluence.
9. Pour la maturation hépatique, préparer un milieu de maturation hépatique (milieu E de Williams complété par 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone, 2 mM de L-glutamine et 2 % de DMSO).
10. Remplacez le milieu de culture 2x par semaine.
11. Maintenir les hépatocytes dans le milieu de maturation pendant 2 semaines pour obtenir des hépatocytes matures prêts pour l’infection par le VHB.

2. Quantification du PNÇ cellulaire

1. Mesure de l’expression du PNCC à l’aide de la PCR en temps réel
   1. Recueillir la pastille d’hépatocytes matures par trypsinisation (voir les étapes 1.2-1.5).
   2. Extraire l’ARN total de la pastille cellulaire à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN avec traitement à la DNase I.
   3. Synthétiser l’ADNc à partir de 200 ng d’ARN total à l’aide d’une amorce oligo-dT et d’un système de transcription inverse en suivant les instructions du fabricant.
   4. Diluer l’ADNc à 50 ng / μL et l’utiliser comme modèle pour la réaction PCR. Mélanger 2 μL de l’ADNc dilué avec les réactifs du mélange maître de PCR contenant la solution du kit qRT-PCR vert SYBR avec 5 μM d’amorces spécifiques au PNCT (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' et 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
   5. Pour la normalisation, utiliser GAPDH comme gène d’entretien ménager avec des amorces spécifiques (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' et 5'-AAATGAGCCAGCCTTCTC-3').
   6. Amplifier les échantillons d’ADNc à l’aide d’un thermocycleur dans les conditions de température suivantes : 1 cycle de 3 min à 95 °C (dénaturation initiale) ; 40 cycles de 30 s à 95 °C (dénaturation), 30 s à 60 °C à 65 °C (recuit), 30 s à 72 °C (extension); 1 cycle de 5 min à 72 °C (extension finale).
   7. Calculer le changement de pli NTCP dans les hépatocytes matures sur les cellules indifférenciées en utilisant GAPDH comme gène calibrateur basé sur la méthode ^2-ΔΔCT .
2. Quantifier le PNCC à l’aide de l’analyse par transfert Western
   1. Récolter les hépatocytes à l’aide d’un grattoir cellulaire et les centrifuger à 300 x g, 25 °C pendant 5 min pour recueillir la pastille cellulaire.
   2. Suivez les instructions du fabricant du tampon RIPA pour extraire la protéine cellulaire avec 100 μL de tampon RIPA contenant 1x inhibiteur de protéase.
   3. Mesurer la concentration totale de protéines à l’aide de la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA).
   4. Mélanger 12,5 μL de protéines avec 2x colorant de charge dans un rapport de 1:1 par volume.
   5. Faire bouillir le mélange de protéines et l’échelle étalon à 95 °C pendant 5 min.
   6. Ajouter 1x tampon courant à la chambre d’électrophorèse.
   7. Charge 5 μL de l’échelle étalon des protéines ou 20 μL du mélange de protéines bouillies dans un gel de polyacrylamide à 10 % (p/v).
   8. Effectuer une électrophorèse sur gel : 50 V pendant 30 min puis 90 V pendant 1 h à température ambiante.
   9. Préparez une membrane PVDF en la trempant dans du méthanol pendant 30 s, lavez-la à l’eau bidistillée pendant 1-2 min, et faites-la tremper avec deux morceaux de papier filtre dans un tampon de transfert pendant 10 min ou jusqu’à utilisation.
   10. Placer le papier filtre sur la plaque anodique d’une cellule de transfert semi-sèche; Ensuite, placez la membrane PVDF, le gel et le papier filtre sur le dessus, dans cet ordre.
   11. Transférer les protéines du gel à la membrane PVDF à 10 V pendant 25 min à température ambiante.
   12. Bloquer la membrane avec une solution de blocage WB pendant 1 h à température ambiante.
   13. Incuber la membrane avec un polypeptide cotransportant du taurocholate antisodique (anti-NTCP) (dilution 1:100) à 4 °C pendant une nuit.
   14. Laver la membrane 3 x 10 min avec TBST.
   15. Incuber la membrane avec un anticorps anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (dilution de 1:10 000) pendant 1 h à température ambiante.
   16. Laver la membrane 3 x 10 min avec TBST puis 1 x 5 min avec TBS.
   17. Détecter le PNCC à l’aide d’un substrat HRP (voir le tableau des matériaux).
   18. Ajouter au moins 0,1 mL de solution de substrat HRP/^cm2 de la membrane et incuber la membrane pendant 3 à 5 minutes dans l’obscurité.
   19. Visualisez le PNCC à l’aide d’un système de documentation sur gel en mode chimiluminescence, sélectionnez l’option de marqueur pour la membrane, ajustez le temps d’exposition avec le mode cumulatif toutes les 1 minutes et prenez la photo avec différents temps d’exposition pendant 5 minutes.
   20. Stripper et sonder le transfert avec un anticorps anti-GAPDH de souris (dilution de 1:200 000) et un anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué HRP (dilution de 1:10 000).
3. Mesure du niveau de PNCC à l’aide de la cytométrie en flux
   1. Recueillir les granulés cellulaires des hépatocytes matures en incubant les cellules avec 8 mM d’EDTA pendant 15 min.
      REMARQUE: Évitez d’utiliser de la trypsine ou d’autres protéases qui peuvent perturber les récepteurs de surface cellulaire. Comme le NTCP est une protéine réceptrice de surface cellulaire, les dommages dus à la trypsinisation peuvent donner des résultats négatifs.
   2. Fixer les hépatocytes avec 300 μL de paraformaldéhyde à 3,7% dans 1x PBS pendant 15 min. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C.
   3. Laver les cellules 2x avec 700 μL de 1x PBS avec 1% FBS (v/v), centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C, ajouter 300 μL de Triton X-100 à 0,05% dans du PBS à la pastille de cellule, et incuber les cellules à température ambiante pendant 20 min pour les perméabiliser.
   4. Centrifuger pendant 10 min à 300 × g, 25 °C, laver la pastille de la cellule 3 x 1 min avec 700 μL de PBS contenant 1% FBS (v/v). Incuber les cellules avec l’anticorps primaire contre le PNCP (dilution 1:100) à 4 °C pendant 30 min. Laver les cellules 3 x 1 min avec un tampon Perm/Wash et une centrifugeuse pendant 10 min à 300 × g, 25 °C.
   5. Colorer les cellules avec l’anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 à 4 °C pendant 30 min. Laver les cellules 3 x 1 min avec un tampon Perm/Wash et une centrifugeuse pendant 10 min à 300 × g, 25 °C. Remettez en suspension la pastille de la cellule avec 200 μL de PBS avec 1% FBS (v / v).
   6. Allumez le cytomètre en flux, réchauffez le laser pendant 15 minutes et effectuez un nettoyage de routine.
   7. Sélectionnez les paramètres de mesure, y compris la diffusion directe (FSC), la diffusion latérale (SSC) et l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la phycoérythrine (PE), et réglez le réglage de la compensation automatique par le logiciel. Inclure les échantillons de contrôle de compensation : contrôle non coloré, contrôle coloré FITC et contrôle coloré PE.
      REMARQUE : Les paramètres FSC et SSC sont utilisés pour déterminer la taille et la granularité des cellules individuelles afin de sélectionner la population cellulaire pour l’analyse de contrôle. Le détecteur de canal de fluorescence a des canaux FITC et PE . Pour ce protocole, sélectionnez le canal FITC pour détecter Alexa Fluor 488.
   8. Exécuter l’échantillon non coloré avec un débit fluidique moyen (60 μL/min), ajuster le seuil de FSC et de SSC jusqu’à ce qu’ils couvrent la population cellulaire d’intérêt, marquer la région de la porte dans cette zone et appliquer à tous les contrôles de compensation.
   9. Réglez le tube photomultiplicateur de fluorescence (PMT) à l’aide de la commande non colorée et ajustez la tension PMT de FITC ou PE dans le quadrant négatif. Exécutez l’échantillon coloré positif et ajustez FITC ou PE dans l’échelle du quadrant positif. Exécutez les contrôles non tachés, FITC ou PE, calculez la compensation et appliquez-la aux paramètres de l’échantillon. Exécutez l’échantillon d’hépatocytes pour mesurer le niveau NTCP.
   10. Analyser les hépatocytes colorés à l’aide d’un logiciel de cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux).
       1. Sous les fenêtres BD FACSuite, cliquez sur le tube de contrôle dans l’onglet Sources de données et attendez que les données brutes apparaissent.
       2. Dans l’onglet Feuille de calcul sur le côté droit, cliquez sur le bouton Porte d’ellipse , sélectionnez la population de cellules dans SSC et le diagramme à points FSC à l’aide du curseur de la souris, puis attendez que le cercle P1 apparaisse.
       3. Cliquez sur le bouton Interval Gate et marquez la région dans l’histogramme FITC, en commençant par la valeur d’intensité de fluorescence la plus élevée vers la droite. Observez la ligne P2 qui apparaît.
       4. Cliquez sur le tube d’expérience et observez que les données de l’onglet Feuille de calcul changent. Cliquez sur le bouton Statistiques , puis sur l’espace vide dans la feuille de calcul. Observez les valeurs statistiques de la population du PNCET qui apparaissent.

3. Production des particules HBV dérivées de cultures cellulaires (HBVcc)

1. Culture HepG2.2.15 en milieu complet (DMEM supplémenté avec 10% FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) dans une boîte de Petri de 10 cm pendant 24 h.
2. Remplacer le milieu complet supplémenté par 380 μg/mL de génétique (G418) lorsque l’hépatite HepG2.2.15 atteint une confluence de 60 % à 70 %. Récolter le milieu conditionné tous les 2 jours; conserver le milieu contenant le VHB à 4 °C.
3. Enlevez les débris cellulaires en centrifugeant le surnageant à 5 000 × g, 4 °C pendant 20 min. Prélever le milieu conditionné à l’aide d’une seringue de 20 mL et le filtrer à travers un filtre à faible liaison aux protéines de 0,45 μm pour éliminer les débris cellulaires.
4. Pour concentrer le VHB, diluer 1 volume de concentrateur avec 3 volumes du surnageant filtré de l’étape 3.3 dans un tube centrifuge conique et mélanger soigneusement la solution par inversion de tube. Placer le mélange à 4 °C pendant 1 h. Centrifuger la solution pendant 1 h à 1 500 × g, 4 °C et s’assurer qu’une pastille blanc cassé est visible.
   REMARQUE : Pour chaque tranche de 30 mL de surnageant filtré de l’étape 3.3, ajouter 10 mL du concentrateur pour atteindre 40 mL de volume total.
5. Évaluer le titre du VHB (équivalent du génome) avec le réplicon WT HBV 1,3-mer comme courbe standard allant de 1 × 10² à 1 × 10¹⁰ en utilisant la PCR absolue en temps réel, comme décrit précédemment¹¹.
6. Reconstituer délicatement la pastille dans du FBS et conserver jusqu’à 1 an à −80 °C dans des aliquotes à usage unique.

4. Test d’entrée anti-VHB

1. Maintenir 100 % d’imHC confluent ou HepaRG dans des plaques à 6 puits dans un milieu de maturation (2 % de DMSO dans le milieu E de Williams, 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone et 2 mM de L-glutamine) pendant 2 semaines et changer le milieu 2x par semaine.
2. Aspirer le milieu, puis ajouter la curcumine (10-30 μM) ou 4 μM de cyclosporine A (CsA) diluée avec le milieu E de William pendant 2 h. Aspirer le candidat inhibiteur d’entrée du VHB et le remplacer par 1 mL de milieu E de William contenant 4 % de polyéthylène glycol.
3. Ajouter les particules de VHB au milieu de culture à une multiplicité d’infection (MOI) de 100 par puits et incuber à 37 °C pendant 18 h. Jeter le surnageant, ajouter 2 ml de PBS froid et agiter doucement pour rincer l’ancien milieu avec le VHB non lié.
4. Ajouter 2 ml de milieu complet William’s E et cultiver pendant 7 jours. Aspirer le milieu, laver les cellules avec 1x PBS et fixer les cellules avec 3,7% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Perméabiliser et bloquer les cellules infectées avec une solution bloquante de l’IF (0,2% de Triton X-100 et 3% d’albumine sérique bovine dans du PBS) et les incuber pendant 60 min à température ambiante.
5. Ajouter l’anticorps primaire (antigène central anti-VHB) à 1:200 de dilution dans la solution bloquante et incuber pendant une nuit à 4 °C. Laver les cellules 3 x 1 min avec une solution de lavage (0,5% Tween 20 dans PBS).
6. Ajouter l’anticorps secondaire (dilution 1:500) à la solution bloquante de l’IF, incuber pendant 1 h à température ambiante et laver les cellules 3 x 1 min avec une solution de lavage.
7. Montez l’échantillon avec un support de montage antifade avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et couvrez avec un couvercle en verre. Détecter le signal de fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre DAPI (Ex 352-402 nM et Em 417-477) et d’un filtre PE (Ex 542-582 et Em 604-644), ainsi que d’une lentille d’objectif 20x, et déterminer l’activité d’entrée anti-HBV des composés candidats.

5. Test de liaison aux cellules HBV

1. Maintenir 100 % d’imHC confluent ou HepaRG dans des plaques à 6 puits dans un milieu de maturation (2 % de DMSO dans le milieu E de Williams, 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline, 50 μM d’hydrocortisone et 2 mM de L-glutamine) pendant 2 semaines et changer le milieu 2x par semaine.
2. Aspirer le milieu, puis ajouter de la curcumine (10-30 μM) ou de la cyclosporine A (4 μM) diluée dans le milieu E de William pendant 2 h. Aspirer l’inhibiteur d’entrée du VHB et le remplacer par 1 mL de milieu E de William contenant 4 % de polyéthylèneglycol.
3. Ajouter les particules de VHB au milieu de culture à une MOI de 100 par puits et incuber à 4 °C pendant 2 h pour permettre la liaison du VHB aux hépatocytes. Jeter le milieu contenant le VHB non lié, ajouter 2 mL de PBS froid et agiter doucement pour éliminer les traces du milieu usé.
4. Récoltez les cellules infectées à l’aide d’un grattoir cellulaire et perturbez les cellules avec un tampon de lyse. Transférer le lysat dans un tube de prélèvement et extraire l’ADN total pour évaluer l’ADN du VHB en utilisant la PCR en temps réel avec des amorces spécifiques pour le VHB (amorce directe: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', et amorce inverse: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') en utilisant PRNP (amorce avant: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', amorce inverse: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') comme contrôle interne.
5. Amplifier les produits de PCR dans un thermocycleur en utilisant les conditions de température décrites à l’étape 2.1.
6. Calculer les taux relatifs d’ADN du VHB/1 × 10⁶ cellules dans le traitement par rapport au contrôle en utilisant PRNP comme gène calibrateur basé sur la méthode ^2-ΔΔCT .

6. Test d’absorption de l’acide taurocholique (TCA)

1. Maintenir 100% de cellules confluentes imHC et HepaRG dans le milieu de maturation pendant 14 jours.
2. Aspirer le milieu et laver les hépatocytes avec 1x PBS. Ajouter la curcumine ou la cyclosporine A (10-50 μM) diluée dans le milieu E de William pendant 2 h. Remplacer le milieu par la solution d’acide taurocholique sodique (0,5 M d’hydrate de taurocholate de sodium dans 1x HEPES) et incuber pendant 15 min à température ambiante.
3. Aspirer la solution d’acide taurocholique sodique et laver 3x avec froid 1x HEPES. Ajouter 300-500 μL de froid 1x HEPES et récolter les cellules avec des grattoirs cellulaires sur de la glace.
4. Homogénéiser les cellules par ultrasons à une fréquence de 20 kHz pendant 20 s et incuber sur glace pendant 5 min. Centrifuger les lysats à 10 000 × g pendant 20 min pour précipiter les débris cellulaires. Prélever le surnageant et évaluer la concentration intracellulaire d’acide taurocholique à l’aide d’une trousse de dosage TCA ELISA (voir le tableau des matériaux).

7. Détermination des interactions protéine-ligand par titrage calorimétrique isotherme

REMARQUE : Ce système d’analyse a été développé à partir du logiciel MicroCal PEAQ-ITC (ITC).

1. Préparer le tampon (tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,0).
2. Préparer 15 μM de NTCP dans le tampon.
3. Préparer des solutions candidates d’inhibiteur d’entrée du VHB de 150 μM dans le tampon.
4. Lavez la cellule d’échantillon, la cellule de référence et la seringue dans l’instrument ITC à l’aide du tampon (étape 7.1.).
   1. Lancez le logiciel ITC en double-cliquant sur l’icône du logiciel dans les systèmes Windows. Sous l’onglet Run experiment highlight (Exécuter la mise en surbrillance de l’expérience), sélectionnez microCal Method for 19 Injection.itcm (Méthode microCal pour 19 Injection.itcm) et cliquez sur Open (Ouvrir). Lorsqu’une nouvelle fenêtre s’ouvre, cliquez sur l’onglet Nettoyer, et dans la fenêtre Méthode de nettoyage, sélectionnez le bouton Lavage pour Méthode de nettoyage des cellules et le bouton Rincer pour Méthode de nettoyage à la seringue. Cliquez sur Suivant et suivez les instructions à l’écran.
      REMARQUE: L’étape de lavage peut prendre 1,4 heure.
5. Charger l’échantillon dans l’ITC; sous l’onglet Exécuter l’expérience , cliquez sur le bouton Charger et lisez les instructions à l’écran. Cliquez sur suivant et suivez les instructions vidéo jusqu’à ce que cette étape de chargement soit terminée.
   1. Remplir la cellule de référence avec un tampon de solution à l’aide d’une seringue. Remplir la cellule d’échantillon avec 15 μM de PNCE dans un tampon à l’aide d’une seringue et retirer l’excès de solution de PNCNT sur la cellule d’échantillon. Remplissez la seringue avec une solution de curcumine (ligand) de 150 μM, en évitant les bulles d’air dans la seringue.
6. Exécutez l’exemple et, sous l’onglet Run Experiment (Exécuter l’expérience ), cliquez sur le bouton Run (Exécuter ). Observez les fenêtres sur le côté gauche montrant les informations expérimentales et le cadre expérimental. Entrez les concentrations de ligand et de protéines comme 150 μM dans [ Syr], 15 μM dans [Cell] et 25 °C en température.
7. Dans le logiciel, cliquez sur Démarrer pour effectuer le processus d’injection et attendez 1,4 h pour que l’interaction protéine-ligand soit terminée.
   REMARQUE: Le bouton d’analyse fané apparaît sous les fenêtres du logiciel.
8. Observez que le bouton d’analyse s’éclaircit une fois l’injection terminée. Cliquez sur le bouton d’analyse dans le logiciel de contrôle pour analyser les données brutes à l’aide du logiciel d’analyse . Cliquez sur Vue d’ensemble pour afficher les données brutes et choisissez le modèle d’ajustement comme un ensemble de site de liaison.
9. Assurez-vous que l’état de liaison affiche les données expérimentales (données de liaison, d’absence de liaison, de contrôle ou de vérification) et que les valeurs d’expérience (K_D, ΔG, ΔH, TΔS et N) sont présentées sur le panneau du logiciel.
10. Exportez les paramètres thermodynamiques qui prédisent la liaison d’interaction, y compris la liaison hydrogène, la liaison van der Waals et l’interaction hydrophobe au format tif ou jpeg.
11. Une fois l’expérience terminée, laver la cellule d’échantillon en suivant l’étape 7.4.

8. Analyse statistique

1. Effectuer toutes les expériences dans trois répétitions indépendantes (n = 3).
2. Présenter les données expérimentales comme moyen ± SD et effectuer des analyses statistiques à l’aide du logiciel d’analyse statistique souhaité.
3. Utilisez un test t de Students bilatéral non apparié pour comparer deux valeurs moyennes ou appliquez une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec Dunnett pour des comparaisons multiples entre plusieurs valeurs et une valeur de contrôle. Définissez le seuil de signification à p ≤ 0,05.

Résultats

Des caractéristiques de maturation hépatique ont été observées, y compris des cellules binucléées et une morphologie de forme polygonale (Figure 1), en particulier au stade différencié de l’HCi (Figure 1A). Une forte augmentation de l’expression du PNNT a été mesurée dans le d-HepaRG et le d-imHC à 7 fois et 40 fois, respectivement (Figure 1B). La forme hautement glycosylée du PNCP, supposée conférer une suscepti...

Discussion

L’infection par le VHB est initiée par une liaison de faible affinité aux protéoglycanes sulfate d’héparane (HSPG) sur les hépatocytes²⁵, suivie de la liaison au PNCP avec internalisation ultérieure par endocytose²⁶. Comme le PNCP est un récepteur crucial pour l’entrée du VHB, cibler l’entrée du VHB peut être cliniquement traduit pour diminuer l’infection de novo , la transmission mère-enfant (TME) et la récidive après une transplantation hé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved	Thermo Fisher Scientific	HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line	Merck	SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution	FUJIFLIM Wako chemical	163-20145
BD Perm/Wash buffer	BD Biosciences	554723	Perm/Wash buffer
Cyclosporin A	abcam	59865-13-3
EDTA	Invitrogen	15575-038	8 mM
G 418 disulfate salt	Merck	108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x)	Thermo Scientific	78425
HEPES	Merck	7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits	GE Healthcare	25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit	GE Healthcare	25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit	Kapa Biosystems	KK4600
Lenti-X Concentrator	Takara bio	PT4421-2	concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate	Merck	WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal	Kapa Biosystems	KK4600
Nucleospin DNA extraction kit	macherey-nagel	1806/003
Phosphate buffered saline	Merck	P3813
Polyethylene glycol 8000	Merck	25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo scientific	P36930
Recombinant NTCP	Cloud-Clone	RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)	Merck	20-188
TCA	Sigma	345909-26-4
TCA Elisa kit	Mybiosource	MB2033685
Triton X-100	Merck	9036-19-5
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Dilute to 0.125%
Antibodies
Anti-NTCP1 antibody	Abcam	ab131084	1:100 dilution
Anti-GAPDH antibody	Thermo Fisher Scientific	AM4300	1:200,000 dilution
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	Abcam	ab205718	1:10,000 dilution
HRP goat anti-mouse secondary antibody	Abcam	ab97023	1:10,000 dilution
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
1x TBST
3% BSA	Sigma	A7906-100G	Working concentration: 3%
Sodium azide	Sigma	199931	Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
DME/F12	Gibco	12400-024
10% FBS	Sigma Aldrich	F7524
1% Pen/Strep	HyClon	SV30010
1% GlutaMAX	Gibco	35050-061
Hepatic maturation medium
Williams’ E medium	Sigma Aldrich	W4125-1L
10% FBS	Sigma Aldrich	F7524
1% Pen/Strep	HyClon	SV30010
1% GlutaMAX	Gibco	35050-061
5 µg/mL  Insulin	Sigma Aldrich	91077C-100MG
50 µM hydrocotisone	Sigma Aldrich	H0888-1g
2% DMSO	PanReac AppliChem	A3672-250ml
IF Blocking solution
1x PBS	Gibco	21300-058
3% BSA	Sigma	A7906-100G	Working concentration: 3%
0.2% Triton X-100	Sigma	T8787	Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution	Merck	20-188	Final concentration: 1X
Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78425	Final concentration: 1X
Na3VO4			Final concentration: 1 mM
PMSF			Final concentration: 1 mM
NaF			Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Tween 20	Merck	9005-64-5
1x TBST			0.1% Tween 20
1x PBS	Gibco	21300-058
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A53225
Polyacrylamide gel	Bio-Rad	161-0183
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	161-0700	Final concentration: 0.05%
TEMED	Bio-Rad	161-0800	Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	161-0737	Final concentration: 1X
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
1x TBST
5% Skim milk (nonfat dry milk)	Bio-Rad	170-6404	Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Glycine	Sigma	G8898	14.4 g
SDS	Merck	7910	Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Glycine	Sigma	G8898	7.2 g
Methanol	Merck	106009	100 mL
Mild stripping solution 1 L			Adjust pH to 2.2
Glycine	Sigma	G8898	15 g
SDS	Merck	7910	1 g
Tween 20	Merck	9005-64-5	10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube	Corning	430052
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
Airstream Class II	Esco	2010621	Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator	Esco	2170002	Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector	Bio-Rad	1855196
FACSVerse Flow Cytometer	BD Biosciences	651154
Graduated pipettes (10 mL)	Jet Biofil	GSP010010
Graduated pipettes (5 mL)	Jet Biofil	GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC	Malvern		Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658004	Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper	Bio-Rad	1703932
Omega Lum G Imaging System	Aplegen	8418-10-0005
Pipette controller	Eppendorf	4430000.018	Easypet 3
PowerPac HC	Bio-Rad	1645052	Power supply
PVDF membrane	Merck	IPVH00010
T-75 cell culture flask	Corning	431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	1703940	Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)	Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge	Esco	T1000R	Centrifuge with swinging bucket rotar