Imagerie confocale et super-résolution du trafic intracellulaire polarisé et de la sécrétion de protéines de la membrane basale au cours de l’oogenèse de la drosophile

Résumé

La membrane basale est essentielle à la morphogenèse des tissus et des organes pendant le développement. Pour mieux comprendre les mécanismes conduisant à un placement correct de cette structure, le protocole présenté décrit des méthodes pour visualiser et caractériser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale dans les cellules épithéliales en utilisant la microscopie confocale et super-résolution.

Résumé

La membrane basale (BM) - une feuille spécialisée de matrice extracellulaire présente du côté basal des cellules épithéliales - est essentielle à l’établissement et au maintien de la morphologie des tissus épithéliaux et de la morphogenèse des organes. De plus, le BM est essentiel pour la modélisation des tissus, servant de plate-forme de signalisation et fournissant des forces externes pour façonner les tissus et les organes. Malgré les nombreux rôles importants que joue le BM au cours du développement normal et des conditions pathologiques, les voies biologiques contrôlant le trafic intracellulaire des vésicules contenant du BM et la façon dont la sécrétion basale conduit au dépôt polarisé de protéines BM sont mal comprises. L’épithélium folliculaire de l’ovaire de la drosophile est un excellent système modèle pour étudier le dépôt basal des protéines membranaires BM, car il produit et sécrète tous les principaux composants du BM. L’imagerie confocale et super-résolution combinée au traitement d’images dans des tissus fixes permet l’identification et la caractérisation des facteurs cellulaires spécifiquement impliqués dans le trafic intracellulaire et le dépôt de protéines BM. Cet article présente un protocole détaillé pour la coloration et l’imagerie des vésicules contenant du BM et du BM déposé à l’aide de protéines marquées de manière endogène dans l’épithélium folliculaire de l’ovaire de la drosophile . Ce protocole peut être appliqué pour répondre à des questions qualitatives et quantitatives et il a été développé pour permettre un criblage à haut débit, permettant l’identification rapide et efficace des facteurs impliqués dans le trafic intracellulaire polarisé et la sécrétion de vésicules pendant le développement du tissu épithélial.

Introduction

La membrane basale (BM) est une fine feuille de matrice extracellulaire adhérente aux cellules (ECM) en couches essentielle à la structure épithéliale et à la morphogenèse¹. Il comprend environ 50 protéines et se trouve partout sous-jacent aux cellules épithéliales et endothéliales, ainsi qu’aux cellules squelettiques, lisses et cardiaques et aux adipocytes ^1,2,3. Les trois principaux composants du BM du côté basal des cellules épithéliales sont le collagène IV, le perlécan et les laminines. Le BM sous-tend les cellules épithéliales et est responsable de nombreuses fonctions, y compris la séparation et la barrière tissulaires, la croissance et le soutien, et la polarisation cellulaire ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Son rôle en tant que plate-forme de signalisation régule la morphologie et la différenciation des cellules et tissus épithéliaux au cours du développement ^3,13,14. De plus, la mauvaise régulation du BM et/ou une atteinte à son intégrité sont les principales causes de nombreuses affections pathologiques, notamment les métastases tumorales ^2,15,16. Malgré les fonctions essentielles exercées par le BM lors de la morphogenèse des tissus et des organes, les composants de la ou des voies biologiques dédiées au trafic intracellulaire polarisé et à la sécrétion de protéines BM sont vaguement connus.

Pour étudier le trafic intracellulaire des vésicules contenant du BM et la sécrétion de protéines BM par les cellules épithéliales, l’épithélium folliculaire (FE) de l’ovaire de la drosophile est un puissant système modèle (Figure 1). Un ovaire de drosophile comprend 16 à 20 longues structures tubulaires, appelées ovarioles (Figure 1A,B)17,18,19. Chaque ovariole peut être considérée comme une chaîne d’assemblage d’œufs, avec la progression de l’âge des chambres d’œufs (qui donnent chacune naissance à un œuf) qui commence à l’extrémité antérieure et se déplace postérieurement, jusqu’à ce que l’œuf mature sorte par l’oviducte. Chaque chambre à œufs est encapsulée par le FE, une monocouche de cellules folliculaires somatiques (FC), qui entoure les cellules germinales centrales (GC). Le FE est fortement polarisé avec une polarité apicale-basale distincte où le domaine apical fait face à la lignée germinale, et les protéines BM sont sécrétées à la base^18,19. Les FC sécrètent activement tous les principaux composants du BM, y compris le collagène IV, le perlécan et les laminines^20,21. Dans les cellules épithéliales telles que les FC, les composants BM sont produits et nécessitent une voie de sécrétion polarisée spécialisée pour leur dépôt extracellulaire. Par exemple, dans le cas du composant le plus abondant du BM, le collagène IV (Coll IV), les détails entourant son trafic intracellulaire polarisé et sa sécrétion sont vagues bien que sa production et son dépôt fassent l’objet de nombreuses études. Coll IV est traduit dans le réticulum endoplasmique (RE), où chaque fibrille - composée de trois polypeptides (deux chaînes α1 et une chaîne α2) - est assemblée en une triple hélice²². Le repliement et le fonctionnement appropriés de Coll IV nécessitent des chaperons et des enzymes ER, y compris des lysyl et des prolyl-hydroxylases telles que Plod et PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Ces enzymes post-traductionnelles régulent le tri ER de Coll IV, car la perte de chacune provoque le piégeage de Coll IV dans l’ER basal 20,23,24,25,26. Ensuite, coll IV nouvellement synthétisé sort de l’urgence pour le Golgi dans des vésicules enrobées de COPII. Le récepteur de cargaison Tango1 aide à emballer les collagènes dans d’importantes vésicules liées à Golgi qui peuvent accueillir^de grandes protéines multimériques ^20,27. Une fois que Coll IV est emballé dans des vésicules exocytaires intracellulaires, il est spécifiquement sécrété par voie basale à partir de cellules épithéliales. Pour diriger le dépôt de BM vers le côté basal, les cellules épithéliales ont besoin d’un autre ensemble de facteurs spécifiquement dédiés à la sécrétion de BM polarisée. En utilisant l’EF de l’ovaire de la drosophile, quelques composants de ce nouveau processus cellulaire ont été caractérisés, y compris les facteurs d’échange de nucléotides (GEF) Crag et Stratum, les GTPases Rab8 et Rab10, ainsi que les niveaux de phosphoinositide PI(4,5)P2 et de protéines motrices Kinesin 1 et 3 20,28,29,30,31 . Ces composants sont essentiels pour assurer la distribution polarisée des protéines BM.

Pour surveiller la localisation intracellulaire des protéines BM dans la FE, des protéines de membrane basale marquées de manière endogène (pièges à protéines), telles que Viking-GFP (Vkg-GFP ou α2 Coll IV-GFP) et Perlecan-GFP (Pcan-GFP) peuvent être utilisées^32,33. Il a été démontré que ces lignées de pièges protéiques reflètent avec précision la distribution endogène des protéines BM et permettent une détection plus sensible du trafic^{vésiculeux 28,30}. Les composants impliqués dans le dépôt polarisé de BM dans le FE ont d’abord été caractérisés à l’aide de raies pièges protéiques pour Vkg-GFP et Pcan-GFP ^20,28,29,30. Les pièges à protéines peuvent être utilisés dans différents contextes génétiques, y compris les mutants et les lignées Gal4 ³⁴. De plus, les pièges à protéines peuvent être utilisés en combinaison avec des colorants fluorescents et/ou une immunocoloration par fluorescence, ce qui permet une caractérisation précise de la localisation des protéines BM lors de la comparaison des conditions de type sauvage et mutantes³⁵.

Pour évaluer avec précision et efficacité la distribution et la localisation des vésicules contenant des protéines BM, la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et les techniques d’imagerie à super-résolution présentent un avantage significatif par rapport aux autres approches d’imagerie. Ces approches associent l’imagerie haute résolution à une relative facilité d’utilisation. CLSM est une technique de microscopie qui permet d’améliorer la résolution optique en scannant l’échantillon avec un laser de manière raster à l’aide de galvanomètres. L’ouverture du sténopé est un composant central d’un microscope confocal. En bloquant les signaux flous provenant d’au-dessus ou au-dessous du plan focal, l’ouverture du sténopé se traduit par une résolution très supérieure dans l’axe z³⁶. Cela permet également d’obtenir une série d’images dans le plan z, appelée z-stack, correspondant à une série de sections optiques. z-stacks crée ensuite une image 3D du spécimen, via une reconstruction 3D, à l’aide d’un logiciel d’imagerie. Les microscopes à épifluorescence conventionnels (grand champ), contrairement aux microscopes confocaux, permettent à la lumière floue de contribuer à la qualité de l’image, en diminuant la résolution de l’image et le contraste^36,37. Cela fait de la microscopie à épifluorescence un candidat moins attrayant lors de l’étude de la localisation ou de la colocalisation des protéines.

Bien que le CLSM soit une approche appropriée pour diverses applications, y compris l’imagerie et la caractérisation du trafic intracellulaire des protéines BM, il présente toujours un problème lors de l’imagerie d’échantillons en dessous de la limite de diffraction de la lumière d’Abbe (200-250 nm). Lors de l’imagerie de tels échantillons, la microscopie confocale, en particulier lors de l’utilisation d’un objectif d’huile, peut entraîner une haute résolution. Cependant, les techniques de super-résolution dépassent la limite de la microscopie confocale. Il existe différentes approches pour obtenir une microscopie à super-résolution, chacune avec des limites de résolution spécifiques, et chacune appropriée pour différentes analyses. Ces approches comprennent la microscopie de localisation photoactivée (PALM) ou la microscopie à reconstruction optique stochastique (STORM), la microscopie à épuisement par émission stimulée (STED), la microscopie à éclairage structuré (SIM) et la microscopie Airyscan (super-résolution) ^{38,39,40,41,42,43,44,45,46} . Bien qu’Airyscan ait une résolution plus grossière que PALM/STORM, STED et SIM, il peut toujours atteindre une résolution allant jusqu’à ~ 120 nm (environ deux fois la résolution de CLSM). En outre, il a été démontré que cette approche de microscopie à super-résolution présente un avantage sur la carte SIM et d’autres techniques de super-résolution lors de l’imagerie d’échantillons épais et d’échantillons avec un faible rapport signal/bruit^47,48.

Airyscan est une technologie de microscopie confocale à super-résolution relativement nouvelle⁴⁶. Contrairement aux CLSM traditionnels, qui utilisent les détecteurs sténopé et monopoint pour rejeter la lumière floue, cette approche à super-résolution utilise un détecteur de zone de tube photomultiplicateur à 32 canaux de phosphure d’arséniure de gallium (GaAsP) qui recueille toute la lumière à chaque position de balayage⁴⁵. Chacun des 32 détecteurs fonctionne comme un petit sténopé, réduisant la taille du sténopé de l’unité aérée (A.U.) traditionnelle de 1,0 à une unité d’AIR améliorée de 0,2 A.U., permettant une résolution et un rapport signal/bruit encore plus élevés, tout en maintenant l’efficacité d’un diamètre de 1,25 A.U.^{de 45}. De plus, la déconvolution linéaire utilisée par Airyscan se traduit par une augmentation jusqu’à 2 fois de la résolution⁴⁵. Compte tenu de cela, clSM, et en particulier la microscopie à super-résolution, sont bien adaptés pour étudier les protéines BM et les protéines qui régulent le dépôt basal des protéines BM, car ils peuvent produire des images à très haute résolution pour les études de localisation et de colocalisation, fournissant ainsi de nouvelles informations sur les événements spatiaux, temporels et moléculaires qui contrôlent ces processus.

Une autre approche de la microscopie confocale qui peut être utilisée pour effectuer des expériences de localisation est la déconvolution d’image. Étant donné que la microscopie à grand champ permet à la lumière floue d’atteindre les détecteurs, des algorithmes de déconvolution mathématiques et informatiques peuvent être appliqués pour supprimer ou réaffecter la lumière floue des images obtenues par microscopie à grand champ, améliorant ainsi la résolution et le contraste de l’image⁴⁹. Les algorithmes de déconvolution peuvent également être appliqués aux images confocales pour augmenter encore la résolution et le contraste, produisant des images finales presque comparables à celles de la microscopie à super-résolution⁵⁰. Airyscan utilise la déconvolution basée sur les filtres Weiner ainsi que la réaffectation des pixels de Sheppard, ce qui se traduit par une résolution spatiale et un rapport signal/bruit considérablement améliorés. Par rapport à la microscopie confocale, une augmentation de 2x de la résolution dans les trois dimensions spatiales (120 nm en x et y, et 350 nm en z) est observée lors de l’utilisation de cette technique de microscopie à super-résolution^45,51.

Ce manuscrit fournit des protocoles détaillés et optimisés pour colorer, acquérir et visualiser le trafic intracellulaire et le dépôt de protéines BM en utilisant l’EF de l’ovaire de la drosophile comme système modèle couplé à la microscopie confocale et à super-résolution. Les lignées de drosophiles exprimant des protéines de membrane basale marquées de manière endogène, par exemple Vkg-GFP et Pcan-GFP, sont des outils efficaces et précis pour visualiser le trafic et la sécrétion de protéines BM. En outre, ils peuvent être facilement utilisés dans différents contextes génétiques, y compris les lignées mutantes et Gal4 / UAS ³⁴. Bien que les protéines de la membrane basale marquées de manière endogène soient recommandées, l’utilisation d’anticorps contre des protéines BM spécifiques est également compatible avec les protocoles décrits. Ces protocoles sont particulièrement utiles pour les scientifiques qui s’intéressent à l’étude du trafic intracellulaire et de la sécrétion de protéines BM dans les tissus épithéliaux intacts à l’aide de l’imagerie confocale et à super-résolution. De plus, la capacité de combiner l’analyse des tissus épithéliaux avec les outils étendus de la génétique de la drosophile rend cette approche particulièrement puissante. Enfin, ces protocoles pourraient être facilement adaptés pour étudier le trafic vésiculeux et le tri d’autres protéines d’intérêt.

Protocole

1. Préparation des mouches pour les dissections ovariennes

1. Mettez 10-15 mouches femelles Drosophila melanogaster (âgées de 1 à 2 jours) du génotype souhaité dans un flacon étroit contenant environ 8 mL de milieu de mouche drosophila saupoudré d’une petite quantité de levure de boulanger granulée 2-3 jours avant la dissection à 25 ° C. L’ajout de quelques mâles au flacon peut augmenter le rendement de la chambre à œufs. Cependant, assurez-vous que le nombre total de mouches ne dépasse pas 20, car cela peut affecter négativement le développement des ovaires.
   NOTE: Une description des hommes et des femmes de la drosophile, ainsi que des conseils et astuces utiles pour les scientifiques sans expérience préalable de la drosophile peuvent être trouvés dans les articles cités^34,52. L’ajout de levure stimulera la production d’ovules et générera des ovaires avec différentes étapes représentées. De plus, il engraissera également les ovaires et les rendra plus faciles à exciser. La levure humide peut également être utilisée à la place de la levure granulée, cependant, pour les stocks plus faibles, les mouches peuvent rester coincées et mourir.

2. Dissection et fixation des ovaires

REMARQUE: Pour des ressources supplémentaires sur la dissection et la coloration des ovaires, les lecteurs sont dirigés vers les protocoles cités 53,54,55.

1. Le jour de la dissection, préparer une solution de fixation fraîche avec une concentration finale de 4% de paraformaldéhyde (PFA) en diluant la solution mère PFA dans 1x solution saline tampon phosphate (PBS).
2. Anesthésiez les mouches à l’aide de CO₂ et placez-les sur un coussinet anti-mouches. Gardez les mouches anesthésiées jusqu’à la dissection. Considérez les mouches correctement anesthésiées une fois que leurs mouvements ont cessé, ce qui prend généralement 10-20 s.
   REMARQUE: Bien que l’utilisation de CO₂ soit recommandée comme une option plus sûre et plus rapide, les mouches peuvent être anesthésiées à l’aide de glace.
3. Placez une lame concave en verre ou un plat de coloration avec des puits de dépression peu profonds sous un microscope à dissection et remplissez les puits avec 1x PBS.
4. Saisissez une mouche femelle au thorax inférieur à l’aide d’une paire de pinces. Assurer le sexe des mouches par l’absence d’organes génitaux masculins à l’extrémité postérieure de l’abdomen et l’absence de peignes sexuels sur leurs pattes antérieures comme caractéristique secondaire⁵². Disséquer les mouches individuellement à l’aide d’une autre paire de pinces (étape 2.5) tout en les immergeant dans des puits remplis de 1x PBS sous le microscope à dissection (un grossissement de 20x est recommandé).
5. Tout en regardant à travers le microscope à dissection, utilisez une autre paire de pinces pour tirer sur la partie postérieure de l’abdomen de la mouche, rendant les organes internes (par exemple, les ovaires, l’intestin) visibles.
6. Pressez doucement la partie antérieure de l’abdomen de la mouche (comme avec un tube de dentifrice) pour forcer les ovaires à sortir de l’abdomen. Cette méthode devrait garder les ovaires intacts. Détachez et retirez soigneusement les autres organes et les débris de mouches.
7. À l’aide de pinces ou d’aiguilles disséquantes, séparez les ovarioles de l’ovaire tout en gardant la structure ovarienne globale intacte. Le but de cette étape est de casser la gaine musculaire recouvrant les ovaires et de permettre une coloration plus efficace et homogène.
8. Transférez rapidement les ovaires dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1x PBS et maintenez le tube sur la glace jusqu’à ce que toutes les mouches soient disséquées. Ne gardez pas le tube sur la glace si des microtubules ou des microfilaments (ou des vésicules trafiquées par ces composants cytosquelettiques) doivent être visualisés, car cela peut provoquer une dépolymérisation.
9. Une fois que tous les ovaires sont disséqués et transférés dans un tube de microcentrifugation, laissez-les couler au fond du tube et retirez tout sauf ~ 50 μL du PBS. Ajouter 1 mL de PFA à 4 % et placer sur une bascule à plate-forme de nutation pendant 15 min. Il est important de vérifier si les ovaires se déplacent d’avant en arrière dans la solution de fixation pour permettre une fixation appropriée, car une fixation incomplète pourrait entraîner des problèmes de coloration et d’imagerie.
   REMARQUE: La vitesse du nutateur n’est pas cruciale. Alors que certains nutateurs ont un contrôle de vitesse, d’autres viennent avec une vitesse prédéfinie. La vitesse prédéfinie est suffisante et, si elle est réglable, réglée sur 40-50 tr / min.
10. Retirez la solution de fixation (comme à l’étape 2.9), puis effectuez deux lavages rapides avec 1 mL de 1x PBS contenant 0,1% de Triton-X 100 (1x PBST), en inversant doucement les tubes de microfuge 5 à 6 fois. Ensuite, procédez à quatre lavages de 10 à 15 minutes (lavage long) avec 1 mL de 1x PBST (40 à 60 minutes au total).
    REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 pour les lavages, car l’augmentation du pourcentage de détergent pourrait entraîner une dénaturation des BPF, entraînant une diminution de la fluorescence et de la détection des protéines BM marquées GFP.
11. Pour la coloration par colorant, par exemple la coloration de l’ADN et de la F-actine, passez à l’étape 3. Pour l’immunocoloration, passez à l’étape 4. Les ovaires peuvent être conservés dans 1x PBST à 4 °C jusqu’à 24 h avant de continuer.

3. Coloration standard de l’ADN / F-Actine

1. Après la fixation et le lavage, retirez le PBST. Ajouter 500 μL d’ADN et de solution de coloration à la F-Actine. Pour préparer la solution d’ADN/F-Actine, mélanger Hoechst (coloration d’ADN; dilution 1:1000 de la solution mère de 1 mg/mL) et phalloïdine marquée au fluorophore (coloration F-actine; dilution 1:500 pour Alexa Fluor 546 ou dilution 1:100 pour Alexa Fluor 647, chacune de solution mère de 66 μM) dans 500 μL de PBST.
2. Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pour garder les ovaires et les colorants dans l’obscurité afin de maintenir la fluorescence pour une imagerie efficace et incubez sur une bascule de plate-forme de nutation pendant 15 minutes.
3. Après l’incubation, retirer la solution d’ADN/F-Actine (comme à l’étape 2.9). Effectuez deux lavages rapides et trois lavages longs (10-15 min) dans 1x PBST comme décrit à l’étape 2.10. Passez au montage comme décrit à l’étape 5.

4. Immunocoloration par fluorescence

REMARQUE: Il s’agit d’un protocole d’immunocoloration standard pour l’imagerie fluorescente et est compatible avec la plupart des anticorps primaires.

1. Blocage et immunocoloration des anticorps primaires (Jour 1)
   1. Après la fixation et le lavage, retirez le PBST comme décrit à l’étape 2.9. Ajouter 1 mL de solution bloquante (PBS + 5% BSA) et bloquer les ovaires sur un bascule à plate-forme de nutation pendant 1 h minimum.
      REMARQUE: En plus de la BSA, du sérum bovin fœtal (FBS) ou du sérum de chèvre normal (NGS) peuvent être ajoutés à la solution bloquante. Alternativement, les ovaires peuvent être bloqués pendant la nuit sur une bascule à plate-forme nutative à 4 ° C.
   2. Retirer la solution bloquante comme à l’étape 2.9 et ajouter 300 μL de solution d’anticorps primaires contenant des anticorps primaires dilués à leurs concentrations appropriées (spécifiques à l’anticorps utilisé) dans la solution bloquante. Incuber toute la nuit sur une bascule à plate-forme de nutation à 4 °C. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaire et procédez à l’immunocoloration des anticorps secondaires.
      REMARQUE: Certains anticorps primaires peuvent être sauvegardés et réutilisés. Dans certains cas, les anticorps primaires réutilisés peuvent réduire la coloration de fond, ce qui se traduit par une meilleure imagerie. Cependant, la réutilisation doit être testée pour chaque anticorps afin d’en assurer l’efficacité.
2. Immunocoloration des anticorps secondaires (Jour 2)
   1. Après avoir retiré la solution d’anticorps primaire, effectuez deux lavages rapides et quatre lavages longs (10-15 min) comme à l’étape 2.10. Des lavages répétitifs soigneusement effectués à l’aide de PBST 1x frais réduiront l’arrière-plan non spécifique et conduiront à une imagerie optimale.
   2. Retirer le PBST comme à l’étape 2.9 et ajouter 500 μL de solution d’anticorps secondaires contenant des anticorps secondaires fluorescents qui détecteront les anticorps primaires utilisés. Protégez le tube de la lumière en le recouvrant de papier d’aluminium à partir de ce moment pour une conservation optimale de la fluorescence, ce qui est essentiel pour l’acquisition et l’analyse d’images.
      REMARQUE: La solution d’anticorps secondaires doit contenir des anticorps secondaires conjugués avec des fluorophores qui ne se chevauchent pas avec des protéines marquées de manière endogène. Par exemple, si vous utilisez des protéines marquées GFP, l’utilisation d’anticorps secondaires Alexa Fluor à des longueurs d’onde rouges ou rouges lointaines est recommandée (par exemple, 546, 568 ou 647 nm). Des colorants fluorescents, tels que la phalloïdine conjuguée Hoechst et Alexa Fluor 546 ou 647, peuvent être ajoutés à la solution secondaire. Ces taches pourraient être utiles pour marquer la structure cellulaire globale (c.-à-d. les noyaux et la F-actine). Reportez-vous à l’étape 3.1 pour connaître les concentrations.
   3. Incuber les ovaires dans la solution d’anticorps secondaire sur un basculeur de plate-forme de nutation pendant 2 h à température ambiante. Effectuez deux lavages rapides et quatre lavages longs (10-15 min) dans 1x PBST comme à l’étape 2.10. Passez au montage comme à l’étape 5.

5. Montage des ovaires tachés

REMARQUE: Cette méthode fonctionne très bien si les ovaires sont bien développés et abondants. Un montage soigneux des ovaires sur la lame est essentiel pour une imagerie optimale.

1. Après le dernier lavage, utilisez une pipette p1000 pour pipeter doucement les ovaires de haut en bas dans le tube afin de séparer les chambres à œufs. Laissez les chambres à œufs couler au fond en maintenant le tube en position verticale pendant 5 à 10 minutes. Une séparation minutieuse des chambres à œufs individuelles est essentielle pour obtenir une acquisition d’image optimale.
2. Retirez le PBST à l’aide d’un tuyau Pasteur, en laissant ~50 μL. Retirez autant que possible le PBST restant à l’aide d’une pipette p200. Ajouter deux gouttes de support de montage, assez pour répartir uniformément sur un couvercle de 22 mm x 22 mm. Les ovaires peuvent être stockés dans un milieu de montage dans des tubes de microcentrifugation à 4 °C jusqu’à 1 mois avant le montage.
   REMARQUE: Plusieurs supports de montage différents sont disponibles dans le commerce; l’utilisation de supports à réglage dur, tels que Aqua-Poly/Mount ou ProLong Glass Antifade Mountant, est recommandée pour obtenir des conditions d’imagerie optimales. L’utilisation du glycérol comme milieu de montage est déconseillée car elle peut entraîner de mauvaises conditions d’imagerie (p. ex. instabilité du fluorophore). Pour les supports de montage qui ne polymérisent pas, scellez le couvercle à l’aide d’un scellant de couvercle / vernis à ongles pour le fixer en place.
3. Étiquetez une lame de verre et essuyez-la avec du papier doux et sans poussière pour éliminer la poussière et les empreintes digitales. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette p200 pour permettre un transfert facile du milieu de montage visqueux vers la glissière du tube de microcentrifugation. Ensuite, transférez lentement toutes les chambres à œufs du support de montage sur la lame de verre, en veillant à ne pas créer de bulles.
4. Sous un microscope à dissection, étalez doucement le milieu de montage et séparez les chambres à œufs à l’aide d’une nouvelle pointe ou d’une pince p200 pour couvrir une zone de la taille approximative de la lèvre de couverture.
5. À l’aide d’une pince, placez soigneusement le couvercle (nettoyé avec du papier sans poussière) sur les chambres à œufs en angle pour éviter les bulles.
6. Conservez la lame à température ambiante sur une surface plane dans l’obscurité pendant 2 jours pour polymériser. Une fois le support de montage durci, la lame peut être stockée à 4 °C dans l’obscurité pendant quelques semaines pour l’imagerie.
   REMARQUE: Il est important que le support de montage à réglage dur se polymérise avant l’imagerie. Si le milieu n’a pas encore polymérisé, les ovaires flotteront sous le couvercle, ce qui affectera l’acquisition de l’image. De plus, l’indice de réflexion optimal des supports de montage n’est atteint qu’après leur réglage complet (voir les informations du fabricant pour plus de détails).
7. Méthode de montage alternative: Cette méthode est recommandée pour réduire la perte de tissu si les ovaires ne sont pas abondants. Dans cette méthode (décrite ci-dessous), séparer les ovarioles et les chambres à œufs sur la glissière pendant le montage, au lieu de les séparer dans un tube de microcentrifugation par pipetage comme décrit à l’étape 5.1.
   1. Après le dernier lavage, retirez tout sauf ~100 μL de la solution de lavage. À l’aide d’une pipette Pasteur ou d’une pipette p1000, transférez les ovaires intacts dans pbS sur la lame. À l’aide d’une pipette p200, retirez soigneusement autant de PBST que possible de la glissière. Utilisez un papier sans poussière pour essuyer le PBST, si nécessaire. Ne touchez pas les ovaires.
   2. Ajoutez deux gouttes de support de montage. Séparez soigneusement les ovarioles et les chambres à œufs à l’aide d’une pince ou d’aiguilles disséquantes. Retirez et jetez les tissus étrangers, puis étalez les chambres à œufs et les ovarioles dans le milieu de montage. Passez aux étapes 5.5 à 5.6.

6. Acquisition d’images confocales

REMARQUE: Cette section fournit des paramètres clés pour obtenir une acquisition d’image optimale à l’aide de n’importe quel microscope confocal (Figure 2).

1. Configurez le microscope et localisez l’échantillon comme décrit ci-dessous.
   1. Avant l’imagerie, il est crucial de localiser la région d’intérêt (ROI) à l’aide de l’oculaire du microscope à fluorescence. Utilisez un objectif à faible grossissement (20x) ou l’objectif à utiliser pour l’acquisition d’images (c.-à-d. 40x ou 63x). Sélectionnez une chambre à œufs à imager.
      REMARQUE: Pour l’acquisition d’images, il est recommandé d’utiliser des objectifs de grossissement élevés tels que 40x ou 63x (voir 6.2.1).
   2. Une fois le retour sur investissement sélectionné, passez à l’acquisition d’images; passez à l’étape 6.2 pour l’imagerie confocale et à l’étape 7 pour l’imagerie à super résolution.
2. Sélectionnez les paramètres clés pour une acquisition d’image optimale comme décrit ci-dessous (des exemples de paramètres clés pour les images représentatives sont donnés dans le tableau 1).
   1. Sélection d’un objectif : Pour l’acquisition d’images confocales du trafic intracellulaire et de la sécrétion de protéines BM dans l’EF, utilisez un objectif 40x ou 63x.
      REMARQUE: Pour obtenir la meilleure résolution possible, l’utilisation d’objectifs Plan-Apochromat, avec une ouverture numérique élevée (NA) qui fournissent la correction achromatique la plus élevée, est fortement recommandée.
   2. Sélection de lasers pour chaque canal / piste: Pour GFP, utilisez un laser 488 nm; pour DAPI ou Hoechst, utilisez le laser 405 nm; pour Alexa Fluor 546 ou 568, utilisez le laser 561 nm; et pour Alexa Fluor 647, utilisez le laser 640 nm.
      REMARQUE: Chaque sélection laser entraînera une formation de canal / piste différente. Ici, le terme canal fait référence à l’image formée par la distribution d’intensité enregistrée pour les fluorophores excités pour le retour sur investissement sélectionné à la longueur d’onde spécifique de chaque canal.
   3. Réglage du sténopé : pour réduire la lumière floue lors de l’acquisition d’image, réglez le sténopé pour chaque canal sur 1 UA.
   4. Paramètres d’intensité laser et de gain du détecteur : Pour affiner la sensibilité de l’image, utilisez à la fois le gain maître du détecteur et la puissance laser. Pour régler correctement la sensibilité de l’image, un indicateur de plage est recommandé. Réglez à la fois le gain principal et la puissance laser pour qu’ils aient une sensibilité appropriée où les structures d’intérêt (par exemple, les vésicules contenant du BM) sont clairement visibles tout en évitant la saturation du détecteur.
      REMARQUE: Pour éviter le photoblanchiment, utilisez la puissance laser minimale nécessaire. Il est recommandé d’augmenter d’abord le gain du détecteur tout en utilisant la puissance laser la plus faible possible. Si une augmentation du gain du détecteur ne peut pas atteindre l’intensité souhaitée, augmentez la puissance du laser. L’intensité de la puissance laser entre 0,5% et 1,2% est recommandée.
   5. Taille du cadre : il est recommandé d’utiliser la taille d’image optimale déterminée par le logiciel d’acquisition. Pour la plupart des applications, utilisez une résolution maximale de 1024 x 1024. Une résolution plus élevée augmentera considérablement le temps d’acquisition.
   6. Vitesse de numérisation: Utilisez une vitesse de numérisation comprise entre 6 et 9, ce qui est sûr pour la plupart des échantillons. Si l’échantillon est bruyant, utilisez une vitesse de balayage plus lente pour améliorer les rapports signal/bruit. Cependant, les faibles vitesses de numérisation augmentent le temps de photoblanchiment et d’acquisition.
   7. Moyenne de l’intensité moyenne : Pour améliorer la qualité de l’image, utilisez la moyenne de l’intensité moyenne via des numérisations successives avec des paramètres identiques. Dans la plupart des cas, utilisez une moyenne de deux pour améliorer les rapports signal/bruit sans photoblanchiment de l’échantillon.
   8. Zoom : ajustez la zone de numérisation à l’aide de la fonction de zoom. Utilisez un zoom entre 2x-4x avec des objectifs 40x et 63x comme valeur la plus efficace pour visualiser clairement les vésicules contenant du BM dans la FE. Sélectionnez soigneusement le retour sur investissement minimal pour réduire le temps d’acquisition.
3. Pour acquérir une pile z à l’aide du logiciel Zeiss Zen, utilisez les paramètres de section Z suivants et définissez-les comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE: Les vésicules et autres structures intracellulaires contenant des protéines BM sont des structures en 3 dimensions (3D). L’acquisition d’une pile z via le FE améliorera considérablement la qualité et la résolution de l’image. Habituellement, une plage couvrant l’épaisseur / profondeur du tissu est suffisante pour visualiser efficacement la localisation intracellulaire. Pour une reconstruction 3D optimale, il est recommandé d’utiliser l’intervalle optimal déterminé par le logiciel. Pour les objectifs 40x et 63x, évitez les intervalles supérieurs à 0,5 μm entre chaque section z pour permettre une reconstruction 3D optimale.
   1. Cliquez sur la case à cocher z-Stack dans la zone principale sous l’onglet Acquisition . Sélectionnez le mode d’analyse Toutes les pistes par tranche pour la pile z. Cela entraînera une modification des pistes de canal pour chaque tranche de position z.
   2. Sélectionnez le canal souhaité pour observer l’échantillon et cliquez sur Live pour lancer un scan en direct. L’utilisation du canal nécessaire pour détecter la protéine BM marquée GFP est recommandée.
   3. Définissez une plage pour la pile z comme décrit. À l’aide du bouton de réglage fin du microscope, trouvez l’emplacement z d’une extrémité de l’échantillon et cliquez sur Définir en premier. De même, trouvez l’emplacement z pour l’autre extrémité de l’échantillon et cliquez sur Définir en dernier.
   4. Pour chaque emplacement de la pile z, cliquez sur chaque canal séparément avec l’indicateur de plage sélectionné et ajustez l’intensité du laser et le gain principal selon les besoins, comme décrit à l’étape 6.2.4.
   5. Définissez l’intervalle pour que la pile z attribue la taille d’étape comme recommandé dans la NOTE ci-dessous l’étape 6.3. Cliquez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition de z-stack.

7. Acquisition d’images en super-résolution

1. Sélectionnez un objectif compatible Airyscan. Pour visualiser la localisation intracellulaire de la protéine BM, l’utilisation d’un objectif d’huile 63x est optimale (Figure 3). Réglez l’objectif sur 63x et placez doucement une goutte d’huile d’immersion sur son objectif. Positionnez la glissière sur l’objectif avec le couvercle orienté vers l’objectif pour localiser l’échantillon.
2. Sélectionnez une configuration avec les paramètres appropriés pour le fluorophore à imager comme décrit ci-dessous.
   1. Cliquez sur le bouton Smart Setup dans l’onglet Acquisition pour configurer une nouvelle expérience. Sélectionnez Airyscan (super-résolution); lorsque cette option est sélectionnée, une sélection supplémentaire entre résolution (Airyscan SR), SNR/sensibilité (Airyscan Confocal) et vitesse (Multiplex SR-2Y) sera requise. Pour les tissus fixes , sélectionnez Résolution car cela se traduira par la meilleure acquisition.
   2. Cliquez sur + dans la zone Configurer votre expérience pour ajouter des pistes/canaux. Sélectionnez les pistes pour des colorants spécifiques dans la base de données des colorants. Pour une expérience multicanal, ajoutez chaque piste au besoin en sélectionnant les colorants appropriés.
   3. Une fois toutes les pistes ajoutées, sélectionnez l’une des propositions d’expérience fournies par le logiciel. Pour cette expérience, utilisez Best Signal, car bien que la vitesse soit un peu plus lente par rapport à la proposition Smartest (Line), elle créera les meilleurs paramètres matériels pour chaque colorant, ce qui se traduira par un gain de signal maximal et une diaphonie d’émission minimale. Une fois l’expérience définie et chargée, elle apparaît dans la fenêtre Configuration de la création d’image de l’onglet Acquisition.
   4. Une fois qu’une configuration intelligente est sélectionnée, la gamme de longueurs d’onde du détecteur GaAsP-PMT sera automatiquement sélectionnée. Ajustez la plage en déplaçant la barre de défilement en bas pour augmenter ou diminuer la plage ou déplacez complètement la plage vers une autre région selon les besoins. Utilisez-le pour vous assurer que les plages de deux canaux différents ne se chevauchent pas pour éviter la diaphonie. Enregistrez la configuration pour la réutiliser à l’avenir.
3. Une fois la configuration définie, ajustez le zoom et la zone de numérisation comme à l’étape 6.2.8. Optimisez la zone d’analyse pour vous concentrer sur la région d’intérêt afin de réduire le temps d’analyse et l’espace de stockage. Procéder à l’acquisition d’images.
4. Pour chaque chaîne individuelle, sélectionnez une piste sous Chaîne et cliquez sur Live. Ajustez le gain principal et la puissance du laser à l’aide de l’outil indicateur de portée décrit à l’étape 6.2.4 et suivez toutes les directives décrites pour éviter les pixels saturés. Vérifiez que la vue hexagonale du détecteur est centrée et alignée en cliquant sur le bouton Airyscan Detector View . Dans la plupart des cas, la vue hexagonale du détecteur est automatiquement centrée et alignée. Répétez l’opération pour d’autres canaux.
5. Dans la fenêtre bascule du mode Acquisition, sous Taille de l’image, cliquez sur SR (nombre de pixels à super résolution limitée) pour maximiser les capacités du détecteur. Cela ajustera automatiquement la taille du cadre.
6. Gardez la moyenne à Aucun car ce n’est généralement pas nécessaire, ce qui réduira le temps d’analyse. Dans certains cas, une moyenne de 2x peut améliorer le rapport signal/bruit.
7. Collectez des données brutes avec des profondeurs de données de 8 bits. Cliquez sur Snap pour acquérir une image. Pour acquérir une pile z, suivez l’étape 6.3.
8. Effectuez le traitement de l’image comme décrit ci-dessous. Cela produira une image 16 bits.
   1. Une fois l’image ou la pile z obtenue, cliquez sur la méthode de traitement > et sélectionnez Traitement Airyscan.
   2. Effectuez un filtre automatique pour commencer et effectuez un traitement manuel ultérieur en modifiant la valeur SR pour obtenir les meilleurs résultats pour l’échantillon. Une fois la valeur SR optimale déterminée, cliquez sur Appliquer pour générer une image traitée. Dans le cas des images z-stack, traitez soit comme une tranche z (Image actuelle [2D]) soit comme l’ensemble de la pile z en cliquant sur la case Traitement 3D .

8. Traitement d’images et analyse de données (projection orthogonale, reconstruction 3D et profil d’intensité)

REMARQUE: Pour cette méthode, les étapes utilisées pour générer des projections orthogonales, des reconstructions 3D et des profils d’intensité sont décrites pour le logiciel Zen (voir Tableau des matériaux). Des analyses de données similaires peuvent également être effectuées avec le logiciel ImageJ⁵⁶.

1. Effectuer une projection orthogonale comme décrit ci-dessous (Figure 4).
   1. Une fois qu’une pile z a été obtenue à l’aide de la microscopie confocale ou super-résolution, générez une projection orthogonale pour visualiser les vésicules de l’axe Z de la cellule dans une vue 2D (par rapport à la reconstruction 3D). Pour ce faire, cliquez sur la méthode de traitement > et sélectionnez Projection orthogonale.
   2. Sous Paramètres, sélectionnez le plan de projection requis. Pour une projection de l’axe z (z-pile), sélectionnez le plan frontal (XY ). Sous Méthode, sélectionnez Maximum pour obtenir la projection de la plus haute qualité.
   3. Ensuite, déterminez l’épaisseur de la projection en sélectionnant la position de départ (tranche z de départ) et déterminez l’épaisseur (nombre total de tranches z) dans la projection. Il est idéal de sélectionner l’épaisseur égale à celle d’une cellule de l’axe z.
   4. Une fois les paramètres définis, cliquez sur Appliquer pour créer la projection de la pile z de manière XY plane.
      REMARQUE: Lors de la création de projections orthogonales de plusieurs piles z pour comparer la quantité d’un objet d’intérêt particulier, il est impératif de garder l’épaisseur de la projection la même (ou aussi proche que possible) pour la précision des données.
2. Effectuez la reconstruction 3D comme décrit ci-dessous (Figure 5).
   1. Créez des reconstructions 3D de piles z pour observer la localisation et la forme des structures. Faites-le pour les z-stacks acquis à l’aide d’approches confocales et de super-résolution. Traitez d’abord les piles z de super-résolution en utilisant le traitement 3D comme à l’étape 7.8 pour la reconstruction 3D.
   2. Pour générer une image 3D, cliquez sur l’icône 3D dans la fenêtre d’aperçu. Une fois cliqué, un onglet 3D apparaîtra dans la section de contrôle d’affichage dans la moitié inférieure de l’écran. Les vues 3D, telles que Transparence, Volume, Maximum, Surface et Mixte seront visibles. Utilisez les vues Surface ou Mixte lorsque vous visualisez la structure des vésicules (de préférence).
   3. Pour une image de la plus haute qualité, sélectionnez le paramètre Précis , car le réglage le plus rapide sera moins précis et entraînera un mauvais rendu 3D.
   4. Une fois l’image générée, manipulez-la en la faisant pivoter et en zoomant pour vous concentrer sur un emplacement préféré pour afficher les objets d’intérêt. Manipulez l’image 3D sous l’onglet Apparence .
   5. Une fois qu’une vue satisfaisante a été obtenue, sous l’onglet 3D, sélectionnez Résolution affichée, puis cliquez sur Créer une image. Cela créera un instantané de l’image dans la même orientation que celle visualisée et pourra être enregistré et exporté dans différents formats de fichiers.
3. Générez un profil d’intensité comme décrit ci-dessous (Figure 7).
   REMARQUE: Les profils de distribution et d’intensité des pixels associés aux différents signaux fluorescents peuvent être visualisés sous forme d’image superposée pour déterminer leur colocalisation.
   1. Une fois qu’une image optimale a été acquise via une imagerie confocale ou super-résolution, dans le panneau Affichage de la fenêtre Aperçu , cliquez sur Profil. Dans la fenêtre d’aperçu, un histogramme affichant le profil d’intensité en fonction de la distance apparaîtra, ainsi qu’un tableau indiquant les distances et les valeurs d’intensité.
   2. Dans la zone des contrôles d’affichage en bas de l’écran, cliquez sur l’outil Fléché dans l’onglet Définition de profil . Dessinez une flèche le long de la longueur de l’objet pour lequel le profil d’intensité des différents pixels doit être évalué. Pour dessiner la flèche, effectuez un zoom avant sur l’image.
   3. Le profil d’intensité apparaîtra à gauche de l’aperçu de l’image, où la distance et les pics correspondants le long du chemin de la flèche seront affichés. Pour supprimer l’histogramme affiché sur l’image elle-même, décochez la case Afficher le profil dans les graphiques .
   4. Dans l’onglet Dimensions de la zone de contrôle d’affichage, désélectionnez les couches qui ne doivent pas être incluses dans le profil d’intensité.
   5. Dans l’onglet Graphiques , double-cliquez sur Profil affiché sous la zone Annotations/Mesures pour ouvrir la fenêtre contextuelle Format des éléments graphiques . Utilisez-le pour modifier la couleur de la flèche ainsi que son style et son épaisseur de contour. Fermez la boîte après avoir sélectionné les paramètres souhaités.
   6. Cliquez sur l’onglet Affichage du profil . Dans la nouvelle section d’image, cliquez sur Affichage actuel , puis sur Enregistrer sous pour enregistrer le fichier. Il est recommandé d’enregistrer le fichier en tant que fichier .tif pour éviter la compression et la perte de données.

Résultats

Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour imager et caractériser efficacement et avec précision le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines BM dans les cellules épithéliales polarisées, telles que la FE de l’ovaire de la drosophile . Ensuite, nous fournissons les résultats anticipés obtenus à l’aide des méthodes décrites, ainsi que des conseils utiles et des pièges potentiels. Pour ce faire, Vkg-GFP, un Vkg marqué de manière endogène (Drosophila Col IV) es...

Discussion

Le BM est essentiel pour la morphogenèse embryonnaire et organique, et les fonctions physiologiques adultes. De plus, le BM agit comme une plate-forme de signalisation pour l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale et fournit aux tissus un support². Pourtant, les mécanismes qui régulent le bon placement des protéines BM sont mal compris. Une meilleure compréhension des voies biologiques dédiées au trafic intracellulaire et à la sécrétion polarisée des protéines BM...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing