La microscopie à extension de rétention d’étiquettes (LR-ExM) permet l’imagerie à super-résolution et le marquage à haute efficacité

Résumé

Un protocole de microscopie à expansion de rétention d’étiquettes (LR-ExM) est démontré. LR-ExM utilise un nouvel ensemble d’ancrages trifonctionnels, qui offre une meilleure efficacité d’étiquetage par rapport aux microscopies à expansion précédemment introduites.

Résumé

La microscopie à expansion (ExM) est une technique de préparation d’échantillons qui peut être combinée avec la plupart des méthodes de microscopie optique pour augmenter la résolution. Après avoir incorporé des cellules ou des tissus dans de l’hydrogel gonflable, les échantillons peuvent être physiquement dilatés de trois à seize fois (dimension linéaire) par rapport à la taille d’origine. Par conséquent, la résolution effective de tout microscope est augmentée par le facteur d’expansion. Une limitation majeure de l’ExM précédemment introduit est la fluorescence réduite après la polymérisation et la procédure de digestion. Pour surmonter cette limitation, la microscopie à expansion de rétention de marquage (LR-ExM) a été développée, qui empêche la perte de signal et améliore considérablement l’efficacité du marquage à l’aide d’un ensemble de nouveaux ancrages trifonctionnels. Cette technique permet d’atteindre une résolution plus élevée lors de l’étude de structures cellulaires ou subcellulaires à l’échelle nanométrique avec une perte minimale de signal fluorescent. LR-ExM peut être utilisé non seulement pour le marquage par immunofluorescence, mais aussi avec des marqueurs de protéines auto-étiquetés, tels que les marqueurs SNAP et CLIP, obtenant ainsi une efficacité de marquage plus élevée. Ce travail présente la procédure et le dépannage de cette approche basée sur l’immunomarquage, ainsi que la discussion des approches d’auto-marquage du LR-ExM comme alternative.

Introduction

La microscopie à expansion (ExM) est utilisée par les chercheurs depuis qu’elle a été introduite pour la première fois comme une approche pratique pour obtenir une imagerie à super résolution avec des microscopes conventionnels, tels que l’épifluorescence et les microscopes confocaux 1,2,3,4,5,6,7 . En utilisant ExM, il est possible d’atteindre une résolution latérale de ~ 70 nm même avec des microscopes confocaux réguliers. Lorsque l’ExM est combiné à l’imagerie à super-résolution, la résolution est encore améliorée. Par exemple, on peut atteindre une résolution d’environ 30 nm avec la microscopie à illumination structurée (SIM) et une résolution d’environ 4 nm avec la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM)^1,5.

Cependant, la faible efficacité de l’étiquetage est un problème critique avec les méthodes ExM standard. La perte de fluorescence peut varier en fonction du type de groupes fluorescents et du temps de digestion. En moyenne, cependant, il a été rapporté que plus de 50% des fluorophores sont perdus après les étapes de polymérisation et de digestion des protéines de l’ExM, ce qui nuit à la qualité de l’imagerie3,4.

Ainsi, la microscopie à expansion de rétention de marquage (LR-ExM) a été développée, qui peut retenir efficacement les étiquettes et réduire la perte de signal¹. L’innovation clé de LR-ExM est l’utilisation d’un ensemble d’ancrages trifonctionnels au lieu d’utiliser simplement des colorants fluorescents - comme dans la procédure ExM standard - pour colorer les protéines d’intérêt. Ces agents de liaison trifonctionnels se composent de trois parties : (1) le connecteur (p. ex., N-hydroxysuccinimide (NHS)) pour se connecter à l’anticorps, (2) l’ancrage (p. ex. méthacrylamide (MA)) pour ancrer les protéines au polymère, et (3) le rapporteur (p. ex. biotine ou digoxigénine (DIG)) pour se conjuguer à un colorant organique. Les ancrages trifonctionnels survivent aux étapes de polymérisation et de digestion des protéines, et empêchent ainsi la perte de fluorophore.

De plus, cette méthode présente un grand potentiel puisqu’elle est compatible avec les balises enzymatiques auto-étiquetantes telles que SNAP ou CLIP. Les approches de marquage enzymatique présentent certains avantages par rapport à l’approche d’immunomarquage en ce qui concerne la spécificité élevée et l’efficacité du marquage ^8,9,10.

Dans ce manuscrit, une procédure détaillée de LR-ExM est démontrée. LR-ExM est une méthode très efficace et flexible pour atteindre une résolution spatiale élevée avec une efficacité d’étiquetage améliorée.

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Protocole

1. Culture cellulaire

1. Utiliser des cellules U2OS cultivées dans le milieu 5A de McCoy supplémenté avec 10% FBS à 37 °C dans 5% CO₂.
2. Cellules de culture sur un verre chambré de 16 puits amovibles (surface de culture 0,4 cm²) pour faciliter la manipulation.

2. Fixation et perméabilisation

REMARQUE : Les conditions de fixation et de perméabilisation dépendent des protocoles d’immunomarquage optimisés. Ce qui suit est un protocole de fixation et de perméabilisation des microtubules co-immunocolorants et des fosses recouvertes de clathrine (CCP).

1. Une fois que le nombre de cellules atteint ~0,04 x 10 6, fixer les cellules contenant 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 3,2 % dans un tampon PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA et 1 mM MgCl₂, pH^6,9) pendant 10 minutes à température ambiante (tableau 1).
   REMARQUE: La fixation à l’aide de PFA est effectuée dans une hotte de sécurité certifiée.
2. Lavez les cellules trois fois pendant 5 minutes chacune avec 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Perméabiliser les cellules avec le tampon de perméabilisation de 100 μL à température ambiante pendant 15 minutes (tableau 1).
   REMARQUE: Procéder au marquage dès que possible pour éviter la dégradation de la protéine cible, de l’ARN ou de l’ADN, et pour obtenir un résultat optimal. Si nécessaire, cependant, les échantillons fixes peuvent être stockés pendant une période prolongée (jusqu’à un mois) dans un tampon PBS à 4 °C. Remplacez tout PBS évaporé et protégez l’échantillon du photoblanchiment.

3. Blocage endogène de la streptavidine et de la biotine

1. Incuber les cellules avec la solution de streptavidine diluée dans un tampon de blocage cellulaire (100 μL) pendant 15 minutes à température ambiante (tableau 1).
2. Rincer brièvement avec 200 μL de tampon de blocage cellulaire.
3. Incuber les cellules avec 100 μL de solution de biotine diluée dans un tampon de blocage cellulaire pendant 15 minutes à température ambiante.
   REMARQUE : lorsque vous utilisez une approche d’auto-balisage, telle que l’utilisation de balises SNAP ou CLIP-, ignorez l’étape 4 et passez à l’étape 5.1 : approche d’auto-étiquetage.

4. Coloration primaire des anticorps

1. Incuber des cellules avec un anticorps anti-α-tubuline chez le rat (dilution de 1:500) et un anticorps anti-clathrine à chaîne lourde de lapin (dilution de 1:100) dans 100 μL de tampon de blocage cellulaire pendant 16 h à 4 °C ou 1 h à température ambiante. Doublez le temps d’incubation des échantillons de tissus.
2. Lavez les échantillons quatre fois avec 200 μL de PBS pendant 5 minutes chacun.

5. Coloration des anticorps secondaires spécifiques LR-ExM

1. Conjuguer les anticorps IgG avec les agents de liaison trifonctionnels tels que le N-hydroxysuccinimide (NHS) - méthacrylamide (MA)-biotine ou le NHS-MA-digoxigénine (Dig) (Figure 1B). La synthèse des ancrages trifonctionnels et la conjugaison des anticorps secondaires sont précédemment introduites chez Shi et ^al.1. Approche d’automarquage : conjuguer les anticorps IgG avec les agents de liaison trifonctionnels, tels que MA-benzylguanine (BG)-Biotine ou MA- benzylcytosine (BC)-Dig (Figure 1B). La synthèse d’ancrages trifonctionnels et une conjugaison des anticorps secondaires sont précédemment introduites chez Shi et ^al.1.
2. Incuber des cellules avec les anticorps secondaires anti-lapin-Dig-MA (dilution 1:100) et anti-rat-biotine-MA (dilution 1:100) dans 100 μL de tampon de blocage cellulaire pendant 1 h à température ambiante. Doublez ce temps d’incubation pour les échantillons de tissus.
3. Lavez les échantillons quatre fois dans 200 μL de PBS pendant 5 minutes chacun.

6. Ancrage supplémentaire

1. Incuber des cellules avec 0,25% de glutaraldéhyde (GA) dans du PBS (100 μL) pendant 15 min à température ambiante afin d’ancrer les protéines sur l’hydrogel. Vous pouvez également utiliser un ester de N-hydroxysuccinimide de 25 mM d’acide méthacrylique (MA-NHS) pour l’ancrage. Une incubation d’une heure à température ambiante est encouragée.
2. Lavez les échantillons trois fois dans du PBS pendant 5 minutes chacun.

7. Gélification

NOTE: La vitesse d’expansion est déterminée par le temps de diffusion du sel et de l’eau vers ou dans le gel; Ainsi, la coulée de gels minces accélère le temps d’expansion.

1. Retirez la structure supérieure de la plaque de gel à 16 puits. Ajouter 40 μL de solution monomère à chaque puits pour conditionner les cellules sur la glace. Incuber sur la glace pendant 5 min.
   1. Pour préparer une solution de monomère, voir le tableau 2.
2. Préparer la solution de gélification sur glace. Ajouter de l’eau distillée double et un accélérateur de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) à 10 % de N, N, N′ (TEMED) (10 % MED : solution de monomère = 1:47); n’ajoutez pas encore l’initiateur (Tableau 3).
3. Pour une chambre de culture cellulaire d’une surface de 0,4 cm², utilisez un volume de solution de gélification d’environ 40 μL. Préparer 45 μL de solution de gélification pour chaque puits.
4. Ajouter 10% de persulfate d’ammonium (APS) à la solution de gélification, incuber sur de la glace et pipeter immédiatement 40 μL de solution de gélification dans chaque joint en silicone bien sur de la glace. Incuber sur la glace pendant 3 min (10 % APS:10 % TEMED:solution monomère = 1:1:47).
5. Protéger l’échantillon de la lumière et déplacer le verre de couverture de la boîte de Petri de 10 cm dans un incubateur à 37 °C pendant 1,5 h pour la gélification. Pour maintenir l’humidité du gel pendant l’incubation à 37 °C, couvrez la boîte de Petri avec le couvercle et mettez quelques gouttes d’eau dans la boîte de Pétri.

8. Digestion

1. Après la gélification, retirez le verre pour séparer le gel et transférez le gel sur une plaque à 6 puits. Digérer les cellules incorporées avec 2 mL de tampon de digestion (tableau 1) pendant une nuit à température ambiante ou 4 h à 37 °C. Utilisez au moins 10 fois l’excès de volume de tampon de digestion.
2. Lavez les gels avec au moins 10 fois plus d’eau que le volume final du gel. Répétez l’étape de lavage quatre fois pendant 20 à 30 minutes à chaque fois. Le gel se dilate d’environ deux fois dans chaque dimension.
   REMARQUE: Les échantillons de gel peuvent être conservés jusqu’à 1 mois dans un tampon PBS à 4 ° C. Remplacez toute eau évaporée pour éviter le dessèchement et protégez l’échantillon de la lumière pendant le stockage. Pour éviter la dégradation des ancrages trifonctionnels, les échantillons doivent être colorés dès que possible après la digestion et le lavage.

9. Coloration par fluorescence post-digestion

1. Incuber des gels dans un volume de 2 mL de tampon de coloration streptavidine (STV)/digoxigénine (DIG) avec un colorant STV de 2 à 5 μM et/ou un colorant anti-DIG pendant 24 h à température ambiante. Conservez les échantillons dans l’obscurité.

10. Expansion

1. Lavez et étendez le gel quatre fois avec de l’eau excessive (2-3 mL) pendant 30 min à 1 h à chaque fois.
2. Pour faciliter la visualisation des cellules sous microscopie fluorescente, colorez les cellules avec DAPI pendant le troisième des cinq lavages. Diluer la concentration du stock de DAPI (5 mg/mL, stocké à 4 °C) dans des dilutions 1:5 000 dans de l’eau de lavage. Incuber le gel avec une solution DAPI-eau (2 mL) pendant 30 min à 1 h.
3. Lavez deux fois de plus avec 3 ml d’eau.
4. Étendre les gels dans n’importe quel plat assez grand pour contenir les échantillons. Les gels expansés qui sont préparés sur un verre de couverture de 0,4 cm² s’adaptent bien dans une plaque de fond de verre à 6 puits.
   REMARQUE: Les échantillons colorés après expansion peuvent être conservés jusqu’à 4 mois dans un tampon PBS à 4 ° C. Ajouter suffisamment d’eau pour éviter le séchage et protéger l’échantillon du photoblanchiment. Répétez l’étape d’expansion et de coloration DAPI avant l’imagerie. Pour éviter tout risque de dégradation fluorophore, les échantillons doivent être imagés dès que possible.

11. Imagerie

1. Enduisez la chambre d’imagerie à fond de verre à 6 puits de poly-L-lysine à 0,01 % (3 mL chacune) pour immobiliser les échantillons de gel.
2. Transférer les échantillons de gel dans la chambre d’imagerie revêtue.
3. Imagez les échantillons avec toutes les portées de fluorescence souhaitées.

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Résultats

Les fosses recouvertes de clathrine (CCP) sont immunocolorées à l’aide d’ancrages trifonctionnels (figure 1B) et le LR-ExM est effectué comme décrit à la figure 1A. LR-ExM (Figure 2C,E) montre une intensité de fluorescence beaucoup plus élevée que la microscopie d’expansion de rétention de protéines (proExM, Figure 2A) ou la biotine-ExM (Figure 2B);<...

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Discussion

L’innovation clé de LR-ExM est d’utiliser des ancrages trifonctionnels pour marquer efficacement les protéines cibles et améliorer la qualité de l’image. Cette méthode est limitée par des ancrages trifonctionnels, qui ne sont pas si facilement accessibles aux chercheurs. Cependant, les ancrages trifonctionnels peuvent être partagés avec d’autres chercheurs sur demande, et des produits similaires tels que les sondes ExM de Chrometa sont maintenant disponibles dans le commerce.

D...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide	Sigma	A9099	ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 711–005-152	Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch	H+L, 712–005-153	Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-540-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 594 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-580-084	Fluorescent probes
Alexa Fluor 647 Streptavidin	Jackson ImmunoResearch	016-600-084	Fluorescent probes
Ammonium Persulfate	Sigma	A3678	ExM Gel
anti-H3K4me3	Abcam	ab8580	Antibody
anti-H3K9me3	Abcam	ab176916	Antibody
DAPI dilacetate	Thermofisher Scientific	D3571	Fluorescent probes
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7488	Fluorescent probes
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG)	Vector Laboratories	DI-7594	Fluorescent probes
EGTA	EMD Millipore Corp.	324626-25GM	Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	EDTA	Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade	Electron Microscopy Sciences	50-262-13	Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass	Grace Bio-Labs	GBL112358-8EA	Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool	Grace Bio-Labs	GBL103259	Removal tool
Guanidine HCl	Sigma	G3272	Digestion buffer
Magnesium chloride	Sigma	M8266-1KG	Fixation buffer
McCoy's 5a	ATCC	30–2007	Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS)	Sigma	730300-1G	Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody	Abcam	ab24700	Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide	Sigma	M7279	ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024	ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Fixation buffer
PIPES	Sigma	P6757-25G	Fixation buffer
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920-100ML	Chamber coating
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850-5ML	Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody	Abcam	ab21679	Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2	Millipore Sigma	MAB1864-I	Antibody
Sodium Acrylate	Sigma	408220	ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2002	Blocking buffer
Tris-HCl	Life Technologies	AM9855	Digestion buffer
U2OS	ATCC	HTB-96	Cell line
6 well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Imaging plate