Visualisation du développement des cicatrices à l’aide du test SCAD - Un test de cicatrisation cutanée ex situ

Résumé

Ce protocole décrit la génération d’une explantation de fascia de peau appelée « tissu semblable à un SCar dans un plat » ou SCAD. Ce modèle permet une visualisation sans précédent de fibroblastes uniques lors de la formation de cicatrices.

Résumé

La réponse globale des mammifères à l’étanchéité des plaies des tissus profonds se fait par la formation de cicatrices et la contraction des tissus, médiées par des fibroblastes de fascia spécialisés. Malgré l’importance clinique de la formation de cicatrices et de la cicatrisation altérée des plaies, notre compréhension de la dynamique des fibroblastes du fascia dans la cicatrisation des plaies est superficielle en raison du manque de tests pertinents permettant une visualisation directe de la chorégraphie et de la dynamique des fibroblastes dans des environnements complexes tels que les plaies cutanées. Cet article présente un protocole pour générer des cicatrices cutanées ex situ à l’aide de SCAD ou « SCar-like tissue in A Dish » qui émulent l’environnement complexe des plaies cutanées. Dans ce test, une peau pleine épaisseur de 2 mm est excisée et cultivée à l’envers dans un milieu pendant 5 jours, au cours desquels les cicatrices et les contractures cutanées se développent uniformément. Cette méthodologie, associée à des modèles murins transgéniques spécifiques à la lignée des fibroblastes, permet de visualiser les lignées de fibroblastes individuelles tout au long du processus de réparation des plaies. Dans l’ensemble, ce protocole aide les chercheurs à comprendre les processus fondamentaux et les mécanismes de réparation des plaies, en explorant directement les effets des modulateurs sur les résultats de la cicatrisation des plaies.

Introduction

La cicatrisation des plaies est un processus de restauration des plaies brisées. Les lésions tissulaires chez les invertébrés entraînent une régénération partielle ou complète. En revanche, les mammifères réagissent aux blessures profondes par la cicatrisation, un processus conçu pour sceller rapidement les plaies avec des bouchons denses de fibres matricielles qui minimisent la zone percée et déforment en même temps de manière permanente le site blessé ^1,2,3. Les grandes brûlures cutanées ou les plaies profondes chez les mammifères entraînent des phénotypes pathologiques tels que des cicatrices hypertrophiques ou chéloïdes ^4,5. Ces cicatrices exubérantes causent un fardeau énorme sur les systèmes de santé cliniques et mondiaux. Rien qu’aux États-Unis, la gestion des cicatrices coûte environ 10 milliards de dollars par an ^6,7. Par conséquent, le développement de méthodologies pertinentes est nécessaire pour mieux comprendre les processus et mécanismes fondamentaux impliqués dans la formation des cicatrices.

Au cours des dernières années, un large éventail d’études chez la souris a révélé des populations hétérogènes de fibroblastes avec des puissances fonctionnelles distinctes en fonction de leurs origines dans certains emplacements de la peau ^8,9,10. Dans la peau du dos, Rinkevich et al., 2015, ont identifié qu’une population spécifique de fibroblastes avec une expression embryonnaire précoce d’Engrailed-1 (En1), appelée EPF (Fibroblaste positif engrailed) contribue à la cicatrisation cutanée lors de la blessure. Inversement, une autre lignée de fibroblastes sans antécédents d’expression engrailed, engrailed negative fibroblast (ENF), ne contribue pas à la formation de^{cicatrices 8}. La cartographie du destin de ces lignées En1 à l’aide de lignées de souris transgéniques à cre croisées avec des lignées de souris rapporteures de fluorescence telles que R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) permet de visualiser les populations EPF et ENF.

L’étude de la migration des fibroblastes in vivo sur plusieurs jours est limitée par des contraintes éthiques et techniques. En outre, les criblages de bibliothèque d’anticorps composés, viraux et neutralisants pour moduler les voies impliquées dans la cicatrisation sont techniquement difficiles. Les modèles in vitro ou ex vivo précédemment utilisés n’ont pas la capacité de visualiser la migration des fibroblastes et la formation de cicatrices dans des microenvironnements cutanés authentiques, l’uniformité dans le développement des cicatrices, ainsi que la complexité tissulaire qui émule les environnements cutanés in vivo ^11,12. Pour surmonter les limites ci-dessus, nous avons développé un test de cicatrisation ex vivo appelé SCAD (SCar-like tissue in A Dish)^13,14. Ce test simple peut être effectué en excisant une peau pleine épaisseur de 2 mm contenant l’épiderme, le derme et les régions sous-cutanées du fascia et en les cultivant dans un milieu de DMSO supplémenté en sérum pendant 5 jours. Les cicatrices générées par SCAD reproduisent de manière fiable les caractéristiques transcriptomiques et protéomiques des cicatrices in vivo. De plus, les SCAD générés à partir de lignées de souris transgéniques pertinentes (par exemple, des souris En1) croisées avec des lignées de souris rapporteures fluorescentes permettent de visualiser la dynamique de migration des fibroblastes et le développement de cicatrices à une résolution sans précédent. De plus, ce modèle peut être facilement adapté à toutes les applications à haut débit (p. ex., bibliothèque de composés, bibliothèque d’anticorps ou dépistage viral)^13,14. Dans cet article, nous décrivons un protocole optimisé pour générer des SCAD et des applications de traitement en aval ultérieures pour étudier la dynamique cellulaire et matricielle dans le développement des cicatrices.

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Protocole

Le modèle présenté ci-dessous fournit une description détaillée étape par étape de la génération du test SCAD, comme décrit brièvement dans Jiang et al., 2020¹³. Les préparations d’échantillons SCAD ont été effectuées après avoir sacrifié les animaux conformément aux directives internationales et gouvernementales de Haute-Bavière. Les animaux étaient hébergés dans les animaleries du Centre Helmholtz de Munich. Les pièces ont été entretenues avec une humidité optimale et une température constante avec un cycle de lumière de 12 h. Les animaux ont reçu de la nourriture et de l’eau ad libitum.

1. Préparation des tissus SCAD

1. Sacrifiez les nouveau-nés le jour postnatal 0 ou le jour 1 (P0 ou P1).
2. Retirez soigneusement la peau dorsale pleine épaisseur d’au moins 1,5 cm x 1,5 cm jusqu’à la couche musculaire squelettique à l’aide d’un scalpel chirurgical stérile.
3. Pelez la peau à l’aide de pinces incurvées stériles, en veillant à ce que le fascia superficiel soit intact avec le muscle panniculus carnosus sous-jacent.
4. Lavez le tissu excisé avec 50 à 100 mL de milieuX DMEM/F-12 froids pour éliminer le sang contaminant.
5. Laver une fois avec la solution saline équilibrée (HBSS) de Hanks pour maintenir la viabilité des tissus et des cellules.
6. Placez la peau à l’envers (fascia superficiel sur le dessus) dans une boîte de Petri de 10 cm contenant du milieu DMEM/F12.
7. À l’aide d’un poinçon de biopsie jetable de 2 mm, éliminez les morceaux de peau ronds de pleine épaisseur, en veillant à ce que le fascia superficiel soit intact avec le muscle panniculus carnosus sous-jacent jusqu’à l’épiderme pour générer des tissus SCAD.
8. Préparer et remplir 200 μL de milieux DMEM/F12 (sans rouge phénol) de milieux complets DMEM/F12 complétés par 10 % de FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM d’acides aminés non essentiels et 1x pénicilline/streptomycine dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits.
9. À l’aide de pinces stériles, transférez soigneusement et immergez complètement le tissu SCAD individuel à l’envers (fascia orienté vers le haut) vers les puits d’une plaque de 96 puits.
10. Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire maintenu dans des conditions standard (37 °C, 21 % (v/v) d’oxygène, 5 % (v/v) de C0₂ et 95 % d’humidité).

2. SCAD - Culture tissulaire

1. Cultivez des SCAD dans un incubateur jusqu’à 5 jours.
2. Aux jours 2 et 4 de la culture, remplacez le milieu par 200 μl de milieux complets DMEM/F12 fraîchement préchauffés pour assurer la viabilité continue des cellules et des tissus. Remplacer les composés de traitement lors de chaque changement de milieu.
   REMARQUE : Assurez-vous de laisser 10 μL de milieu dans le puits pour éviter que les tissus ne collent aux puits.
3. Préparer les SCAD pour les expériences suivantes : Imagerie en direct (section 3) et Prélèvement de tissus et coloration par immunofluorescence 2D/3D (section 4).

3. Imagerie en direct des SCAD

1. Préparer un minimum de 30 mL de solution d’agarose à faible fusion de 2 % à 3 % (p/v) dans du PBS dans une bouteille en verre en la chauffant au micro-ondes jusqu’à ébullition.
2. Transférer immédiatement la bouteille et refroidir la solution d’agarose liquide dans un bain-marie à 40 °C.
3. Transférer le tissu SCAD avec le fascia / cicatrice vers le haut sur le centre d’un plat de 35 mm.
4. Intégrer le SCAD à température ambiante (RT) en transférant lentement de l’agarose liquide à 40 °C sur le plat de 35 mm à l’aide d’une pipette Pasteur. L’agarose polymérise en 2 min.
5. Ajouter 2 mL de milieu complet DMEM/F12 préchauffé (sans indicateur de rouge phénol).
6. Acquérir des images time-lapse de SCADs jour 0 jusqu’à 48 h à l’aide d’un microscope confocal ou multiphotonique équipé d’un système d’incubation approprié réglé à 37 °C, 21% (v / v) d’oxygène, 5% (v / v) C0₂ et 95% d’humidité.

4. Prélèvement de tissus et coloration par immunofluorescence 2D/3D

1. Lavez les mouchoirs aux moments pertinents en remplaçant le milieu par du PBS stérile.
2. À l’aide de pinces stériles, transférer soigneusement les SCAD individuels dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 500 μL de paraformaldéhyde à 2 % pour fixer les tissus pendant la nuit à 4 °C.
3. Lavez les tissus trois fois avec du PBS et procédez à la coloration par immunofluorescence 2D/3D.
4. Coloration par immunofluorescence 3D
   1. Perméabiliser les tissus en incubant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 500 μL de PBS complété par 0,2% de gélatine, 0,5% de Triton-X100 et 0,01% de Thimérosal (PBSGT) à RT pendant 24 h.
   2. Préparer une quantité adéquate d’anticorps primaires conformément aux instructions du fabricant et incuber les tissus SCAD dans 150 μL de solution pbSGT pendant 24 h à TA.
      REMARQUE : Si la concentration optimale d’anticorps pour la fluorescence immunitaire n’est pas déclarée par le fabricant, le titrage préalable des anticorps doit être effectué sur les tissus témoins en utilisant des concentrations variables (p. ex., 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   3. Lavez doucement les SCAD trois fois avec pbS pour éliminer l’anticorps primaire non lié.
   4. Incuber du tissu avec 1:1000 anticorps secondaires Alexa Fluor pertinents dans le PBS pendant la nuit à RT.
   5. Lavez doucement le tissu pendant 30 minutes dans le PBS trois fois pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires non liés.
   6. Transférez le tissu sur une parabole à fond de verre de 35 mm pour l’imagerie confocale ou multiphotonique.
      REMARQUE: Lors de l’utilisation d’objectifs d’immersion dans l’eau, incorporez les SCAD dans de l’agarose à faible point de fusion à 2 % pour immobiliser le tissu afin d’éviter la dérive lors de l’acquisition de l’image.
5. Coloration par immunofluorescence 2D
   1. Transférez le tissu dans un cryo-moule et remplissez-le doucement avec un composé à température de coupe optimale (OCT) pour immerger complètement le tissu.
   2. Ajustez doucement l’orientation du tissu, en assurant l’absence de bulles d’air pour obtenir une section transversale ou une section verticale.
   3. Placez le moule sur de la glace carbonique pendant 20 à 30 minutes et incubez le bloc à -80 °C pendant la nuit.
   4. Réglez la température de la lame sur -25 °C et la température du bloc de l’échantillon sur -17 °C. Préparer une cryo-section de 6 μm à l’aide d’un cryostat, transférer les sections sur une lame d’adhérence et stocker les lames dans un congélateur à -20 °C.
   5. Rincer les lames trois fois dans du PBS et incuber les lames dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % p/v dans du PBST (PBS complété par 0,05 % d’interpolation) pendant 1 h.
   6. Ajouter une quantité appropriée d’anticorps primaire à 150μl de PGST et incuber pendant la nuit à 4 °C
      REMARQUE : Si la concentration optimale d’anticorps pour la fluorescence immunitaire n’est pas déclarée par le fabricant, le titrage préalable des anticorps doit être effectué sur les sections témoins en utilisant des concentrations variables (p. ex., 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   7. Lavez doucement les sections trois fois avec pbS pour éliminer l’anticorps primaire non lié.
   8. Incuber du tissu avec 1:1000 anticorps secondaires Alexa Fluor pertinents dans le PBS pendant la nuit à RT pendant 2 h.
   9. Lavez doucement le tissu pendant 5 min dans le PBS trois fois pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires non liés.
   10. Montez les diapositives avec un support de montage contenant du DAPI et séchez les diapositives dans l’obscurité à RT.
   11. Imagez les sections à l’aide d’un microscope à fluorescence.

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Résultats

La génération de SCAD peut être séparée en trois étapes essentielles: la récolte de la peau de souris P0-P1, la génération de poinçons de biopsie de pleine épaisseur et la culture ultérieure de scads individuels jusqu’à 5 jours dans des plaques de 96 puits. En tant que lecture, ce test peut en outre être appliqué pour analyser les aspects spatiaux et temporels de la cicatrisation. L’analyse spatiale utilise le marquage immunitaire 2D et 3D des tissus pour étudier la localisation spatiale des composant...

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Discussion

Plusieurs modèles ont déjà été développés pour comprendre la formation de cicatrices après une blessure. Bien que de nombreux progrès aient été réalisés à cet égard, les mécanismes réels ne sont toujours pas clairs. Contrairement à la technique précédente, le modèle SCAD intègre tous les types de cellules et les couches cutanées, maintenant ainsi la complexité de la peau native^18,19. Cette méthodologie est capable de générer des ensembl...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss